第七章 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)及細胞融合2014

內(nèi)容植物原生質(zhì)體分離，植物原生質(zhì)體培養(yǎng)，植物細胞融合。要求了解原生質(zhì)分離、純化、活力測定及其影響因素，掌握植原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法、步驟和影響因素；理解植物細胞融合的原理及方法。第七章原生質(zhì)體培養(yǎng)

植物細胞中除去細胞壁的裸露的有生活力的部分。除了沒有細胞壁外，具有細胞的一切特征。原生質(zhì)體包括▲細胞質(zhì)膜▲膜內(nèi)細胞質(zhì)▲其他具有生命活性的細胞器，如細胞核、線粒體和高爾基體等。原生質(zhì)體（protoplast）原生質(zhì)體培養(yǎng)意義是植物細胞工程的核心技術(shù)。1.除去了細胞壁，為植物細胞之間的融合掃平了障礙，實現(xiàn)體細胞雜交，為制造新雜種開辟了道路。

(克服遠緣雜交不親和性)2.原生質(zhì)體是各種遺傳操作的理想受體，從而可以進行品種的遺傳改良?？蓴z入外源DNA，細胞器、細菌或病毒顆粒，為高等植物的遺傳飾變打下基礎(chǔ)。3.獲得細胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料。一、原生質(zhì)體的分離（一）材料來源植物的莖、葉、胚、子葉、下胚軸等器官組織以及愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞均可作為原生質(zhì)體分離的材料。

目前較多采用葉片分離原生質(zhì)體，但分裂旺盛的、再分化能力強的愈傷組織或懸浮細胞系，尤其是胚性愈傷組織或胚性懸浮細胞系是最理想的原生質(zhì)體分離材料。

第一節(jié)原生質(zhì)體的分離與純化材料預(yù)處理意義▲提高原生質(zhì)體的分裂頻率；▲逐步提高植物材料的滲透壓，以適應(yīng)培養(yǎng)基中的高滲環(huán)境。方法◆暗處理豌豆枝條取下后，分離原生質(zhì)體前，先在黑暗中（一定濕度）放1-2d，提高原生質(zhì)體存活率高，并能繼續(xù)分裂；◆預(yù)培養(yǎng)羽衣甘藍先去葉下表皮，再在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)7d，再去壁，原生質(zhì)體高度液泡化，葉綠體也解體；◆低溫處理龍膽試管苗的葉片只有用4℃低溫處理后，分離得到的原生質(zhì)體才能分裂。（在很多情況下材料不必經(jīng)過專門的預(yù)處理）1.

機械法Klercker于1892年最早進行分離高等植物原生質(zhì)體的研究。其方法是把細胞置于一種高滲的糖溶液中，使細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形，然后用利刃切割，發(fā)生質(zhì)壁分離的細胞壁被切去后釋放出原生質(zhì)體。缺點◆原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；◆方法繁瑣費力；◆對分生細胞和其它液泡化程度不高的細胞不適用。未得到廣泛應(yīng)用。優(yōu)點

能夠排除外加酶對離體原生質(zhì)體的結(jié)構(gòu)和代謝活性的有害影響。（二）原生質(zhì)體分離方法2.

酶分離法1960年，Cocking首先利用纖維素酶處理番茄根尖，分離得到收率高、活力強、完整性好的原生質(zhì)體。1968年，纖維素酶和離析酶商品化生產(chǎn)后，大量進行植物原生質(zhì)體的研究?，F(xiàn)在果膠酶處理→單細胞－－纖維素酶處理→原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體最有效方法。細胞壁的組成纖維素

半纖維素

果膠質(zhì)少量蛋白質(zhì)25-50％53％5％纖維素酶半纖維素酶果膠酶酶的種類及特點◆纖維素酶主要含有纖維素酶C，作用于天然的和結(jié)晶的纖維素，具有分解天然纖維素的作用，還含纖維素酶CX，作用于定形的纖維素，可分解短鏈纖維素，另含有纖維素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，總體作用是降解纖維素，得到裸露的原生質(zhì)體。

◆半纖維素酶降解半纖維素為單糖或單糖衍生物?！艄z酶使細胞間的果膠質(zhì)降解，把細胞從組織內(nèi)分離出來。此外，還有蝸牛酶（主要用于花粉母細胞和四分體細胞）等。原生質(zhì)體酶分離法◆兩步分離法用果膠酶離析植物組織，收集細胞；經(jīng)洗滌后用纖維素酶解離細胞壁，然后獲得原生質(zhì)體。日本產(chǎn)的Onozuka纖維素酶常和果膠酶結(jié)合使用?！粢徊椒蛛x法一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料進行一次性處理。上海植物生理研究所生產(chǎn)的ZA3-867纖維酶是多種酶的復(fù)合物，含有纖維素酶，果膠酶，半纖維素酶等，分離細胞壁的效果較好。酶液的配制◆酶的配比和濃度果膠酶/纖維素酶純度高，但濃度不宜太高；木本植物加入半纖維素酶。如果溶液中的滲透壓和細胞內(nèi)的滲透壓不同，原生質(zhì)體有可能漲破或收縮，因此在酶液、洗液和培養(yǎng)液中滲透壓

應(yīng)大致和原生質(zhì)體內(nèi)的相同，或者比細胞內(nèi)滲透壓略大些。

較高水平的滲透劑可以阻止原生質(zhì)體的破裂和出芽，但同時也可能抑制原生質(zhì)體的分裂。①糖溶液系統(tǒng)包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，濃度約在0.40-0.80mol／L。可促進分離的原生質(zhì)體再生細胞壁并繼續(xù)分裂；②鹽溶液系統(tǒng)包括KCl、MgSO4和KH2PO4等。

此外，酶溶液里還可加入適量的葡聚糖硫酸鉀，提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性；使RNA酶不活化；并使離子穩(wěn)定?！魸B透穩(wěn)定劑◆pH酶溶液的pH值對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和生活力影響很大。用菜豆葉片作培養(yǎng)材料時發(fā)現(xiàn)原始pH值為5.0時，原生質(zhì)體產(chǎn)生得很快，但損壞較嚴(yán)重，并且培養(yǎng)后大量破裂。當(dāng)pH值提高到6.0時，最初原生質(zhì)體卻產(chǎn)生少，但與pH值為5.0時處理同樣時間后相比，原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加。原始pH值提高到7.0時，生活的原生質(zhì)體數(shù)量進一步增加，損傷的原生質(zhì)體也少得多。

分離葉肉原生質(zhì)體的完整流程表面滅菌的葉片①撕去下表皮酶溶液及滲壓穩(wěn)定劑（葉段漂浮其上）②抽真空、振蕩保溫8hr原生質(zhì)體沉于培養(yǎng)皿底吸掉酶液原生質(zhì)體懸浮于清洗液中

⑤離心2次，第2次離心前重新懸浮于高蔗糖清洗液中原生質(zhì)體（上層）⑥重新懸浮于培養(yǎng)基中取少量樣品用血球板計數(shù)以適當(dāng)?shù)闹舶迕芏戎匦聭腋∮谂囵B(yǎng)基中③④（一）原生質(zhì)體的純化1.

沉降法（過濾離心法）-應(yīng)用最廣利用比重原理，低速離心使原生質(zhì)體沉于底部。

過濾酶處理混合液，30-40μm微孔濾膜，

低速離心，150g以下，3-5min，棄上清，用液體培養(yǎng)基或甘露醇溶液懸浮洗滌，重復(fù)2-3次，

1-2ml液體培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體，備用。優(yōu)點：操作方便；損失少。缺點：純度不高二、原生質(zhì)體的純化與活力測定2.

漂浮法利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后

原生質(zhì)體位于蔗糖溶液和原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)基的界面上，

殘渣碎屑沉到管底。

先加蔗糖溶液（20%左右），

酶處理混合液置于其上，

離心，150g，5min

用液體培養(yǎng)基或甘露醇溶液懸浮洗滌2-3次,1-2ml液體培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體，備用。優(yōu)點：純度高缺點：收率低。3.

界面法采用2種或2種以上密度不同的溶液，離心后使完整的原生質(zhì)體處在兩液相的界面。最早Hughes(1978)兩液相下層：450mM/L蔗糖上層：450mM/L甘露醇Piwowarczyk（1978）改進了上述方法兩液相下層：培養(yǎng)基，含500mM/L蔗糖中層：培養(yǎng)基，含140mM/L蔗糖，360mM/L山梨醇上層：含原生質(zhì)體酶液，含300mM/L山梨醇和100mM/LCaCl2現(xiàn)在用不同連續(xù)梯度Ficoll（聚蔗糖）溶液，上面為酶-原生質(zhì)體混合液，經(jīng)離心（150g，5min）,不同比重的原生質(zhì)體漂浮在不同濃度梯度的界面上。優(yōu)點：收獲的原生質(zhì)體大小均勻一致。缺點：收率低。純化后的葉肉原生質(zhì)體（二）原生質(zhì)體活力的測定1.以胞質(zhì)環(huán)流作為進行活躍代謝的指標(biāo)，

但對在細胞周圍攜有大量葉綠體的葉肉細胞原生質(zhì)體來說，這種方法的作用不大；2.以氧的攝入量作指標(biāo)，攝入量可通過一個能指示呼吸代謝強度的氧電極進行測定。3.以光合活性作指標(biāo)。4.以完整的質(zhì)膜排斥伊凡藍的能力作指標(biāo)。5.以熒光素雙醋酸酯（FDA）的染色能力為指標(biāo)。一、供體植物的選擇

供體組織的生理狀態(tài)很重要。一般情況下，在可控光、溫、濕的環(huán)境條件下能得到重復(fù)的結(jié)果，

即在無菌條件下生長的幼苗制備原生質(zhì)體較好。第二節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)1.基本培養(yǎng)基

MS和B5，或其衍生的培養(yǎng)基。

CaCl2促進細胞分裂。鈣可增強原生質(zhì)體穩(wěn)定性，提高分裂頻率，明顯改變細胞質(zhì)內(nèi)外的離子交換。

NH4NO3降低細胞分裂頻率。2.生長調(diào)節(jié)物質(zhì)生長素/細胞分裂素類。針對不同的研究對象，培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的水平要做適當(dāng)調(diào)整。二、原生質(zhì)體培養(yǎng)基3.滲壓劑在沒有再生出一個堅韌的細胞壁之前，原生質(zhì)必須有培養(yǎng)基滲透壓的保護。高滲溶液，培養(yǎng)時一般逐步過渡。通常的滲透劑是甘露醇和山梨醇。

MS＋NAA2.0ppm＋BA0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇

4.pH：5.6-6.0培養(yǎng)基用醋酸纖維微孔濾膜過濾滅菌。新分離出來的原生質(zhì)體應(yīng)在散射光或黑暗中培養(yǎng)。

培養(yǎng)溫度一般在25-30℃下。三、培養(yǎng)條件

1.液體淺層培養(yǎng)

原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基（約2×105/ml密度）

—將原生質(zhì)體懸浮液移到直徑為6cm的培養(yǎng)皿中（2-3mm為宜）

—5-10天后開始原生質(zhì)體分裂

優(yōu)點▲通氣好；▲原生質(zhì)體代謝物易擴散，防止有害物質(zhì)積累過多造成毒害；▲轉(zhuǎn)移添加新鮮培養(yǎng)基方便，便于觀察和照相；▲操作簡單；▲可微量培養(yǎng)，細胞植板率高。缺點：原生質(zhì)體沉淀，分布不均；細胞團聚集多，難成單細胞株系。四、培養(yǎng)方法

原生質(zhì)體（密度為4×105/ml）與等量體積瓊脂糖培養(yǎng)基均勻混合

—置于6cm培養(yǎng)皿（2-3mm）,

—暗培養(yǎng)

—5-7天原生質(zhì)體開始分裂。

優(yōu)點

原生質(zhì)體分布均勻，利于分裂，容易獲得單胞株系；

可定位觀察。

缺點

原生質(zhì)體易受熱傷害，易破碎；

原生質(zhì)體始終處于高滲透壓脅迫下生長發(fā)育緩慢，植板率低。

2.

固體/平板培養(yǎng)原生質(zhì)體采用平板培養(yǎng)方法包埋在培養(yǎng)皿底層；

上面再加入相同成分的液體培養(yǎng)基，

暗培養(yǎng)。

需更換新鮮液體培養(yǎng)基。

優(yōu)點

原生質(zhì)體分布均勻，有利于分裂，易獲單細胞株系；

能除去抑制分裂的有害物質(zhì)，細胞植板率高。

缺點

原生質(zhì)體易受熱傷害，易破碎。

3.

（固、液）雙層培養(yǎng)五、低密度培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)相似，原生質(zhì)體初始植板密度對植板效率有顯著的影響。原生質(zhì)體培養(yǎng)的一般密度為104-105。高密度下，個別原生質(zhì)體形成的細胞團在相當(dāng)早時就交織在一起，如果原生質(zhì)體群體在遺傳上是異質(zhì)的，就會形成嵌合體組織。在體細胞雜交和誘發(fā)突變的研究中，最好能獲得個別細胞的無性系。需要低密度（100-500）原生質(zhì)體培養(yǎng)。1.

培養(yǎng)基KM8pKao&Michayluk（1975）Viciahajastana（一種蠶豆）單細胞再生出壁，并分裂形成愈傷；在苜蓿、豌豆和Vicia中培養(yǎng)中，低密度下（小于100）分裂的更快；培養(yǎng)馬鈴薯原生質(zhì)體及馬鈴薯/番茄原生質(zhì)體融合產(chǎn)物獲得成功。黑暗或近于黑暗（50lx）培養(yǎng)。2.培養(yǎng)方法1）飼養(yǎng)細胞層法

用X射線或紫外線照射細胞（106），抑制細胞分裂，但不破壞細胞代謝，

將其清洗，

植板在軟瓊脂培養(yǎng)基上，此平板稱飼喂層，

然后將未照射處理的原生質(zhì)體鋪在飼喂層上。

特點

以一種植物細胞制成的平板，支持另一種植物原生質(zhì)體的生長。

飼喂層沒有種的特異性。煙草原生質(zhì)體植板密度低于104時，一般不能分裂，用此方法，植板密度可低至10-100。2種類型的活躍代謝和正在分裂的原生質(zhì)體

混合在液體培養(yǎng)基中一起培養(yǎng)。

用于某些物種原生質(zhì)體或雜種細胞的培養(yǎng)。

條件

2個物種原生質(zhì)體間能發(fā)生有效的互饋；

其產(chǎn)生的愈傷組織形態(tài)上能彼此區(qū)分。2）共培養(yǎng)法3）Cuprak微滴法高國楠（1977）及Gleba（1978）設(shè)計特別培養(yǎng)皿培養(yǎng)單個原生質(zhì)體及其再生的細胞。兩室大的內(nèi)室：很多小穴，加入原生質(zhì)體懸浮液（0.25-0.5μl）；小的外室：注入無菌水，保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕度?？蛇M行單個原生質(zhì)體培養(yǎng)。六、細胞壁的形成培養(yǎng)2-4天，原生質(zhì)體失去其特有的球型外觀，這是再生新壁的象征。研究認為，旋花科植物原生質(zhì)體只有在外源供應(yīng)一種易于代謝的碳源（蔗糖）時，細胞壁才能再生。培養(yǎng)基中若存在電解質(zhì)滲透壓調(diào)節(jié)劑時會抑制壁的再生。壁的形成與細胞分裂有直接關(guān)系，凡是不能再生壁的原生質(zhì)體就不能進行正常的有絲分裂。愈傷組織形成后，轉(zhuǎn)入不含滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)劑中，其培養(yǎng)及植株再生與一般組織培養(yǎng)方法相同。原生質(zhì)體培養(yǎng)的程序

一、原生質(zhì)體融合意義

原生質(zhì)體融合也稱體細胞雜交，

即，分離下來的不同親本雜交的原生質(zhì)體，

在人工控制下互相融合成一體。

自然條件下，原生質(zhì)體自然融合頻率極低，

必須加以一定的方法誘導(dǎo)，才能促進原生質(zhì)體的融合。第三節(jié)原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合◆打破了種間界限（