-第七章-生物反應(yīng)器-細(xì)胞培養(yǎng)

發(fā)酵機械與設(shè)備徐明芳博士教授暨南大學(xué)生科院2015-11-13目錄緒論第一篇生物質(zhì)原料處理設(shè)備第二篇生物反應(yīng)設(shè)備第三篇產(chǎn)物分離設(shè)備第四篇其他設(shè)備底物生物反應(yīng)器檢測控制儀表培養(yǎng)基（滅菌）經(jīng)加工原料酶細(xì)胞生物催化劑（游離或固定化）機械能除菌空氣產(chǎn)品提取純化副產(chǎn)品產(chǎn)品廢物熱能原材料營養(yǎng)物典型工業(yè)生物技術(shù)過程核心技術(shù)？第一篇生物質(zhì)原料處理設(shè)備第一章生物質(zhì)原料預(yù)處理設(shè)備第二章生物細(xì)胞培養(yǎng)基制備設(shè)備第三章生物培養(yǎng)基滅菌設(shè)備第四章原料（物料）輸送設(shè)備第二篇生物反應(yīng)設(shè)備第一節(jié)發(fā)酵設(shè)備概述第二節(jié)通風(fēng)發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)與工作原理第三節(jié)自吸式發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)與工作原理第四節(jié)氣升式發(fā)酵罐(ALR)結(jié)構(gòu)與工作原理第五章生物反應(yīng)器—通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐第六章厭氧（嫌氣）發(fā)酵設(shè)備

第一節(jié)

酒精發(fā)酵設(shè)備第二節(jié)啤酒發(fā)酵設(shè)備第三節(jié)連續(xù)發(fā)酵設(shè)備第二篇生物反應(yīng)設(shè)備第七章生物反應(yīng)器—細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器第一節(jié)植物細(xì)胞反應(yīng)器第二節(jié)動物細(xì)胞反應(yīng)器第三節(jié)微藻培養(yǎng)反應(yīng)器第六章厭氧（嫌氣）發(fā)酵設(shè)備第五章生物反應(yīng)器—通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐底物生物反應(yīng)器檢測控制儀表培養(yǎng)基（滅菌）經(jīng)加工原料酶細(xì)胞生物催化劑（游離或固定化）機械能除菌空氣產(chǎn)品提取純化副產(chǎn)品產(chǎn)品廢物熱能原材料營養(yǎng)物典型工業(yè)生物技術(shù)過程核心技術(shù)？思考題1、有幾種植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)的類型與特點2、簡述植物體細(xì)胞雜交培養(yǎng)的過程3、植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物的區(qū)別？4、常用的植物生物反應(yīng)器有哪些？那種反應(yīng)器更適合植物細(xì)胞培養(yǎng)，具有什么優(yōu)缺點？5、舉例說明植物細(xì)胞培養(yǎng)的流程與應(yīng)用6、植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)需解決的難題7、有哪兩種動物細(xì)胞培養(yǎng)方法？其特點？8、動物細(xì)胞培養(yǎng)可生產(chǎn)的生物制品？9、動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品工藝實例10、動物細(xì)胞培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點有什么差異性11常用的動物生物反應(yīng)器有哪些？12常用的藻類生物反應(yīng)器有哪些？

植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)包括植物器官（根、枝葉、發(fā)根、胚和冠癭組織等）、組織、細(xì)胞以及原生質(zhì)體培養(yǎng)，并以此發(fā)展起來的各種植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。第一節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)第一節(jié)植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)反應(yīng)器

1植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)

2植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

3植物組織培養(yǎng)反應(yīng)器GottleibHaberlandt

1902年德國植物學(xué)家Haberlandt在營養(yǎng)液中成功地培育了單個植物細(xì)胞，盡管未能使其分裂生長，但為植物細(xì)胞培養(yǎng)翻開了新的一頁。

Haberlandt提出植物細(xì)胞的“全能性”學(xué)說，植物細(xì)胞的全能性：植物的體細(xì)胞具有母體植株全部遺傳信息并發(fā)育成為完整個體的潛力，因而每一個植物細(xì)胞可以像胚胎細(xì)胞那樣，經(jīng)離體培養(yǎng)再生成植株。

一般采用植物的體細(xì)胞(二倍體細(xì)胞)，先經(jīng)纖維素酶處理去掉細(xì)胞壁(原生質(zhì)體)。將原生質(zhì)體放在合適的培養(yǎng)基上，經(jīng)過誘導(dǎo)分化可以重新長成植株。原生質(zhì)體也可用于植物細(xì)胞融合，然后誘導(dǎo)形成新的植株。原生質(zhì)體培養(yǎng)1植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)---(1)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)1植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)---(2)植物組織培養(yǎng)(planttissueculture)植物組織培養(yǎng)：離體的植物器官、組織、細(xì)胞植物體愈傷組織脫分化根芽再分化脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化。再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)又可以重新分化成根或芽等器官，這一過程稱為植物細(xì)胞的再分化。植物組織培養(yǎng)(1)(1)(3)1植物細(xì)胞（組織）培養(yǎng)---(3)植物體細(xì)胞雜交(5)植物A細(xì)胞植物B細(xì)胞去壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合融合體再生壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂愈傷組織雜種植株(2)(4)植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物的區(qū)別：細(xì)胞的大小—大細(xì)胞塊的形狀—易成快培養(yǎng)液的黏度-需氧量

Kla

值比微生物培養(yǎng)的Kla值小得多對剪切力敏感需CO2和光照2植物細(xì)胞培養(yǎng)(plantcellculture)

植物細(xì)胞培養(yǎng)具有的優(yōu)點：（1）代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)完全在人工控制條件下進行，可以通過改變培養(yǎng)條件和選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系得到超整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物；（2）培養(yǎng)在無菌條件下進行，可排除病菌和蟲害侵?jǐn)_；（3）可以進行特定的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)；（4）可以探索新的合成路線和獲得新的有用物質(zhì)等。2植物細(xì)胞培養(yǎng)(plantcellculture)2植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器StirredTankBioreactors2植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器（1）機械攪拌式反應(yīng)器優(yōu)點：混合性能好傳氧效率高操作彈性大可用于細(xì)胞高密度培養(yǎng)；缺點：剪切力大。

懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器盡管機械攪拌反應(yīng)器已成功用于許多細(xì)胞的培養(yǎng)中，反應(yīng)器內(nèi)的溫度、pH、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)濃度較其他反應(yīng)器更易控制等優(yōu)點，但由于機械攪拌造成的剪切力以對植物細(xì)胞造成較大的損傷，對次級代謝產(chǎn)物的合成也會產(chǎn)生影響，同時會帶來染菌和機械上的問題，因此需篩選出抗剪切力的細(xì)胞系，也可對反應(yīng)器結(jié)構(gòu)進行改造，尤其是攪拌槳的結(jié)構(gòu)和類型的改進，使其具有緩和、充分的攪拌效果。圖示目前規(guī)模最大的植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器裝置2植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

機械攪拌式反應(yīng)器機械攪拌通風(fēng)式生物反應(yīng)器非攪拌式反應(yīng)器所產(chǎn)生的剪切力較小，結(jié)構(gòu)簡單。其主要類型有鼓泡式反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等氣體攪拌式反應(yīng)器

2植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

（2）非機械攪拌式反應(yīng)器---氣升式BubbleColumnBioreactor植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

非機械攪拌式反應(yīng)器Air-liftBioreactor植物細(xì)胞的培養(yǎng)比較多地采用各種非機械攪拌生物反應(yīng)器，其中常用的是氣體攪拌生物反應(yīng)器。氣體攪拌生物反應(yīng)器沒有活動的攪拌裝置，在很大程度上減少了剪切力，并能在長期操作中保持無菌。氣體攪拌生物反應(yīng)器包括鼓泡塔和氣升式反應(yīng)器等。氣體攪拌生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)較簡單，氧傳遞效率高，剪切力低，對細(xì)胞的損傷小，容易實現(xiàn)長期無菌培養(yǎng)，較適用于植物細(xì)胞培養(yǎng)。缺點：操作彈性小，低氣速時尤其在培養(yǎng)后期細(xì)胞密度較高時，混合效果較差。如果提高通氣量，又會產(chǎn)生大量泡沫，也易于驅(qū)除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯，對細(xì)胞生長有阻礙作用。過高的溶氧對植物細(xì)胞合成次級代謝產(chǎn)物不利。植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器紫草細(xì)胞培養(yǎng)紫草種子無菌幼根LS培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)懸浮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞增殖培養(yǎng)一級培養(yǎng)利用“優(yōu)勢互補”原則，將兩種反應(yīng)器結(jié)合起來研究出組合式反應(yīng)器。帶有低速攪拌的氣升式發(fā)酵罐可彌補低氣速時混合性差的弱點。植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

（3）組合式反應(yīng)器光生物反應(yīng)器植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器

（4）填充床反應(yīng)器（5）流化床反應(yīng)器細(xì)胞可以位于支撐物表面，也可包埋于支撐物之中，培養(yǎng)液流經(jīng)支撐物顆粒，不斷被細(xì)胞利用。優(yōu)點：單位體積固定細(xì)胞量大。缺點：混合效果低，對必要的氧傳遞、pH、溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成困難，影響細(xì)胞的培養(yǎng)。利用液體的能量來懸浮顆粒。顆粒呈流化狀態(tài)所需的能量與顆粒大小成正比，因此常采用小固定化顆粒，這些小顆粒良好的傳質(zhì)特性是流化床反應(yīng)器的優(yōu)點，缺點：剪切力和顆粒碰撞會損壞固定化細(xì)胞。植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

流化床反應(yīng)器植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

流化床反應(yīng)器植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

（6）固定化細(xì)胞膜反應(yīng)器中空纖維螺旋卷繞反應(yīng)器采用具有一定孔徑和選擇透性的膜固定植物細(xì)胞。營養(yǎng)物質(zhì)通過膜滲透到細(xì)胞中，細(xì)胞產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物通過膜釋放到培養(yǎng)液中。主要有：中空纖維反應(yīng)器和螺線式卷繞反應(yīng)器，優(yōu)點：可以重復(fù)使用3植物組織培養(yǎng)反應(yīng)器

發(fā)狀根大規(guī)模培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)反應(yīng)器

(1).小植物的大規(guī)?？焖俜敝?/p>

淺層循環(huán)式植株快速繁殖器

雙層板徑向流生物反應(yīng)器植物組織培養(yǎng)反應(yīng)器

小植物的大規(guī)?？焖俜敝?/p>

內(nèi)環(huán)噴霧生物反應(yīng)器4植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用（1)西洋參細(xì)胞培養(yǎng)無菌根愈傷組織懸浮細(xì)胞發(fā)酵液乙醇消毒誘導(dǎo)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)大量培養(yǎng)西洋參根細(xì)胞過濾西洋參細(xì)胞干粉成品干燥植物細(xì)胞的生產(chǎn)流程與應(yīng)用

(2)藥物的生產(chǎn)植物細(xì)胞產(chǎn)物產(chǎn)物作用紫草細(xì)胞紫草寧抗炎劑、食用色素苦瓜細(xì)胞類胰島素治療糖尿病長春花細(xì)胞長春花堿治療白血病藥紅豆杉細(xì)胞紫杉醇抗癌藥物毛地黃細(xì)胞毛地黃毒素強心劑紫草種子無菌幼根愈傷組織懸浮細(xì)胞細(xì)胞增殖培養(yǎng)LS培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)一級培養(yǎng)產(chǎn)物培養(yǎng)二級培養(yǎng)發(fā)酵液細(xì)胞收集過濾產(chǎn)物提取分離成品干燥紫草細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫草寧(Shikonin)植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用(3)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)需解決的難題

縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本提高培養(yǎng)細(xì)胞中的有效成分含量防止細(xì)胞集聚成塊防止細(xì)胞株的種性退化和變異研制更能適合植物細(xì)胞生長的生物反應(yīng)器第二節(jié)動物細(xì)胞融合1、動物細(xì)胞培養(yǎng)將動物組織或細(xì)胞從機體取出，分散成單個細(xì)胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長和繁殖。根據(jù)生物反應(yīng)器的不同用途，有懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器等。種類上大致有塑料袋增殖器、填充床增殖器、多層板增殖器、螺旋膜增殖器、槳式攪拌反應(yīng)器、棒式攪拌反應(yīng)器、船舶推進槳攪拌反應(yīng)器、傾斜槳葉攪拌反應(yīng)器、船帆形攪拌反應(yīng)器、往復(fù)振動錐孔篩板攪拌反應(yīng)器、籠式通氣攪拌反應(yīng)器、雙層籠式通氣攪拌反應(yīng)器、空氣提升式反應(yīng)器等。表５－１示為某些生物反應(yīng)器的主要特性。雜交瘤技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

1動物細(xì)胞培養(yǎng)方法

2動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

3動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點

4細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式

5細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞根據(jù)它們在培養(yǎng)器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細(xì)胞在培養(yǎng)時能貼附在支技物表面生長。大多數(shù)動物細(xì)胞屬于貼壁型細(xì)胞，如Hela、Vero、BHK、CHO細(xì)胞系。懸浮型細(xì)胞在培養(yǎng)中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。1動物細(xì)胞培養(yǎng)方法1動物細(xì)胞培養(yǎng)方法（1）貼壁培養(yǎng)(單層細(xì)胞培養(yǎng))

分散的細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)瓶中很快(幾十分鐘至幾小時)就貼附在瓶壁上，

稱為細(xì)胞貼壁，

貼壁后的細(xì)胞形態(tài)形成多態(tài)性，

呈單層生長，

所以此法又叫單層細(xì)胞培養(yǎng)。（2）懸浮培養(yǎng)

細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程，不貼壁，主要用于懸浮型細(xì)胞培養(yǎng)，如淋巴細(xì)和腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。（3）固定化培養(yǎng)

一種包埋培養(yǎng)。對兩類細(xì)胞都適用，細(xì)胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強。懸浮型細(xì)胞常用海藻酸鈣包埋，貼壁型細(xì)胞常用膠原包埋。1動物細(xì)胞培養(yǎng)方法動物細(xì)胞培養(yǎng)可生產(chǎn)的生物制品1.病毒疫苗：口蹄疫(FMD)、狂犬疫苗等2.非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素(IFN)、白介素(IL)等3.多肽生長因子：神經(jīng)生長因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)4.酶：組織血纖維溶酶原激活劑(t-PA)5.激素：紅細(xì)胞生成素(EPO)、促黃體生成素(LH)6.病毒殺蟲劑7.腫瘤特異性抗原：癌胚抗原(CEA)8.單克隆抗體9.皮膚重植10.細(xì)胞2動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用2動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品工藝實例

1.組織纖溶酶激活劑生產(chǎn)工藝流程細(xì)胞單層細(xì)胞懸液細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)培養(yǎng)液提取液

層析液濃縮液層析液tPA成品分散分離提取層析純化濃縮層析精制凍干2.抗HBsAS的單克隆抗體生產(chǎn)工藝流程培養(yǎng)液雜種細(xì)胞混合物大鼠骨髓瘤＋免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞融合融合混合物篩選克隆化雜交瘤克隆系種質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞種質(zhì)擴大培養(yǎng)分離粗制McAb精制層析液超慮濃縮液凍干McAb精品雜交瘤技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點1.細(xì)胞生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需要抗生素；2.動物細(xì)胞較微生物大得多，無細(xì)胞壁，機械強度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；3.培養(yǎng)過程需氧量少，且不耐受強力通風(fēng)與攪拌；4.在機體中，細(xì)胞相互粘連以集群形式存在；5.培養(yǎng)過程產(chǎn)物分布于細(xì)胞內(nèi)外，成本高，產(chǎn)品價格昂貴；6.大規(guī)模培養(yǎng)時，不可套用微生物反應(yīng)的經(jīng)驗；7.原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。3動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器無論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，深層培養(yǎng)的操作方式可分4細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式。分批式操作操作簡單、是最常用的操作方式。分批式培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長可分為延遲期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期分批式培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線流加式操作

半連續(xù)式操作4細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。

連續(xù)操作能提高細(xì)胞密度，應(yīng)用于培養(yǎng)懸浮型細(xì)胞。

灌注培養(yǎng)大大提高細(xì)胞密度，有助于產(chǎn)物的表達和純化。5動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器它是根據(jù)動物細(xì)胞培養(yǎng)時要求剪切力小、混合性能好的特點開發(fā)出來的生物反應(yīng)器。主要有Spier籠式通氣攪拌生物反應(yīng)器、CelliGen籠式通氣攪拌生物反應(yīng)器和CellCul-20雙層籠式通氣攪拌生物反應(yīng)器動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器通氣攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

通氣攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器１Spier籠式通氣攪拌生物反應(yīng)器

特點可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時氣泡直接損傷細(xì)胞；在采用微載體系培養(yǎng)時，微載體不會被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫囊夾在氣液界面；通過一個多孔的通氣裝置在籠內(nèi)通氣以滿足培養(yǎng)時溶氧的需要。在鼓泡通氣過程中所采用的泡沫經(jīng)管道進入液面上部的由不銹鋼絲網(wǎng)制