定量十二指腸瘤胃微生物蛋白的定量

定量十二指腸瘤胃微生物蛋白的定量

中國的牛奶蛋白質(zhì)營養(yǎng)體系使用可消化的粗蛋白質(zhì)素。進入腸道的蛋白質(zhì)包括三個部分：腫瘤胃蛋白（rup）、腫瘤胃微生物蛋白（mcp）和內(nèi)源性蛋白（ecp）。因此定量瘤胃微生物蛋白合成量至關重要。NRC(Nationalresearchcounsel)1989采用以下公式來預測微生物蛋白的產(chǎn)量BCP,g/d=6.25×(-30.93+48.09×NEL)。式中NEL為日泌乳凈能攝入量(兆焦,MJ)。NRC2001用130g微生物CP/kg總可消化養(yǎng)分(TDN)采食量計算。然而NEL和TDN這兩個指標都是黑箱指標,著眼點在日糧和排泄物上而不在瘤胃,有很大的局限性。當含有相同泌乳凈能的大麥和玉米分別飼喂給奶牛時,由于它們的淀粉在瘤胃中的發(fā)酵程度并不相同,微生物蛋白的產(chǎn)量也不相同。新的NRC蛋白質(zhì)與氨基酸營養(yǎng)體系中需要定量飼料原料的過瘤胃蛋白(rumenundegradableprotein,RUP)引起了對用體內(nèi)方法定量真胃微生物蛋白(MCP)流量的關注。盡管幾種體外發(fā)估測過瘤胃蛋白的方法如模擬實驗動物法、移動尼龍袋法、溶解度法已經(jīng)建立,但需要用體內(nèi)的方法(Invivo)進行校正。體內(nèi)方法確定瘤胃非降解蛋白需要確定非氨氮(NAN,non-ammonianitrogen),微生物蛋白的流量和內(nèi)源氮(endogenouscrudeprotein)。NRC2001假定內(nèi)源氮為1.9gN/kg干物質(zhì)采食量,其中每一步測定都有誤差會對最終的計算結果產(chǎn)生較大影響。1酶活過程模擬在NRC標準中將來源于瘤胃降解蛋白(rumendegradableprotein,RDP)的氨態(tài)氮(ammonianitro-gen,AN)和來自于氨基酸、肽的a-氨基氮看成是等效的。Maeng報道體外法用氨基酸的混合物25%替代培養(yǎng)液中的氨態(tài)氮顯著的提高了微生物蛋白的產(chǎn)量。Argyle和Baldwin體外研究發(fā)現(xiàn),向只含有氨態(tài)氮的培養(yǎng)液中加入1、10、100mgN/L的肽和氨基酸的混合物可以顯著提高菌體蛋白產(chǎn)量。在不添加碳水化合物的培養(yǎng)液中只有100mgN/L的肽和氨基酸的混合物提高了微生物蛋白的產(chǎn)量,而在1、10mgN/L沒有提高,說明肽和氨基酸在高濃度時作為了微生物生長的能量來源。體內(nèi)方法研究表明,含有58%苜蓿青貯和42%精料日糧條件下奶牛瘤胃氨基酸和肽的濃度分別為72和43mgN/L。他們同時發(fā)現(xiàn)只有添加氨基酸和肽的混合物才能提高菌體蛋白的產(chǎn)量,而單獨添加氨基酸或者肽對混合微生物幾乎沒有影響。Stokes發(fā)現(xiàn)在連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中,當瘤胃降解蛋白供給充足的情況下,菌體蛋白的產(chǎn)量隨著非結構性碳水化合物濃度的提高而呈現(xiàn)線性提高的趨勢。另外一些因素如瘤胃pH值、瘤胃稀釋率和高精料日糧的飼喂頻率都會影響到菌體蛋白的產(chǎn)量。日糧的瘤胃可利用非結構性碳水化合物(rumenavailablenon-structuralcarbohydrate,RANSC)和瘤胃可利用蛋白質(zhì)(rumenavailableprotein,RAP)的同步化會阻止瘤胃微生物的發(fā)酵與生長的解偶聯(lián)(uncouple)。需要用簡單、靈敏、可靠的定量微生物蛋白的技術來驗證微生物蛋白是日糧泌乳凈能NEL的函數(shù)理論的可靠性。2標記的類型出現(xiàn)在飼料中微生物標記分為內(nèi)標(internalmarker)和外標(externalmarker)兩類,理想的標記包括以下特征:①易于定量;②在飼料中并不存在;③在特定的試驗條件下比例恒定;④具有生物學穩(wěn)定性。3內(nèi)部錨點的類型和特點3.1日糧飼料中dap和蛋白質(zhì)比例的變化DAP是在瘤胃微生物細胞壁寡肽中發(fā)現(xiàn)的一種特殊氨基酸?；旌狭鑫讣毦鶧AP和微生物蛋白質(zhì)的比例恒定。因此,DAP被很多人用作內(nèi)標來估測瘤胃細菌蛋白質(zhì)合成。DAP只在瘤胃細菌細胞壁中存在意味著它在總瘤胃細菌蛋白質(zhì)中的濃度會隨著改變大細胞平均大小的條件而發(fā)生變化。有利于大細胞生長的條件將會降低細胞壁和原生質(zhì)的比例,降低DAP和蛋白質(zhì)的比例。增加或者減少DAP或沒有DAP含量細菌的瘤胃條件明顯會改變總體DAP和蛋白質(zhì)的比例。研究表明在同種日糧條件下DAP和蛋白質(zhì)的比例隨著飼喂后時間、固相菌和液相菌之間沒有顯著變化。使用DAP作為標記物的另一個問題是在飼料原料中發(fā)現(xiàn)了DAP的存在。Rahnema和Theurer報道在常用飼料原料中DAP和蛋白質(zhì)的比例占到分離細菌的18%~40%。他們建議進入到真胃的DAP的流量應該用日糧DAP進食量進行校正。然而飼料中的DAP很難在試驗室條件下進行分離測定。在分離瘤胃原蟲時會受到細菌的污染,因此瘤胃原蟲含有一些DAP,但主要還是由于原蟲對細菌的吞噬作用。因此DAP的真胃和小腸流量部分反映了原蟲的蛋白質(zhì)。然而原蟲的DAP和蛋白質(zhì)的比例要比細菌的低。3.2d-al種植Garrett提出了一個新的標記物D-Alanine來估計過瘤胃微生物蛋白流量。細菌細胞壁寡肽中含有這種物質(zhì)。寡肽中的D-Alanine的含量比DAP的含量要高,廣泛分布于細菌中。一些學者使用D-Alanine在體內(nèi)成功的估測了微生物蛋白產(chǎn)量和日糧過瘤胃蛋白。然而,Quigley和Schwab偶然發(fā)現(xiàn)使用D-Alanine作為標記物,微生物蛋白的流量超過了真胃的總氮流量。3.32安氏原蟲的分布Horiguchi和Kandatsu分離了2-氨基乙磷酸這種在纖毛原蟲中存在的氨基酸,但它在飼料中確不存在。與DAP相類似,AEP在不同種類的纖毛原蟲中有不同的分布。后來,Horigane和Horiguchi在瘤胃細菌和飼料原料中發(fā)現(xiàn)了AEP的存在,報道中說“瘤胃細菌可以采食AEP和其他的氨基磷酸,植物可以攝入來源于土壤微生物的AEP,魚粉中含有來源于浮游生物的AEP”。Ankrah發(fā)現(xiàn),在瘤胃微生物區(qū)系尚未建立的綿羊瘤胃內(nèi)的微生物AEP濃度占瘤胃原蟲的33%,瘤胃食糜中AEP占成年綿羊瘤胃食糜的55%。3.4小體回復性離子標記的過瘤胃與腸道微生物流量中的比例單細胞生物體內(nèi)高濃度DNA和過瘤胃RNA使其成為了瘤胃微生物蛋白的標記。用核酸作為微生物蛋白合成標記物的疑慮包括以下兩點:①日糧核酸的存在,②瘤胃細菌與原蟲、瘤胃液相菌與瘤胃固相菌之間不同的核酸和蛋白質(zhì)的比例。僅使用瘤胃細菌嘌呤和蛋白的比例會低估微生物蛋白的產(chǎn)量。進入真胃和腸道原蟲的嘌呤和蛋白的比例大概是細菌的一半。定量原蟲蛋白也是有疑問的,因為原蟲在瘤胃中滯留的時間有很大變化。在瘤胃中的細菌和原蟲的比例和在真胃和腸道微生物流量中的比例會發(fā)生變化。據(jù)Cecava報道,使用混合瘤胃細菌和瘤胃液相菌的嘌呤和氮的比例來計算苜?！衩兹占Z的過瘤胃蛋白值分別為日糧總氮的55%和67%。但是用NRC推薦的公式來計算這個值為35%。有可能使用嘌呤標記物低估了真微生物蛋白流量,低估原蟲蛋白產(chǎn)量比低估過瘤胃日糧核酸更重要。然而由于食糜流量標記物(單相標記物,雙相標記物)的選擇、取樣不均一、飼料過瘤胃蛋白的變化也有可能是造成差異的原因。Cecava報道,分別使用總嘌呤和15N來測定33.3%粗蛋白來源與豆粕和玉米蛋白粉、血粉混合物的兩種日糧,總嘌呤方法測定的結果分別為36%和56%,15N方法測定的結果分別為33%和52%。用NRC標準計算的結果分別為35%和68%。Ling和Buttery對內(nèi)標和外標進行了對比,結論是核酸和35S同樣可靠。3.5處理酶系統(tǒng)中內(nèi)源性衍生物的濃度嘧啶在被反芻動物吸收以后很大程度上發(fā)生了異化,但是來源于瘤胃微生物的嘌呤被從新利用或者以尿液尿囊酸和其他衍生物(尿酸、黃嘌呤、次黃嘌呤)的形式排出體外。尿液嘌呤衍生物有可能是定量腸道瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量的一個標記物。Chen報道,尿液中嘌呤衍生物的形式比較簡單,幾乎全部以尿囊素和尿酸的形式存在。當用尿液嘌呤衍生物來定量微生物蛋白產(chǎn)量時需要估測內(nèi)源性嘌呤的供給、定量十二指腸嘌呤(PBs)和尿液嘌呤衍生物(PDs)的回歸關系。隨著真胃灌注外源嘌呤的增加,內(nèi)源性嘌呤占尿液總嘌呤衍生物的比例大幅度降低。當真胃灌注嘌呤達到0.6mmol/kgBW0.75時,內(nèi)源性的供給幾乎為零。并且十二指腸嘌呤和尿液嘌呤衍生物之間呈現(xiàn)了較好的相關關系,尿液中嘌呤物質(zhì)的回收效率為84%。M.Gonzalez-Ronquillo報道,日糧蛋白質(zhì)濃度較大變化條件下,奶牛的尿液嘌呤衍生物為2.2mmol/kgBW0.75表明16%嘌呤的排泄可能經(jīng)由唾液、乳等其它的路徑。目前,也有通過點采尿樣來預測瘤胃微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量的方法,這種方法可以減少工作量。據(jù)George報道,通過全收尿樣,測定其中嘌呤衍生物與肌氨酸酐比值,ratioofpurinederivativeandcreatinine,PDC指數(shù))和點采尿樣的方法來預測十二指腸MCP供給量,其中PDC指數(shù)法比點采尿樣的方法更可靠。3.6真胃食糜中atp含量測定Forsberg和Lam使用ATP確定瘤胃固相菌和液相菌的比例。然而,Wallace和West發(fā)現(xiàn)真胃食糜中ATP的含量要比瘤胃食糜中ATP含量低很多。另外,死亡的菌體細胞不能合成ATP排除了其作為估測真胃和十二指腸微生物流量的標記。4外標品種和特點4.11n的測定15N作為標記物的優(yōu)點有:①15N是穩(wěn)定性同位素,不會受到環(huán)境的干擾。②自然環(huán)境條件下15N不會出現(xiàn)在日糧中,通過瘤胃灌注15N氨鹽可以對瘤胃微生物進行標記,而日糧氮則不會被標記。③原蟲因?qū)毦耐淌啥?5N標記。④15N價格并不昂貴。但是15N的測定需要用到質(zhì)譜儀,這種儀器的價格非常昂貴。而且在用質(zhì)譜測定之前需要對氮組分預先分離。4.235s35S具有和15N相同的特點,但是其微弱的發(fā)射性會對人的健康有潛在的危害。5代謝產(chǎn)物的檢測奶牛瘤胃微生物蛋白質(zhì)以其優(yōu)質(zhì)、高效