第九章 微生物的突變和誘變育種

第九章微生物的突變和誘變育種第一節(jié)微生物的突變第一節(jié)微生物的突變一、基因突變（genemutation）基因突變簡稱突變，是變異的一類，泛指細胞內(nèi)（或病毒粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。突變的幾率一般很低（10-6~

10-9）從自然界分離到的菌株一般稱野生型菌株（wildtypestrain），簡稱野生型。野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，稱突變株（mutant，或突變體、突變型）。

凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條件）快速選擇出來的突變株稱選擇性突變株（selectablemutant），反之則稱為非選擇性突變株。（一）突變類型1、營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）某一野生菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法再在基本培養(yǎng)基上正常生長繁殖的變異類型。2、抗性突變型（resistantmutant）指野生型菌株因發(fā)生基因突變，而產(chǎn)生的對某化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性突變類型。3、條件致死突變型(conditionallethalmutant)某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件下可正常地生長、繁殖并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一種條件下卻無法生長、繁殖的突變類型。4、形態(tài)突變型(morphologicalmutant)

指由突變引起的個體或菌落形態(tài)的變異，一般屬非選擇性突變。5、抗原突變型(antigenicmutant)

指由于基因突變引起的細胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類型，包括細胞壁缺陷變異、莢膜或鞭毛成分變異等。6、產(chǎn)量突變型(metabolicquantitativemutant)

通過基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株，稱產(chǎn)量突變型。有兩種類型：正變株（plus-mutant）、負(fù)變株（minus-mutant）（二）突變率（mutationrate）

某一細胞（或病毒粒）在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率，稱突變率。（三）基因突變的特點1.自發(fā)性：各種突變都可在無人為誘變因素處理下自發(fā)發(fā)生；2.不對應(yīng)性：突變的性狀與引起的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系；3.稀有性：自發(fā)突變的幾率極低，一般10-6-10-9，但穩(wěn)定；4.獨立性：某一突變既不提高也不降低其他任何基因的突變率；5.可誘變性：誘變劑可提高突變的幾率，兩種變異株無本質(zhì)差別；6.穩(wěn)定性：是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生了穩(wěn)定的變化，穩(wěn)定，可遺傳；7.可逆性：任何性狀都可發(fā)生正向突變，也都可發(fā)生回復(fù)突變。（四）基因突變自發(fā)性和不對應(yīng)性的實驗證明

1、Luria等的變量試驗（fluctuationtest）2、Newcombe的涂布試驗3、Lederberg等的影印平板培養(yǎng)法(replicaplating)(五)基因突變及機制1、誘發(fā)突變（inducedmutation）

誘發(fā)突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。凡具有誘變效應(yīng)的任何因素，都稱誘變劑（mutagen）。1）堿基的置換（substitution）轉(zhuǎn)換(嘌呤間或嘧啶間)顛換(嘌呤和嘧啶間)

亞硝酸引起的使A︰T轉(zhuǎn)換成G┇C

過程的簡式見下圖

HNO2

A:THe:THk+T第一次復(fù)制A┇THk┇C第二次復(fù)制

G┇C

Hk┇C①直接引起置換的誘變劑

②間接引起置換的誘變劑

2）移碼突變（frame-shiftmutation）

指誘變劑會使DNA序列中的一個或少數(shù)幾個核苷酸發(fā)生增添（插入）或缺失，從而使該處后面的全部遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生改變，并進一步引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。誘變劑：ICR（美國一癌癥研究所名稱）類化合物：原黃素，吖啶黃，吖啶橙等。誘變機理：至今不清。結(jié)果：加3、減3；加（減）1，短距離減（加）1；影響小。增（減）1、2、4、5引起后面全變。常見的致變劑及其致變作用(a)亞硝基的脫氨作用；(b)烷化劑和被甲基化的堿基；(c)5-溴脫氧嘧啶與鳥嘌呤配對(A=T變G三C)。

3）染色體畸變（chromosomalaberration）

某些強烈理化因子會引起DNA分子的大損傷（macrolesion）染色體畸變。既包括染色體結(jié)構(gòu)上的缺失（deletion）、重復(fù)(duplication)、插入(insertion)、易位(translocation)和倒位(inversion)，也包括染色體數(shù)目的變化。轉(zhuǎn)座（因）子：在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序。其跳躍過程往往導(dǎo)致DNA鏈的斷裂或重接，產(chǎn)生重組交換、基因啟動或關(guān)閉，使突變發(fā)生。轉(zhuǎn)座（因）子主要有三類：IS、Tn、Mu。2、自發(fā)突變自發(fā)突變（spontaneousmutation）是指生物體在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變。自發(fā)突變的原因:1）背景輻射和環(huán)境因素的誘變；2）微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)；3）互變異構(gòu)效應(yīng)；（配對錯誤）4）環(huán)出效應(yīng)。（發(fā)生缺失）(六)紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶堿基受紫外輻射后產(chǎn)生的衍生物(六)紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)

1、光復(fù)活作用（photoreactivation）把經(jīng)UV照射后的微生物立即暴露于可見光下時，就可出現(xiàn)明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，此即光復(fù)活作用。

2、切除修復(fù)（excisionrepair）是活細胞內(nèi)一種用于對被UV等誘變劑損傷后DNA的修復(fù)方式之一，又稱暗修復(fù)（darkrepair），這是一種不依賴可見光，只通過酶切作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一段正常DNA鏈的核酸修復(fù)方式。一、化學(xué)誘變劑

堿基類似物二、物理誘變劑

非電離輻射類因子和電離輻射類因子兩種三、生物誘變劑

（一）轉(zhuǎn)座誘發(fā)突變（二）轉(zhuǎn)化誘發(fā)突變（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)突變（四）定點誘導(dǎo)第二節(jié)誘發(fā)突變及誘變劑第三節(jié)突變體的選擇和檢出一、基因的突變延遲原因：

突變前所產(chǎn)生的物質(zhì)仍然在細胞中存在活性誘變劑作用在DNA的一條鏈上多核細胞，所有的核都變?yōu)樽儺惖暮藭r細胞才會表現(xiàn)出來二、突變體的篩選（一）隨機篩選（二）根據(jù)菌落特征或生化反應(yīng)篩選（三）冷敏感菌篩選法（四）梯度平板法（五）營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選菌種篩選的策略篩選的手段必需配合不同篩選階段的要求初篩：要力求快速、簡便復(fù)篩：應(yīng)該做到精確，測得的數(shù)據(jù)要能夠反映將來的生產(chǎn)水平(1)從菌體形態(tài)變異分析——初篩有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。

平皿快速檢測法平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的“形態(tài)”變化。紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等?！ㄐ曰虬攵坑?，大大提高篩選的效率——初篩微生物特異性平板檢測方法飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。利用一些有特別營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，如待篩選菌具有該營養(yǎng)物的前體轉(zhuǎn)化成營養(yǎng)物能力，工具菌就能圍繞該菌生長待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長的物質(zhì)搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法是將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后，再對培養(yǎng)液進行分析測定。特殊變異菌的篩選方法營養(yǎng)缺陷型突變株抗阻遏和抗反饋突變型抗生素抗性突變株條件抗性突變營養(yǎng)缺陷型突變株濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。篩選步驟：濃縮營養(yǎng)缺陷型菌株常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。目的：淘汰大量野生型，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型占的比例增加進一步檢出所需缺陷型逐個檢出法影印培養(yǎng)法一般從菌落大小也可以判斷，新長出的菌落較小，即是營養(yǎng)缺陷型夾層培養(yǎng)法營養(yǎng)缺陷型的鑒定獲得的營養(yǎng)缺陷型菌株還應(yīng)進一步確認(rèn)其生長的所需物。生長譜法組合補充培養(yǎng)基法營養(yǎng)缺陷型的應(yīng)用

利用營養(yǎng)缺陷型突變株來生產(chǎn)氨基酸和核苷酸是典型的例子天冬氨酸激酶(AK)被賴氨酸及蘇氨酸協(xié)同反饋所抑制通過誘變處理，獲得高絲氨酸缺陷型突變菌株，該突變型不能產(chǎn)生蘇氨酸。在限量高絲氨酸的培養(yǎng)基中缺陷型菌株能夠正常生長，并且因為消除了反饋抑制突變型能過量生產(chǎn)L-賴氨酸抗阻遏和抗反饋突變型抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調(diào)所造成的，在細胞中已經(jīng)有大量最終代謝產(chǎn)物時仍然繼續(xù)不斷地合成這一產(chǎn)物。選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物是指一些和細菌體內(nèi)氨基酸、嘌呤、維生素等代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相類似的物質(zhì)主要用于末端產(chǎn)物的積累抗性突變菌株的篩選抗生素抗性突變株在抗生素產(chǎn)生菌選育中，通過篩選抗生素抗性突變可提高抗生素產(chǎn)量?？股乜剐酝蛔冎瓿芴岣呖股氐漠a(chǎn)量外，還能提高其它代謝產(chǎn)物的量。條件抗性突變因環(huán)境不同，能表現(xiàn)為"野生型"菌株的特性和突變型菌株特性的突變稱為條件抗性突變或稱為條件致死突變。溫度敏感突變常用于提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量致死營養(yǎng)缺陷抗性突變菌株的篩選方法一次性篩選法一次性篩選法就是指在對出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。噬菌體抗性菌株耐高溫菌株階梯性篩選法梯度平板法紙片擴散法用打孔器將較厚的濾紙（如新華六號）打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度的藥物，經(jīng)干燥或不經(jīng)干燥，放入涂布了菌懸液的平板上，一般9厘米的培養(yǎng)皿中等距放置三片為宜。經(jīng)培養(yǎng)后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)的可能就是抗性菌。組成酶變異株的篩選誘導(dǎo)酶的生產(chǎn)需要誘導(dǎo)物，而且受到誘導(dǎo)物的種類、數(shù)量以及分解產(chǎn)物的影響。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）會引起酶合成的減少，誘導(dǎo)