米曲霉發(fā)酵條件對(duì)蛋白酶活力的影響

米曲霉發(fā)酵條件對(duì)蛋白酶活力的影響

美曲霉是一種常見(jiàn)的腐化劑。其生產(chǎn)酶的高度影響著原料的利用率和產(chǎn)品的質(zhì)量。提高米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力不僅可以提高原料的利用率,而且可以減少釀造工業(yè)的污染,對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)具有重要作用。米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶,其中中性蛋白酶和堿性蛋白酶在醬油釀造中發(fā)揮的作用更為顯著。張淑娟、PADMANABHANS、FUSHIMIN等對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶部分特性進(jìn)行了研究。在醬油的固態(tài)發(fā)酵中,其培養(yǎng)條件對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力有很大影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察培養(yǎng)基碳氮比、加水量、pH值、溫度、無(wú)機(jī)鹽和培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶酶活的影響,選取最佳工藝條件,進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶活力。2材料和方法2.1材料表面2.1.1病毒滬釀3.042米曲霉(Aspergillusoryzae):經(jīng)實(shí)驗(yàn)室復(fù)合誘變處理保藏。2.1.2原材料麩皮、淀粉、馬鈴薯等市購(gòu);豆粕為自貢天車(chē)釀造廠提供。2.1.3角灌裝濕料密封液冷卻三角瓶培養(yǎng)基:麩皮,豆粕,水80mL～100mL,250mL三角瓶裝濕料20g,0.1MPa滅菌20min。斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。2.1.4儀器PHS-3C型數(shù)字酸度計(jì),CS1012型電熱鼓風(fēng)干燥箱,YA.ZZD.10不銹鋼電熱斷水自控蒸餾器。2.2方法2.2.1三角瓶栽培的恒溫控制2.2.2ph值對(duì)基本肌肉蛋白表達(dá)的影響蛋白酶活力的測(cè)定:紫外分光光度法。酶活力定義:1g酶粉或1mL酶液在40℃,一定pH值條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位,U。實(shí)驗(yàn)取1mL孢子濃度為10g/mL～5g/mL的米曲霉懸液接種于20g/mL～250g/mL種曲培養(yǎng)基,每組作3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定蛋白酶活力。3結(jié)果與討論3.1不同碳氮比對(duì)蛋白酶活力的影響碳源為微生物菌種提供生長(zhǎng)能源;氮源主要用于構(gòu)成含氮元素的目的產(chǎn)物,如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等。米曲霉在自然pH值,加水比為44%,30℃恒溫培養(yǎng)72h,考察不同碳氮比對(duì)蛋白酶活力的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,隨著碳氮比的增大,米曲霉的中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶活均增大,說(shuō)明碳源對(duì)米曲霉產(chǎn)酶影響很大。這可能是因?yàn)樘剂吭黾佑欣诰z生長(zhǎng)粗壯濃厚,而且菌體富含的蛋白質(zhì)和核酸,有利于產(chǎn)品氨基酸的提高,可以增加醬油鮮味。當(dāng)C∶N=4∶1時(shí),酶活力最高。當(dāng)碳氮比繼續(xù)增加,蛋白酶活力下降。這說(shuō)明碳氮源比例不當(dāng)會(huì)妨礙菌體按比例吸收營(yíng)養(yǎng)物,影響生長(zhǎng)繁殖,從而影響米曲霉的代謝。3.2加速度比對(duì)米曲霉酶活的影響固態(tài)發(fā)酵中水分是個(gè)重要因素,并且水也是微生物生長(zhǎng)及代謝反應(yīng)的必要物質(zhì)。當(dāng)C∶N=4∶1,自然pH值,30℃恒溫培養(yǎng)72h,考察不同加水比對(duì)酶活的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知,隨著加水量增加米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活逐漸增高;當(dāng)加水量為50%時(shí),其酶活力最高;隨著加水量繼續(xù)增大其酶活逐漸下降。這可能是因?yàn)榈退质姑浊狗N曲培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解性下降,而高水分使種曲培養(yǎng)基多孔性降低、微粒結(jié)構(gòu)損失,同時(shí)黏度增加使透氣性下降,減小氣體的交換和空氣中菌絲體的數(shù)量。所以水分含量過(guò)高過(guò)低對(duì)米曲霉代謝和蛋白酶的合成都有影響。3.3同ph值對(duì)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶酶活的影響初始pH值影響菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成。當(dāng)C∶N=4∶1,加水量50%,30℃恒溫培養(yǎng)72h,考察不同pH值對(duì)酶活的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可知,pH值為6.5時(shí)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的酶活最大,為528.5U/g;pH值為10.0時(shí)堿性蛋白酶的酶活最大,為407.2U/g。這可能是因?yàn)楫?dāng)中性蛋白酶和堿性蛋白酶分別處在它的最適pH值條件下其酶活性最大,而在過(guò)酸或過(guò)堿條件下,米曲霉的生長(zhǎng)較差使酶活性受到影響。3.4最適溫度的確定溫度過(guò)低或過(guò)高都不利于米曲霉生長(zhǎng),而且溫度過(guò)高還可能直接導(dǎo)致酶失活。當(dāng)C∶N=4∶1,加水量50%,pH值為6.5,恒溫培養(yǎng)72h,考察不同溫度對(duì)酶活的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。在培養(yǎng)過(guò)程中,25℃的培養(yǎng)基有白色菌絲并出現(xiàn)少量綠色孢子;而30℃和35℃培養(yǎng)基上則布滿(mǎn)綠色孢子,生長(zhǎng)較旺盛。從圖3可知,30℃時(shí)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活力最大,分別為518.5U/g和408.9U/g,因此30℃為米曲霉的最適溫度;25℃不適合米曲霉生長(zhǎng)也不利于產(chǎn)酶;35℃適合米曲霉生長(zhǎng)但不利于產(chǎn)酶。這可能是由于溫度過(guò)低菌株生長(zhǎng)不適,使蛋白酶產(chǎn)量降低。而溫度過(guò)高,影響菌株代謝使孢子數(shù)減少,同時(shí)影響中性蛋白酶的穩(wěn)定性,導(dǎo)致酶活力下降。3.5化合物對(duì)微生物生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的抑制作用無(wú)機(jī)鹽組成微生物的生理活性物質(zhì),又是其代謝反應(yīng)的調(diào)節(jié)物。如磷、硫可構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì),鎂、鐵可作為酶的組成成分并維持酶活性;鈉、鉀可調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓。這些物質(zhì)在低濃度時(shí)對(duì)微生物的生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物的合成有促進(jìn)作用,而在高濃度時(shí)會(huì)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。當(dāng)C∶N=4∶1,加水量50%,pH值為6.5,30℃恒溫培養(yǎng)72h,考察添加不同種類(lèi)無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,添加磷酸氫二鉀、硫酸鎂和硫酸亞鐵對(duì)產(chǎn)酶有一定促進(jìn)作用;但添加其它無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶影響不明顯。并且添加0.2%硫酸鋅時(shí),其中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活最為顯著為583.2U/g、440.8U/g。3.6蛋白酶的產(chǎn)酶當(dāng)C∶N=4∶1,加水量50%,pH值為6.5,加入0.2%硫酸鋅,30℃恒溫培養(yǎng),考察不同的時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響,見(jiàn)圖4。由圖4可知,66h時(shí)中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活最大為607.2U/g、482.9U/g;72h時(shí)蛋白酶酶活下降。這可能是因?yàn)榫w死亡導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象,同時(shí)酶的部分分解也會(huì)使酶活力下降。4中性蛋白酶和堿性蛋白酶不同培養(yǎng)條件對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶影響顯著。通過(guò)實(shí)驗(yàn)選取最佳培養(yǎng)條件。當(dāng)C∶N=4∶1、加水量50%、pH值6.5、添加