敗醬草多糖的分離鑒定及其對呼吸道合胞病毒體外抑制作用研究

敗醬草多糖的分離鑒定及其對呼吸道合胞病毒體外抑制作用研究

呼吸道感染（gsv）是世界上影響嬰兒呼吸的重要病原體，也是老年人死亡率增加的主要原因。目前尚無安全有效的疫苗。而唯一被美國食品及藥物管理委員會批準(zhǔn)治療RSV感染的抗病毒藥物——利巴韋林(ribavirin)在殺滅病毒的同時(shí),對宿主細(xì)胞也有一定的毒性作用。因此,開發(fā)研制藥效可靠、毒副作用小的抗病毒藥物對RSV感染的防治有十分重要的意義?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,許多中草藥及其多種成分都有很好的抗病毒作用,正日益成為抗病毒新藥研究的熱點(diǎn)。敗醬草(Herbapatriniae)為敗醬科多年生草本植物白花敗醬、黃花敗醬或其近緣植物的帶根全草,具有清熱解毒、祛瘀排膿、活血化瘀、寧心安神之功效。筆者用抗病毒作用為導(dǎo)向的化學(xué)分離方法從敗醬草中提取分離到其抗病毒有效部位AP4,對其組成成分進(jìn)行分析,并用體外實(shí)驗(yàn)的方法驗(yàn)證其抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用,現(xiàn)報(bào)道如下。1材料表面1.1細(xì)胞人宮頸癌傳代細(xì)胞(Hela),由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供,常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。1.2白色雜草哈爾濱世一堂中藥飲片廠提供,經(jīng)黑龍江省藥品檢驗(yàn)所中藥研究室鑒定。1.3陽性對照藥物利巴韋林注射液,50mg/ml,山東益康藥業(yè)有限公司。1.4rvlog消息的svbol，由中國預(yù)防疾病控制中心提供病毒在Hela細(xì)胞中的組織半數(shù)感染量(TCID50)為10-7.45/200μl。2方法2.1德爾菲草糖的提取和提取2.1.1提升抗rsv活性采用傳統(tǒng)工藝水煎煮、減壓濃縮、醇沉、大孔吸附樹脂柱層析法從敗醬草水提液中提取分離到具有明顯的抗RSV活性的敗醬草抗病毒有效部位AP3。2.1.2從ap3中分離提取、提取和提取遺骸糖ap42.1.2.sevag-異戊醇法在敗醬草AP3水溶液中加入等體積的Sevag液(氯仿-異戊醇為4∶1),劇烈振搖20min,離心,棄下層有機(jī)相,上清液再用Sevag法脫蛋白,反復(fù)5次。2.1.2.2.改進(jìn)和有效零件用5倍于溶液的95%乙醇沉淀至過夜,反復(fù)5次,收集沉淀和上清分別進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn),有效部分進(jìn)入第三步。2.1.2.附樹脂分離提取法將上步所得純化的有效部分再用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離提取,收集到的水洗脫物為AP4,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮后,于冷凍干燥機(jī)上抽濾成粉末。2.2黑加農(nóng)醇ap4的化學(xué)分析2.2.1邵氏反應(yīng)在含有AP4的試管中先加數(shù)滴5%甲萘酚溶液,然后貼壁緩慢滴加數(shù)滴濃硫酸。2.2.2純度評價(jià)2.2.2.草ap3溶液Sevag法去蛋白前,取減壓濃縮后的敗醬草AP3溶液1ml,向其中滴加2~3滴茚三酮溶液。Sevag法去蛋白后,取多糖溶液1ml,向其中滴加2~3滴茚三酮溶液。2.2.2.2.紫外光譜檢測精密稱取1mgAP4,配制成2%水溶液,以蒸餾水作空白對照,190~400nm進(jìn)行紫外掃描。2.2.3碳酸鹽中和液濃縮法稱取10mg多糖,溶于2ml1.0mol/L硫酸溶液,封管,100℃水解6h,切開封管,用碳酸鋇中和,濾過,濾液濃縮后供點(diǎn)樣用。所得樣品溶液與葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖、木糖對照品溶液同時(shí)進(jìn)行紙色譜分離,展開劑分別為正丁醇-醋酸-水(4∶1∶5)和異丙醇-濃氨水-水(6∶4.5∶0.5),以苯胺-鄰苯二甲酸為顯色劑。2.3失敗的草糖ap4的抗毒作用2.3.1細(xì)胞形態(tài)觀察用細(xì)胞維持液將藥液倍比稀釋,按每孔200μl分別加入細(xì)胞已長成單層的96孔培養(yǎng)板中,每個(gè)劑量加入4孔細(xì)胞,同時(shí)設(shè)4孔正常細(xì)胞對照。置35.5℃、5%CO2溫箱培養(yǎng),每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),將培養(yǎng)3d的96孔板取出,每孔加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的1mg/ml的MTT50μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清,每孔加二甲基亞砜(DMSO)150μl,振搖混勻后立即在550nm波長下讀取各孔吸光度值。藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)為50%細(xì)胞存活率時(shí)的藥物濃度。細(xì)胞存活率(%)=藥物組平均吸光度值/細(xì)胞對照孔平均吸光度值×100%2.3.2細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞正常對照將56.33TCID50的病毒液感染細(xì)胞,35.5℃、5%CO2孵育2h,棄去含病毒的維持液,加入濃度為1.56、0.78、0.39、0.195、0.098、0.049、0.025、0.012mg/mlAP4的維持液,置于35.5℃、5%CO2溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞形態(tài),連續(xù)3d,記錄細(xì)胞病變(CPE)程度。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照、病毒對照和利巴韋林對照。計(jì)算藥物半數(shù)有效劑量(EC50)和治療指數(shù)(TI)。2.4kruskal-培養(yǎng)了兩組細(xì)胞病變程度的比較Reed-Muench法計(jì)算藥物TC50、EC50、TI(TI=TC50/EC50);Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法比較藥物各劑量組與病毒對照組細(xì)胞病變程度的總體分布差異;數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS13.0完成。3結(jié)果3.1德尚草ap4提取得敗醬草AP4粉末,加蒸餾水溶解,濃度為25mg/ml,三日間歇平壓滅菌,備用。3.2化學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果3.2.1邵氏反應(yīng)在含有AP4的試管中有紫環(huán)生成,Molish反應(yīng)呈陽性,說明AP4含多糖。3.2.2純度評價(jià)3.2.2.1.三酮法Sevag法去蛋白前有藍(lán)色出現(xiàn);Sevag法去蛋白后無藍(lán)色出現(xiàn)。表明所獲多糖制品不含蛋白質(zhì)成分,為非糖蛋白形式。3.2.2.2.紫外光譜檢測結(jié)果表明,在波長260、280nm未見核酸和蛋白質(zhì)紫外吸收峰,表明不含有蛋白質(zhì)、核酸。3.2.3組成分析由紙色譜圖可看出樣品由葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖、木糖等單糖組成。3.3抗癲癇試驗(yàn)的結(jié)果3.3.1ap4ct50根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),采用Reed-Muench法計(jì)算敗醬草多糖AP4TC50=10.89mg/ml,利巴韋林TC50=1.97mg/ml。3.3.2利巴韋林的ap4治療指數(shù)計(jì)算Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法比較各劑量組與病毒對照組細(xì)胞病變程度。結(jié)果表明,敗醬草多糖AP4的1.560mg/ml~0.049mg/ml各劑量組,利巴韋林的0.625mg/ml~0.019mg/ml各劑量組具有明顯的抑制RSV增殖的作用(P<0.01)。采用Reed-Muench法計(jì)算敗醬草多糖AP4的EC50為0.0801mg/ml,利巴韋林的EC50為0.036mg/ml;AP4治療指數(shù)(TI)為135.95,利巴韋林的TI為54.72。結(jié)果見表1。4敗醬草多糖ap4的結(jié)構(gòu)組成及其臨床應(yīng)用新藥開發(fā)研究的實(shí)踐證明,從藥用植物中發(fā)現(xiàn)藥物的生物活性先導(dǎo)物,是國際公認(rèn)的開發(fā)研制創(chuàng)新藥物的有效途徑。在我國用中草藥治療病毒性疾病已有數(shù)千年歷史,積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。所以,從中草藥中尋找高效低毒的抗病毒新藥和抗病毒先導(dǎo)化合物是一個(gè)切實(shí)可行的途徑。特別是單味中草藥,由于其化學(xué)成分相對簡單,已成為研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)用抗病毒作用為導(dǎo)向的化學(xué)分離方法,經(jīng)水煎煮浸提、乙醇沉淀、大孔吸附樹脂柱層析后得到敗醬草抗病毒有效部位AP3,AP3再經(jīng)Sevag法脫蛋白、乙醇精提以及第二次大孔吸附樹脂柱層析后得到敗醬草AP4。AP4經(jīng)Molish反應(yīng)檢測陽性,蛋白質(zhì)檢測無蛋白,紫外波譜掃描測定不含蛋白質(zhì)和核酸,經(jīng)組成成分分析確定AP4是由葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖、木糖等7種單糖組成的多糖類物質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn),多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗感染等活性。其毒副作用小,在臨床使用時(shí),任何給藥途徑均無不良反應(yīng)。另外,本研究在制備敗醬草多糖AP4的工藝中使用了大量乙醇,乙醇毒性小,價(jià)格低廉,來源方便,有一定設(shè)備即可回收反復(fù)使用,降低了生產(chǎn)成本,適于制藥企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。因此,敗醬草多糖AP4作為一種新的抗病毒藥物有很好的開發(fā)前景。在我國臨床應(yīng)用敗醬草治療肝膽疾病、胃腸疾病、婦科及神經(jīng)系統(tǒng)等疾病,但敗醬草抗病毒實(shí)驗(yàn)研究