敗醬草中黃酮的提取及其抗氧化活性研究

敗醬草中黃酮的提取及其抗氧化活性研究

失敗的草，又名澤珍和苦菜，屬于晚熟植物科。它是我國常用中藥,具有清熱解毒之功效。野生敗醬草廣泛存在于自然界。研究表明,敗醬草含有較高的黃酮、皂苷等活性物質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價值,在我國的許多地方被作為野生蔬菜食用,由此可見敗醬草不僅是一種安全性較高的中藥材而且還是一種較好的天然抗氧化劑。目前,國內(nèi)對銀杏黃酮、紫蘇黃酮、藍莓黃酮、桑葉黃酮等的研究報道較多,對敗醬草黃酮類化合物的研究較少。本實驗就敗醬草黃酮的提取和抗氧化性進行初步的試驗研究,旨在通過幾個體外實驗體系研究敗醬草中黃酮類化合物的抗氧化活性,以期提高敗醬草的附加值,為使敗醬草黃酮類化合物作為天然抗氧化劑和功能性食品的開發(fā)利用提供一定參考。1材料和方法1.1產(chǎn)品分析純敗醬草購自當?shù)厮幍?經(jīng)陰干、粉碎后備用。蘆丁標準品、抗壞血酸、氯化亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、三氯甲烷、冰乙酸、Na2S2O3·5H2O、N-1-苯基乙二胺鹽酸鹽、對氨基苯磺酸等均為國產(chǎn)分析純。1.2實驗儀器及儀器UV-4802S雙光束紫外-可見分光光度計上海優(yōu)浦科學儀器有限公司;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵北京華旦儀器科技發(fā)展有限公司;SXT06型索氏提取儀上海洪紀儀器設備有限公司;雙列四孔水浴鍋蘇州威爾實驗用品有限公司。1.3方法1.3.1硝酸鹽分光光度法精密吸取0、2、4、6、8、10mL蘆丁標準溶液至于25mL容量瓶中,加30%乙醇溶液至10mL,加入5%亞硝酸鈉溶液0.7mL,搖勻,靜置5min,再加入5%硝酸鋁溶液0.7mL,搖勻,靜置5min,加入1mol/mL氫氧化鈉溶液5.0mL,最后用30%乙醇溶液定容到刻度線,搖勻,靜置5min后,在波長510nm處測定吸光度。1.3.2敗醬草提取工藝的正交試驗在單因素試驗基礎上,確定以提取時間、提取溫度、料液比、乙醇體積分數(shù)為試驗因素,選用L9(34)正交設計表進行試驗,優(yōu)化敗醬草中黃酮類物質(zhì)的提取工藝。正交試驗因素水平見表1。1.3.3黑加侖提取物的制備稱取敗醬草粉末5g,加20倍體積60%乙醇溶液,于70℃恒溫水浴中加熱,時間為2h。提取物經(jīng)抽濾后定容在100mL容量瓶中。1.3.4硝酸鹽分光光度法采用NaNO2-Al(NO3)3比色法。準確吸取0.5mL提取物,加入25mL容量瓶中,加入5%亞硝酸鈉溶液0.7mL,搖勻,靜置5min,再加入5%硝酸鋁溶液0.7mL,搖勻,靜置5min,加入1mol/L氫氧化鈉溶液5.0mL,最后用30%乙醇溶液定容到刻度線,搖勻,靜置5min后,在波長510nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算提取物總黃酮的含量。1.3.5抗壞血酸活性的測定往10mL試管中依次加入2mmol/LFeCl2、2mmol/LH2O2、6mmol/L水楊酸各1mL,搖勻,于37℃水浴中反應15min,于波長510nm處測定吸光度(A0),再加入0.2mL不同質(zhì)量濃度的樣品提取物,加水至10mL,搖勻,靜置10min,于波長510nm處測定吸光度(A1),同時用等質(zhì)量濃度的抗壞血酸代替樣品作陽性對照,并計算抑制率(d1)。1.3.6抗氧化活性的測定取0.05mol/LTris-HCl緩沖溶液(pH8.2)4.5mL,置于25℃水浴中預熱20min,分別加入0.1mL試樣和0.4mL2.5mmol/L鄰苯三酚溶液,混勻后于25℃水浴中反應4min,加入8mol/LHCl溶液兩滴終止反應,于波長299nm處測定吸光度,空白對照組以相同體積的蒸餾水代替樣品。同時用等質(zhì)量濃度的抗壞血酸代替樣品作陽性對照,并計算抑制率(d2)。式中:A背景為每管樣品同時做一個背景對照,按樣品管同時加入相同量的樣品、緩沖液、鄰苯三酚用蒸餾水代替。1.3.7清除亞硝酸鹽d取3支10mL比色管a、b、c,準確吸取2mL5μg/mLNaNO2溶液兩份,分別加入a、c管中,吸取一定量黃酮提取物,分別加入a、b管中,反應10min后,a、b、c管中分別加入0.4%對氨基苯磺酸溶液2.0mL,搖勻,靜置5min,再都加入0.2%鹽酸萘乙二胺1mL,搖勻,靜置15min后于波長538nm處測得吸光度,同時用等質(zhì)量濃度的抗壞血酸代替樣品作為陽性對照。以b管為參比測得a管的吸光度,以水為參比測得c管的吸光度,并計算清除率(d3)。式中:A0為未加提取物亞硝酸鈉的吸光度;A為加提取物后亞硝酸鈉的吸光度。1.3.8硫酸鈉標準溶液的消耗將黃酮提取物分別按豬油質(zhì)量的0%、1%、2%、4%、8%混入豬油中,充分攪拌均勻,將已添加抗氧化物的豬油置于干燥箱中,60℃條件下加速氧化,每隔一定時間測其POV值。式中:V1為樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積/mL;V0為空白實劑消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積/mL;C為硫代硫酸鈉標準溶液的濃度/(mol/L);m為試樣的質(zhì)量/g。測定步驟:精確稱取3.00g混勻樣品,置于250mL碘瓶中,加入30mL三氯甲烷-冰乙酸混合液,使樣品完全溶解,再加入1.00mL飽和碘化鉀溶液,緊密塞好瓶蓋,并輕輕振搖30s,然后于暗處放置3min,取出時加100mL雙蒸水搖勻,立即用硫代硫酸鈉標準溶液(0.01mol/L)滴定,至淡黃色時,加1mL淀粉指示劑,繼續(xù)滴定至藍色消失為終點。取相同量三氯甲烷-冰乙酸溶液、碘化鉀溶液、水,按同一方法,做試劑空白試驗。1.3.9采用生草素提取物對油鹽的過氧化方法同1.3.8節(jié)。2結果與分析2.1標準的甘蔗曲線吸取蘆丁標準溶液進行標準曲線繪制,得蘆丁標準曲線:A=10.143C+0.0056,R2=0.9992。2.2別為a、c、d由表2可知,各因素對黃酮類物質(zhì)提取的影響由大到小分別為A>C>B>D。根據(jù)正交試驗初步確定敗醬草中黃酮類物質(zhì)最佳提取工藝條件為A2B1C2D3,即時間2h、溫度70℃、料液比1:20、乙醇體積分數(shù)60%。2.3敗醬草黃酮含量測定應用正交試驗得到的最佳提取條件提取敗醬草嫩葉中的黃酮,通過NaNO2-Al(NO3)3比色法測定其含量,根據(jù)回歸方程:A=10.143C+0.0056計算,得到敗醬草黃酮的含量為1.78%。2.4抗逆效應試驗2.4.1清除羥自由基的活性由圖1可見,敗醬草提取物對羥自由基有較強的清除作用。在相同質(zhì)量濃度條件下,敗醬草提取物與VC相比,具有更強的清除羥自由基的活性。在0.002~0.010mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著敗醬草黃酮質(zhì)量濃度的增加對羥自由基的清除作用加強,在質(zhì)量濃度0.002~0.006mg/mL范圍內(nèi)清除率的曲線較為平緩,當質(zhì)量濃度大于0.006mg/mL時,清除效果明顯增強。當質(zhì)量濃度為0.010mg/mL時,清除率可達81.20%。2.4.2黃酮對鄰苯三酚自氧化速率的清除效果由圖2可以看出,不同質(zhì)量濃度的敗醬草提取物對O-2·都有一定的清除效果。與清除羥自由基的作用相似,隨著黃酮質(zhì)量濃度的升高,對鄰苯三酚自氧化速率的抑制作用越明顯,并且優(yōu)于陽性對照組。當添加質(zhì)量濃度為0.010mg/mL時,清除率高達93%。2.4.3敗醬草黃酮類化合物質(zhì)量濃度對亞硝酸鹽清除率的影響由圖3可知,敗醬草黃酮類化合物對亞硝酸鹽具有較高的清除率,隨著敗醬草黃酮類化合物質(zhì)量濃度的增大,對亞硝酸鹽的清除作用增強,量效關系明顯。在同等條件下敗醬草黃酮類化合物對亞硝酸鹽的清除率明顯優(yōu)于VC。2.4.4敗醬草黃酮提取物對豬肉的抗氧化作用通過圖4可知,在豬油中添加敗醬草黃酮提取物后,所有試驗組的POV值均低于空白對照組,而且空白對照組的過氧化值增加明顯,而添加了提取物后其過氧化值增加較緩,這說明敗醬草黃酮提取物對豬油具有抗氧化作用。其抗氧化作用隨添加提取物質(zhì)量分數(shù)的增加而增強。2.4.5添加總黃酮提取物對過氧化值的影響由圖5可知,在本實驗設定的時間范圍內(nèi),同一油樣放置的時間越長,所生成的過氧化物越多,POV值就越大;未添加任何抗氧化劑(黃酮提取物)的空白對照組在0~6d內(nèi),過氧化值變化幅度較小,在第6~9天,過氧化值顯著增加,而添加了提取物后,其過氧化值增加較少,在相同時間內(nèi),實驗組的過氧化值均低于空白對照組。因此,說明敗醬草黃酮類化合物對高溫引起的油脂過氧化具有很好的抑制作用,且隨添加量的增加而增強。3敗醬草總黃酮清除羥自由基的活性本實驗確定敗醬草中總黃酮的最佳提取工藝條件:提取時間2h、提取溫度70℃、料液比1:20(g/mL)、乙醇體積分數(shù)60%。本實驗分別就敗醬草提取物對羥自由基、超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽的清除率及對油脂的抗氧化性進行了測定,并與VC進行對比,得到如下結論:敗醬草中總黃酮能夠顯著清除體系中已產(chǎn)生的羥自由基和超氧陰離子自由基及抑制其再產(chǎn)生。在一定范圍內(nèi),清除效果隨添加質(zhì)量濃度的升高而加強,當添加質(zhì)量濃度為0.010mg/mL時,對羥自由基的清除作用最大可達81.20%,對超氧陰離子自由基的清除作用可達93.00%,對亞硝酸鹽的清除作用達到49.5