第十二章DNA合成

核酸的生物合成

本章重點介紹遺傳中心法則和DNA、RNA的生物合成，對基因工程作一般介紹。

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DNA是絕大多數生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結構模型后，1958年，Crick提出了“(F)中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。遺傳信息傳遞的中心法則

蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制復制DNARNA生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細胞分裂的過程中，通過DNA復制把親代細胞所含的遺傳信息忠實地傳遞給兩個子代細胞。在子代細胞的生長發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉變成相應的蛋白質多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質執(zhí)行各種各樣的生物學功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為逆轉錄這是中心法則的補充。

中心法則總結了生物體內遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎，不僅使人們對細胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認識，而且以這方面的理論和技術為基礎發(fā)展了基因工程，給人類的生產和生活帶來了深刻的革命。目錄第四節(jié)基因工程及分子生物學技術簡介第一節(jié)DNA的生物合成第二節(jié)DNA重組第三節(jié)

核酸合成的抑制劑第一節(jié)DNA的生物合成

一、DNA的復制（DNA指導下的DNA合成）三、DNA突變四、DNA的損傷與修復二、逆轉錄作用（RNA指導下的DNA的合成）一、DNA的半保留復制

1、概念和實驗依據

DNA合成的通式及方向

2、原核生物DNA聚合反應有關的酶類

3、原核細胞DNA的復制的起始點和方式5、DNA復制的忠實性6、真核細胞DNA的復制

4、原核細胞DNA的復制過程F半不連續(xù)復制)DNA的半保留復制的概念

DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制。原核生物DNA聚合反應有關的酶類

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)

：啟動RNA引物鏈的合成。(3）DNA連接酶（DNAligase）（4）DNA解鏈酶(DNAhelicase)(5）單鏈結合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結合在解開的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。(6）拓撲異構酶(topoisomerase):兼具內切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物復制的忠實性

DNA復制過程是一個高度精確的過程，據估計，大腸桿菌DNA復制109-1010堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復制忠實性的原因主要有以下三點:a、DNA聚合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則）b、DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3’-5’外切酶切除）c、起始時以RNA作為引物DNA的半保留復制實驗依據

1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標記加密度梯度離心技術實驗,證明了DNA是采取半保留的方式進行復制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA合成的通式及方向DNA合成是以4種dNTP(N=A,T,G,C)為底物，在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3’-OH添加脫氧核苷酸使鏈延長的過程。連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋PPi或NMNATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈大腸桿菌復制起點成串排列的重復序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白結合位點四個9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復制起點在起始階段的結構模型DNA復制的方式環(huán)狀DNA復制時所形成的Q結構起始點復制叉的推進復制叉起始點起始點起始點復制叉復制叉未復制DNA單向復制雙向復制原核細胞DNA的半不連續(xù)復制復制過程

復制叉的移動方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導鏈隨后鏈3′5′復制的起始DNA鏈的合成與延長DNA鏈合成的終止5′RNA引物3′3′大腸桿菌有三種DNA聚合酶分子量每個細胞的分子統(tǒng)計數5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用聚合速度(核苷酸/分)持續(xù)合成能力主要功能PolⅠPolⅡPolⅢ109,000400+++1000-12003-200DNA修復RNA引物切除120,000100++-24001500DNA修復400,00010-20+++15000-60000≥500000DNA復制比較項目DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶ⅢDNApolymeraseI大片段(Klenowfragment)小片段5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用DNA聚合酶Ⅲ全酶

核心酶PolIII

PolIII延長因子DNA聚合酶Ⅲ二聚體primaseAprimosomeisacomplexofsevenproteins:DnaG

primase,DnaB

helicase,DnaChelicaseassistant,DnaT,PriA,PriB,andPriC.DNALigaseligasefrommanybacteria/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb55_1.html不能催化單鏈DNA連接必須具有粘性末端雙鏈DNA，而不是平齊末端羥基和磷酸基團必須相鄰DNAhelicaseIfIwereanenzyme,IwouldbeDNAhelicase,

soIcouldunzipyourgenesSingle-strandedDNAbindingproteinfrom

M.tuberculosis,

M.lepraeandM.megmatis

SSBtopoisomerasecutsonestrandofaDNAdoublehelixandthenreannealsthecutstrand.cutsbothstrandsofoneDNAdoublehelix,passesanotherunbrokenDNAstrandthroughit,andthenreannealsthecutstrandTypeITypeIIDNA聚合酶催化的鏈延長反應3′5′模板鏈5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個細胞的分子統(tǒng)計數5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉化率DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（復合物）109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20+++50比較項目DNA聚合酶的3

-5

外切酶水解位點3′3′5′5′錯配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點復制叉處前導鏈和隨后鏈同時合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶DNA聚合酶的校對功能

5′-核酸外切酶3′-核酸外切酶裂縫聚合中心裂縫內部DNA聚合酶的校對功能聚合酶錯配鹼基復制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯配核苷酸真核細胞DNA復制的特點

多個起點復制起點起點起點起點起點起點

端粒（telemere）復制端粒酶（telomerase）DNA復制需要引物，但在線形DNA分子末端不可能通過正常的機制在引物被降解后合成相應的片段.如果沒有特殊的機制合成末端序列，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。這一難題是通過端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清，端粒酶是一種含RNA的蛋白復合物，實質上是一種逆轉錄酶，它能催化互補于RNA模板的DNA片段的合成，使復制以后的線形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明，人體中生殖細胞的端粒長度保持不變，而體細胞的端粒長度則隨個體的老化而逐步縮短。對此的一個推論是：人的生殖細胞具端粒酶的活力，體細胞則否。這一問題的解決無疑會有助于對生命衰老的認識。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進一步加工繼續(xù)延伸真核和原核DNA細胞復制比較二、逆轉錄作用1、概念2、逆轉錄酶3、病毒逆轉錄過程4、逆轉錄的生物學意義擴充了中心法則有助于對病毒致癌機制的了解與真核細胞分裂和胚胎發(fā)育有關逆轉錄酶是分子生物學重要工具酶三種功能依賴DNA指導下的DNA聚合酶活力依賴RNA的DNA聚合酶活力核糖核酸酶H活力

以RNA為模板合成DNA，這與通常轉錄過程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，故稱為逆轉錄作用。逆轉錄過程中cDNA的合成

依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶逆逆轉錄病毒的生活周期

生活周期RNA衣殼被膜逆轉錄酶轉錄轉譯整合入宿主細胞染色體DNA進入細胞丟失被膜丟失衣殼逆轉錄RNARNAcDNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉錄酶

三、DNA的突變

DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變，從而導致DNA的復制以及后來的轉錄和翻譯產物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。它包括由于DNA損傷和錯配得不到修復而引起的突變，以及由于不同DNA分子之間的交換而引起的遺傳重組。二、誘變劑的作用

堿基類似物(baseanalog)

堿基修飾劑(basemodifier)

嵌入染料(intercalationdye)

紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation)一、突變的類型

堿基對的置換(substitution)

移碼突變(framesshiftmutation)

DNA突變的類型

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-