第六章 目的基因的轉(zhuǎn)化

第六章目的基因的轉(zhuǎn)化只有獲得大量的轉(zhuǎn)基因植株，才能挑選出理想的育種材料。目前植物轉(zhuǎn)基因的成功率還很低，存在轉(zhuǎn)化技術(shù)復(fù)雜、難以規(guī)?；僮?、及與常規(guī)育種結(jié)合不緊密等問題，也是植物基因工程產(chǎn)業(yè)化的一個(gè)瓶頸。目的基因轉(zhuǎn)化首先要建立理想的受體植物感受態(tài)系統(tǒng)，其次是建立高效的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化DNA直接導(dǎo)入法基因轉(zhuǎn)化植物種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第一節(jié)植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，是指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇性抗生素敏感的再生系統(tǒng)。一、植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件高效穩(wěn)定的再生能力較高的遺傳穩(wěn)定性具有穩(wěn)定的外植體來源對(duì)選擇性抗生素敏感對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性1.高效穩(wěn)定的再生能力用于植物基因轉(zhuǎn)化的外植體必須易于再生，有很高的再生頻率，并且具有良好的實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性。不同植物的種類、細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)、特定的植物培養(yǎng)技術(shù)的成熟程度等在建立受體系統(tǒng)時(shí)均需考慮。理論上講，植物的體細(xì)胞都具有再生完整植株的潛能，即具有全能型。但是在組織培養(yǎng)的實(shí)踐中并不是所有的體細(xì)胞都能再生出完整的植株。植物細(xì)胞的全能性把具有較強(qiáng)全能性的細(xì)胞從植物組織抑制性影響下解脫出來，使其處于獨(dú)立發(fā)育的離體條件下；賦予細(xì)胞一定刺激，即營養(yǎng)物質(zhì)、激素等調(diào)控物質(zhì)。培養(yǎng)技術(shù)不成熟、深度的分化難以逆轉(zhuǎn)等原因，可造成不能再離體條件下表現(xiàn)全能性。只有具備成熟的組織培養(yǎng)條件，保證經(jīng)外源基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能繼續(xù)分化成完整植株，才能作為基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。植物基因轉(zhuǎn)化率低，再生頻率有不同程度的降低，有的甚至不能再生。因此再生系統(tǒng)必須高效，并且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。2.較高的遺傳穩(wěn)定性植物受體系統(tǒng)接受外源DNA后不影響其自身的遺傳體系，同時(shí)又能穩(wěn)定地將外源基因遺傳給后代，保持遺傳的穩(wěn)定性。組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞無性系變異非常普遍，而這些變異與組織培養(yǎng)的方法、再生途徑及外植體的基因型等都有密切關(guān)系。因此，在建立基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)時(shí)應(yīng)充分考慮到這些因素，確保轉(zhuǎn)基因植物的遺傳穩(wěn)定性。3.具有穩(wěn)定的外植體來源轉(zhuǎn)化的外植體一般采用種子，無菌實(shí)生苗的胚軸、子葉或幼葉，可進(jìn)行離體快速繁殖的材料如一些植物的試管苗，以及可較高頻率誘導(dǎo)的營養(yǎng)變態(tài)器官等。4.對(duì)選擇性抗生素敏感抑菌抗生素的條件：對(duì)植物細(xì)胞無毒害作用或毒性較??；有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，特別是農(nóng)桿菌，例如頭孢霉素。選擇性抗生素：淘汰非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株植物受體材料對(duì)所選用的抗生素有一定的敏感性；抗生素對(duì)受體植物沒有嚴(yán)重的毒性，不會(huì)很快殺死植物細(xì)胞，否則轉(zhuǎn)化細(xì)胞也難以生活，例如潮霉素，卡那霉素。5.對(duì)農(nóng)桿菌侵染有敏感性對(duì)于利用農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒為載體所介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化而言，需要植物受體材料對(duì)農(nóng)桿菌敏感。不同的植物，甚至是同一植物的不同組織細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性也有很大差異。因此，在選擇農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)前必須測(cè)試受體系統(tǒng)對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性，只有對(duì)農(nóng)桿菌侵染敏感的植物材料才能作為其受體系統(tǒng)。植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)20世紀(jì)70年代以來，對(duì)植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的研究已進(jìn)行了大量的工作，先后建立了多種有效的受體系統(tǒng)，適應(yīng)于不同轉(zhuǎn)化方法的要求和不同的轉(zhuǎn)化目的。這些受體系統(tǒng)類型各有所長(zhǎng)。植物非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)二、植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)外植體經(jīng)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，并通過分化培養(yǎng)或得再生植株的受體系統(tǒng)。2.1植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)類型特點(diǎn)：易于接受外源基因，轉(zhuǎn)化率較高；擴(kuò)繁量大，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株；外植體試材廣泛，多種組織器官均可誘導(dǎo)愈傷組織；再生植株無性系變異較大，遺傳穩(wěn)定性較差；嵌合體多；適用的植物范圍廣。直接分化再生系統(tǒng)外植體細(xì)胞越過脫分化產(chǎn)生愈傷組織階段而直接分化出不定芽獲得再生植株。特點(diǎn)：獲得再生植株的周期短，操作簡(jiǎn)單；可較好維持受體植物的遺傳特征；轉(zhuǎn)化的外源基因能穩(wěn)定遺傳；再生植株無性系變異較大，遺傳穩(wěn)定性較差；嵌合體多；轉(zhuǎn)化頻率較低。原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體是“裸露”的植物細(xì)胞，能直接高效地?cái)z取外源基因，因而轉(zhuǎn)化效率高且適合于現(xiàn)在建立的所有的轉(zhuǎn)化方法；原生質(zhì)體再生系統(tǒng)通常處于相對(duì)均勻和穩(wěn)定的控制環(huán)境中，從理論上說，有利于準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)化和鑒定；通過原生質(zhì)體培養(yǎng)，細(xì)胞分裂形成基因型一致的細(xì)胞克隆，因此再生植株的嵌合體少；原生質(zhì)體培養(yǎng)經(jīng)歷許多復(fù)雜的生長(zhǎng)、發(fā)育過程，因此細(xì)胞無性系的變異更為強(qiáng)烈，遺傳穩(wěn)定性更差；原生質(zhì)體培養(yǎng)周期長(zhǎng)、難度大、再生頻率低，局限性也較大。胚狀體再生系統(tǒng)胚狀體是指經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生而形成的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)，又稱為體細(xì)胞胚。與有性胚一樣，在一定條件下可發(fā)育成完整的植物體。有些植物本身在自然條件下其珠心組織或助細(xì)胞就可自發(fā)地形成胚狀體。組培過程中，一些體細(xì)胞及其單倍體細(xì)胞也誘導(dǎo)形成胚狀體。特點(diǎn)：胚狀體胚性細(xì)胞接受外源DNA能力強(qiáng)，是理想的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；多數(shù)為單細(xì)胞起源，嵌合體少；具有兩極性，可分化出芽和根，減少生根培養(yǎng)環(huán)節(jié)；利用轉(zhuǎn)基因胚狀體可以生產(chǎn)人工種子；個(gè)體遺傳背景一致、無性系變異小、胚結(jié)構(gòu)完整、成苗快、數(shù)量大等，有利于轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)和推廣；現(xiàn)今普遍認(rèn)為胚狀體是較理想的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。2.2植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立的程序外植體的選擇選擇幼年型的外植體近根部、莖尖區(qū)、生長(zhǎng)點(diǎn)區(qū)的組織器官一般為幼年型。選擇繁殖能力強(qiáng)的外植體減數(shù)分裂前的幼嫩花序和減數(shù)分裂后的珠心組織作為外植體是建立高頻再生系統(tǒng)及其理想的材料。選擇萌動(dòng)期的外植體離體培養(yǎng)芽休眠和萌動(dòng)時(shí)間與田間自然條件十分相似，離體培養(yǎng)同樣要經(jīng)過休眠期。選擇具有強(qiáng)再生能力基因型的外植體外植體的再生能力與其基因型有直接關(guān)系。應(yīng)對(duì)同一植物的不同基因型的外植體進(jìn)行再生能力篩選。選擇遺傳穩(wěn)定性好的外植體遺傳穩(wěn)定性好的才能將轉(zhuǎn)入的基因以及本身的優(yōu)良性狀保留?？傮w來看，采用胚、幼穗、頂端分生組織、幼葉、幼莖等作為外植體。培養(yǎng)基的確立培養(yǎng)基的類型富集元素平衡培養(yǎng)基：如MS培養(yǎng)基KNO3含量較高的培養(yǎng)基：如B5、N6、SH中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基：如H、Nitsch、Miller、Blaydes低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基：如White、WS、HE、Blaydes培養(yǎng)基選擇原則：同一物種的培養(yǎng)基有雷同性，不同亞種、品種間基本培養(yǎng)基類型基本相同；同一植物的不同組織器官的基本培養(yǎng)基類型基本相同；組培所需營養(yǎng)成分與田間栽培有相似性；MS培養(yǎng)基是大多數(shù)植物的通用培養(yǎng)基；無機(jī)鹽濃度是基本培養(yǎng)基類型的重要因素，應(yīng)作為培養(yǎng)基選擇的重要參數(shù)；有機(jī)成分主要是種類的變化，含量變化不大；蔗糖濃度不可忽視，應(yīng)該在確定基本培養(yǎng)基類型后研究最適的蔗糖濃度；提高磷酸根的水平可以抵消IAA對(duì)芽的已知作用，促進(jìn)芽的分化；水解酪蛋白能加強(qiáng)激動(dòng)素誘導(dǎo)分化作用，特別當(dāng)有高水平的IAA時(shí)更為顯著。激素選擇原則：生長(zhǎng)素。影響莖和節(jié)間伸長(zhǎng)、向性、頂端優(yōu)勢(shì)、葉片脫落和生根等。組培中促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織和生根。如IBA、NAA、2,4-D、2,4,5-T；細(xì)胞分裂素。促進(jìn)細(xì)胞分裂，改變頂端優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)芽的分化等。如ZT、BAP、6-BA、2-ip和KT；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例是激素使用的關(guān)鍵，根據(jù)培養(yǎng)的目的進(jìn)行調(diào)節(jié)，原則是生長(zhǎng)素明顯高于細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞脫分化誘導(dǎo)愈傷組織，反之促進(jìn)細(xì)胞分化；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素種類對(duì)不同植物敏感性不同。同一植物不同組織在愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化過程對(duì)激素的要求也不同；有些植物不能活難以得到芽的分化，可使用一些不常用的激素或激素抑制物，可能啟動(dòng)芽的分化。如脫落酸、2,3,5-三碘苯甲酸（0.02mg/L）、7氮吲哚硝基苯酰溴（0.01-0.1mg/L）?？股孛舾行栽囼?yàn)受體植物的敏感性試驗(yàn)：加入對(duì)植物細(xì)胞無毒害作用的抑菌性抗生素的生長(zhǎng)，又不影響植物的正常生長(zhǎng)；對(duì)植物轉(zhuǎn)化體篩選的抗生素濃度試驗(yàn)，既能有效地抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，使之緩慢地死亡，又不影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。設(shè)計(jì)出愈傷組織誘導(dǎo)或分化再生培養(yǎng)基，加入不同種類不同濃度梯度的抗生素，將未經(jīng)轉(zhuǎn)化的受體材料置于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)并觀察該抗生素對(duì)其分化再生的影響。農(nóng)桿菌的敏感性試驗(yàn)及菌種的選擇農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化是目前最成功的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，但宿主有一定局限性，即使是同一植物，不同菌株的敏感性也不同。因此選擇受體植物敏感的菌株是成功轉(zhuǎn)化的重要因素。培養(yǎng)野生型農(nóng)桿菌；用牙簽挑取菌體，穿刺受體植物組織中；幾周后觀察腫瘤或發(fā)根的誘發(fā)情況；可用帶標(biāo)記（報(bào)告）基因農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。2.3植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立的常見問題植物組織培養(yǎng)的污染問題污染是組培過程中最主要的問題，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的快繁增加了生產(chǎn)成本，造成人力、物力和財(cái)力的很大損失。滅菌劑：滅菌效果好、對(duì)外植體損傷小易洗脫、對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員影響小。常用乙醇、汞和抗生素；此外紫外和臭氧發(fā)生器也應(yīng)用于組培生產(chǎn)。外植體內(nèi)生菌：內(nèi)生細(xì)菌可以由導(dǎo)管進(jìn)入到外植體的內(nèi)部。植物組培苗污染的防治措施：獲得優(yōu)良外植體：采取地點(diǎn)、季節(jié)和外植體本身的特性；物理方法：挖除污染培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)移未污染外植體和切除污染外植體；培養(yǎng)基加入防腐劑山梨酸和苯甲酸或者抗生素等；濾紙橋瓶外生根法。滅菌要徹底。各種培養(yǎng)基以及接種過程中使用的各種器具都要嚴(yán)格滅菌。首先是培養(yǎng)基的滅菌，耐高溫的培養(yǎng)基需要在121-123℃條件下滅菌20-30min。一些不耐高溫的物質(zhì)，可采取細(xì)菌過濾器除去其中的微生物。其次，在接種的過程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌，特別是在不慎接觸到污染物時(shí)，極易由于器具引起污染。第三，對(duì)于被污染的培養(yǎng)瓶和器皿要單獨(dú)浸泡，單獨(dú)清洗，有條件的滅菌后再清洗。環(huán)境消毒。尤其是在夏季，高溫高濕條件下污染率更高。接種和培養(yǎng)環(huán)境要保持清潔，定期進(jìn)行熏蒸或噴霧消毒。高錳酸鉀和甲醛熏蒸效果好，但對(duì)人體有一定的傷害，一般每年熏蒸2-3次。平時(shí)接種室和培養(yǎng)室可采用紫外線照射消毒或噴2%來蘇爾消毒。臭氧消毒機(jī)對(duì)環(huán)境消毒效果較好，而且使用靈活方便，對(duì)人體的傷害也相對(duì)較小。嚴(yán)格無菌操作。在接種時(shí)要嚴(yán)格無菌操作，避免人為因素造成污染。為了使超凈工作臺(tái)有效工作，要定期對(duì)過濾器進(jìn)行清洗和更換。每隔一定時(shí)間要檢測(cè)操作區(qū)的帶菌量，如果發(fā)現(xiàn)過濾器失敗，則要整塊更換。試管苗的玻璃化現(xiàn)象指組織培養(yǎng)過程中的特有的一種生理失調(diào)或生理病變，試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。玻璃化苗絕大多數(shù)為來自莖尖或莖段培養(yǎng)物的不定芽。通常玻璃化苗恢復(fù)正常的比例很低，在繼代培養(yǎng)中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是試管苗生產(chǎn)中亟待解決的問題。產(chǎn)生機(jī)制：葉片無功能性氣孔，由于保衛(wèi)細(xì)胞的功能失調(diào)不能關(guān)閉氣孔，玻璃化的葉片不具有柵欄組織，只有海綿組織。在莖內(nèi)有輸導(dǎo)組織，但導(dǎo)管和管胞木質(zhì)化不完全。由于玻璃化植株組織畸形，吸收與光合作用功能不全，因而一般不易再回復(fù)成正常的試管苗，分化能力降低，難以繼代擴(kuò)繁，更難以移栽成活。培養(yǎng)物的褐化褐變是指在組培過程中，培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基逐漸變褐，培養(yǎng)材料也隨之變褐而死亡的現(xiàn)象。褐化機(jī)理：三、植物非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)組織培養(yǎng)條件要求較高，儀器設(shè)備昂貴，轉(zhuǎn)化率低，操作復(fù)雜及有些植物組織培養(yǎng)困難等許多問題制約基因工程發(fā)展。植物有些組織、器官和細(xì)胞同樣具有基因轉(zhuǎn)化的條件，再生能力強(qiáng)，分裂旺盛，分化程度低，取材方便，無需組織培養(yǎng)過程，可與常規(guī)育種更緊密結(jié)合，為非組織培養(yǎng)受體系統(tǒng)。3.1植物生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)利用植物自身的生殖過程，以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性愈傷組織細(xì)胞，發(fā)育成單倍體，建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。如花粉管導(dǎo)入法、花粉粒浸泡法、子房微針注射法等。生殖細(xì)胞作為受體細(xì)胞，具有更強(qiáng)的接受外源DNA的潛能；受體細(xì)胞是單倍體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化基因無顯隱性的影響，使基因充分表達(dá)。通過人工加倍可稱為純合二倍體，縮短簡(jiǎn)單的選育純化過程；利用植物自身的授粉過程操作方便、簡(jiǎn)單，將現(xiàn)代的分子育種與常規(guī)育種緊密結(jié)合；受季節(jié)限制，只能在短暫的開花期內(nèi)進(jìn)行，無性繁殖的植物不宜采用。特點(diǎn)：3.2植物種子受體系統(tǒng)種子是新一代植物的原始體。胚芽的細(xì)胞與卵細(xì)胞類似，具有旺盛的分裂能力和強(qiáng)大的再生能力。只要將外源基因?qū)敕N子的胚細(xì)胞中，即可發(fā)育為一個(gè)完整的植株，所以植物種子是天然的受體系統(tǒng)。3.3植物莖尖分生細(xì)胞受體系統(tǒng)莖尖是莖的頂端分生組織及其周緣部分，有形成莖和側(cè)生葉的營養(yǎng)莖尖和形成花序或花的生殖莖尖。分生區(qū)位于莖尖的最前端，是典型的頂端分生組織，包括最頂端、沒有分化的原分生組織和其下方稍有分化的初分生組織；分生區(qū)細(xì)胞可以不斷地進(jìn)行細(xì)胞分裂，增加細(xì)胞數(shù)目，還可促進(jìn)細(xì)胞的分化，從而發(fā)育成完整的植株；所以把外源基因?qū)肭o尖生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞，可獲得轉(zhuǎn)基因植株。3.4植物質(zhì)體受體系統(tǒng)核基因轉(zhuǎn)化是植物基因工程的主要研究方向。但有一些難以克服的弊端，如細(xì)胞核基因組大、背景復(fù)雜、導(dǎo)入的外源基因難以控制、外源基因表達(dá)效率低、后代不穩(wěn)定、對(duì)于來自原核的基因必須加以修飾改造等。植物中細(xì)胞核、質(zhì)體、線粒體都包含有DNA，相對(duì)獨(dú)立又相互聯(lián)系的三個(gè)遺傳系統(tǒng)。葉綠體轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)：不會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默的現(xiàn)象，外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量更高；可同時(shí)進(jìn)行多種外源基因的表達(dá)，類似于原核體系中的多順反子；母性遺傳，后代不出現(xiàn)形狀分離，并可避免外源DNA在田間擴(kuò)散污染。第二節(jié)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化迄今所獲得的近200多種轉(zhuǎn)基因植株中80%以上是利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)產(chǎn)生的。約93屬643種雙子葉植物對(duì)根癌農(nóng)桿菌敏感。裸子子午對(duì)該菌同樣具有敏感性，能誘發(fā)腫瘤。一般認(rèn)為單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌不具敏感性，但近年來有報(bào)道，農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植物也有侵染能力。1.常用的根癌農(nóng)桿菌菌株2.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序2.1工程載體的構(gòu)建一元載體系統(tǒng)二元載體系統(tǒng)2.2目標(biāo)菌株的制備根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化2.3工程菌液制備制備純度高、生長(zhǎng)旺盛、侵染能力強(qiáng)的農(nóng)桿菌侵染液?jiǎn)慰寺　?duì)數(shù)生長(zhǎng)期、去除抗生素的培養(yǎng)基2.4外植體的預(yù)培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞分裂，分裂狀態(tài)的細(xì)胞更容易整合外源DNA，因而提高外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)化率；田間取材的外植體通過預(yù)培養(yǎng)起到馴化作用，使外植體適應(yīng)于試管離體培養(yǎng)的條件，并保持活躍的生長(zhǎng)代謝狀態(tài)；減少外植體轉(zhuǎn)化過程中雜菌污染率，如果外植體上帶污染源時(shí)，在預(yù)培養(yǎng)中被篩選掉；有利于侵染接種的外植體能與培養(yǎng)基平整接觸。引物外植體在開始培養(yǎng)過程中，由于其迅速生長(zhǎng)而出現(xiàn)上翹或卷曲，使農(nóng)桿菌的接種切面離開培養(yǎng)基使農(nóng)桿菌不能生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。2.5外植體的農(nóng)桿菌接菌一般采用浸泡法。控制外植體在菌液中浸泡的時(shí)間。太短農(nóng)桿菌尚未接種到傷口面，不能轉(zhuǎn)化，太長(zhǎng)導(dǎo)致外植體因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐，一般不要超過30分鐘；菌液濃度對(duì)不同植物的外植體有一定差異，濃度范圍是OD600=0.05-0.7，一般采用較低的OD值和較短的浸泡時(shí)間；浸泡后外植體要在滅菌后適度吸干，時(shí)間太長(zhǎng)外植體失水萎蔫，不吸干易造成菌體過多，影響共培養(yǎng)。2.6外植體的共培養(yǎng)接種菌體后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織或不定芽分化的固體培養(yǎng)基上，在外植體細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)的同時(shí)，農(nóng)桿菌在外植體切口面也增殖生長(zhǎng)，該兩者共同培養(yǎng)過程稱之為共培養(yǎng)。共培養(yǎng)是整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中非常重要的環(huán)節(jié)，引物農(nóng)桿菌附著，T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在這共培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)完成，因此共培養(yǎng)技術(shù)條件的掌握是轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。共培養(yǎng)：農(nóng)桿菌只有在創(chuàng)傷部位生存16小時(shí)后才能誘發(fā)腫瘤，所以共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于16小時(shí)。但不宜太長(zhǎng)，否則農(nóng)桿菌過度生長(zhǎng)，植物細(xì)胞受到毒害而死亡；農(nóng)桿菌增殖適度和生長(zhǎng)狀態(tài)與其侵染能力直接相關(guān)。增殖生長(zhǎng)不良，轉(zhuǎn)化概率很小，過度增殖，引起毒害導(dǎo)致褐化死亡；共培養(yǎng)培養(yǎng)基目前采用加入激素的方法，與愈傷誘導(dǎo)或不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。2.7外植體脫菌共培養(yǎng)后外植體表面及淺層組織中必須進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，使外植體更好地生長(zhǎng)發(fā)育。用無菌水清洗外植體，將表面殘留的農(nóng)桿菌清洗；用抗生素（羧芐青霉素、頭孢霉素、替卡西林等）清洗外植體，抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)；在選擇培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基里加入抗生素持續(xù)對(duì)外植體脫菌。不同抗生素對(duì)不同植物細(xì)胞影響不同。目前使用最多的是頭孢霉素，濃度一般為500mg/L左右。2.7外植體選擇培養(yǎng)不同的植物、外植體組織對(duì)不同的篩選敏感。目前常用的抗生素有潮霉素、卡那霉素、除草劑等。根據(jù)選擇和再生的關(guān)系：先再生后選擇。在愈傷組織誘導(dǎo)或不定芽的分化過程中不加入選擇壓，獲得了愈傷組織、不定芽或再生植株后，再在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。缺點(diǎn)：嵌合體嚴(yán)重，假轉(zhuǎn)化體多，后期工作量大。先選擇后再生。在愈傷組織誘導(dǎo)或不定芽分化培養(yǎng)一開始就加入選擇壓，只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞能進(jìn)行正常生長(zhǎng)發(fā)育及轉(zhuǎn)化體的再生。出現(xiàn)假陽性轉(zhuǎn)化植株的原因：外植體的再生部位與選擇培養(yǎng)基未充分接觸，選擇壓不起作用；轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的滋養(yǎng)作用；T-DNA未整合到染色體上，只是瞬時(shí)表達(dá)；生理性抗性植株。愈傷組織的誘導(dǎo)將水稻種子用75%酒精浸泡30S，進(jìn)行表面消毒。倒掉酒精。0.1%HgCl2晃動(dòng)消毒20min，回收升汞。用滅菌水清洗殘留的升汞，重復(fù)5次。用滅菌的吸水紙吸干水分，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基NMB培養(yǎng)基。28℃暗培養(yǎng)15d，將水稻胚性愈傷挑出轉(zhuǎn)移到新的NMB培養(yǎng)基。水稻轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)（農(nóng)桿菌侵染法）共培養(yǎng)將誘導(dǎo)的愈傷轉(zhuǎn)接到新的NMB培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)3-5d，進(jìn)行活化。將活化好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌燒杯中，倒入適量農(nóng)桿菌懸浮液，覆蓋愈傷組織?；蝿?dòng)燒杯，使菌液與愈傷組織充分接觸，室溫10min。取出愈傷組織，用已經(jīng)滅菌的吸水紙吸干菌液。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基，26℃暗培養(yǎng)2-3天?？剐杂鷤M織篩選將共培養(yǎng)的愈傷組織集中到無菌燒杯中。加入含有少量吐溫-20的滅菌水，晃動(dòng)5min充分清洗愈傷組織。重復(fù)5次。加入含500mg/L的頭孢霉素的無菌水，晃動(dòng)清洗10min。取出愈傷組織，置于滅菌吸水紙，超凈工作臺(tái)2-3h晾干愈傷。將愈傷組織轉(zhuǎn)入含相應(yīng)抗生素的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)30d。抗性愈傷的再生將篩選出的具有抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)接至有相應(yīng)抗生素的預(yù)分化培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)10d。將預(yù)分化的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素的分化培養(yǎng)基上，26℃，12h光照、12h黑暗培養(yǎng)30d。待再生小苗長(zhǎng)至2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，26℃，12h光照、12h黑暗培養(yǎng)10d。將生根小苗轉(zhuǎn)移大田栽培。水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)番茄轉(zhuǎn)化系統(tǒng)擬南芥轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第三節(jié)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的純化培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化植物材料的預(yù)培養(yǎng)和切割菌株在植物外植體上的接種和共培養(yǎng)誘導(dǎo)毛根的分離和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的確認(rèn)和選擇轉(zhuǎn)化體毛狀根的植株再生培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的生物測(cè)定和分析發(fā)根農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化的影響因素：發(fā)根農(nóng)桿菌的種類及濃度植物種類及外植體類型外植體預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)基類型、激素、酚類等化學(xué)因子光照、溫度、pH值、傷害處理等物理因子發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的應(yīng)用促進(jìn)生根增強(qiáng)抗逆性次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)第四節(jié)植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化植物病毒的侵染機(jī)制：病毒先黏附于細(xì)胞膜上，兩者的膜相并合，病毒的遺傳物質(zhì)由并合處進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，或者由于膜的卷曲病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后脫去套膜和殼膜，放出遺傳物質(zhì)。接著在分子水平上進(jìn)行如下的過程：DNA進(jìn)入細(xì)胞核，在宿主細(xì)胞系統(tǒng)下進(jìn)行DNA復(fù)制；mRNA將病毒信息傳到細(xì)胞質(zhì)；mRNA利用宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)合成病毒蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)一部分殘留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，結(jié)合到質(zhì)膜上，另一部分進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，組成病毒衣殼；病毒顆粒進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)，在質(zhì)膜上發(fā)育；發(fā)育成熟的病毒顆粒排到細(xì)胞外。病毒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基本條件病毒的核酸中應(yīng)該包含目的基因；作為載體的病毒本身必須能夠在植物細(xì)胞中正常復(fù)制增殖，又不至于過分?jǐn)_亂寄主的正常生理功能；病毒接種的方法必須簡(jiǎn)單可行，以適合較大規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用；病毒基因能耐受修飾改造以改變某些生物學(xué)特性，主要就是減弱或消除病毒的致病性；病毒基因組能耐受插入報(bào)告基因、目的基因等，同時(shí)又不改變病毒的特性。病毒載體轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便易行、廉價(jià)、能與常規(guī)育種緊密結(jié)合；現(xiàn)有的許多轉(zhuǎn)基因技術(shù)都可以應(yīng)用于病毒的基因轉(zhuǎn)化，如電擊法、基因槍法、原生質(zhì)體法、共培養(yǎng)法、脂質(zhì)體法等；脂質(zhì)體在介導(dǎo)植物病毒RNA的轉(zhuǎn)化方面應(yīng)用很多，脂質(zhì)體包裹植物裸露RNA后，與原生質(zhì)體在特定的融合條件下保溫，可獲得較高的感染率。病毒載體與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的比較：植物病毒載體能把外源基因直接導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，而Ti質(zhì)粒載體是通過侵染轉(zhuǎn)化等復(fù)雜的轉(zhuǎn)移過程而完成；Ti質(zhì)粒載體將外源基因整合到植物核DNA上，而植物病毒載體不影響宿主細(xì)胞核基因組的結(jié)構(gòu)，從而防止無限傳代擴(kuò)散，比較安全可靠；病毒載體具有高效的自我復(fù)制能力，轉(zhuǎn)化植物可得到高拷貝的外源基因，有利于外源基因的表達(dá)和功能實(shí)現(xiàn)。Ti質(zhì)粒載體一般拷貝數(shù)低，外源基因蛋白產(chǎn)物低于細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)的1%；病毒能系統(tǒng)侵染整株植物，避免再生培養(yǎng)，可較快地獲得轉(zhuǎn)基因植物；植物病毒的寄主范圍較廣，一種病毒基因組構(gòu)建的載體可用于多種不同的植物的遺傳操作。病毒載體缺點(diǎn)：外源基因沒有整合到基因組，遺傳不穩(wěn)定；病毒載體仍然存在致病的可能性；病毒載體中的外源基因很容易丟失。第五節(jié)DNA直接導(dǎo)入法基因轉(zhuǎn)化化學(xué)誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化2.物理法誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化低能離子束介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化PEG、多聚L-鳥氨酸、磷酸鈣及高pH條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子。PEG使細(xì)胞膜之間或DNA與膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連。轉(zhuǎn)化步驟：Ti質(zhì)粒DNA提取，或直接提取植物的DNA作為目的基因；原生質(zhì)體分離；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。質(zhì)粒與原生質(zhì)體一起保溫培養(yǎng)，加入PEG，pH8-9；離心收集原生質(zhì)體，或用鈣離子溶液使PEG逐步稀釋；篩選轉(zhuǎn)化子。PEG法優(yōu)點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞傷害少，轉(zhuǎn)化順利；再生植株來源一個(gè)原生質(zhì)體，避免嵌合體產(chǎn)生；PEG法轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體易于選擇轉(zhuǎn)化體；受體植物不受種類的限制，只要能建立原生質(zhì)體再生體系的植物都可以采用PEG法轉(zhuǎn)化。PEG法缺點(diǎn)：原生質(zhì)體再生系統(tǒng)建立比較困難；轉(zhuǎn)化率低；原生質(zhì)體再生的無性系植株變異較大；脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)功能性合成人工膜，然后把DNA包裹在人工膜內(nèi)。將脂質(zhì)體與原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中混合，加入PEG或PVA，再用高pH、高鈣離子溶液漂洗，通過原生質(zhì)體的吞噬或融合可將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)化步驟：用反相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體；RNA或DNA核酸制備；脂質(zhì)體純化；脂質(zhì)體原生質(zhì)體保溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體選擇培養(yǎng)。電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化電激