第六章 目的基因的轉(zhuǎn)化

第六章目的基因的轉(zhuǎn)化只有獲得大量的轉(zhuǎn)基因植株，才能挑選出理想的育種材料。目前植物轉(zhuǎn)基因的成功率還很低，存在轉(zhuǎn)化技術(shù)復(fù)雜、難以規(guī)?；僮?、及與常規(guī)育種結(jié)合不緊密等問題，也是植物基因工程產(chǎn)業(yè)化的一個瓶頸。目的基因轉(zhuǎn)化首先要建立理想的受體植物感受態(tài)系統(tǒng)，其次是建立高效的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化DNA直接導(dǎo)入法基因轉(zhuǎn)化植物種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第一節(jié)植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，是指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉(zhuǎn)化選擇性抗生素敏感的再生系統(tǒng)。一、植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件高效穩(wěn)定的再生能力較高的遺傳穩(wěn)定性具有穩(wěn)定的外植體來源對選擇性抗生素敏感對農(nóng)桿菌侵染有敏感性1.高效穩(wěn)定的再生能力用于植物基因轉(zhuǎn)化的外植體必須易于再生，有很高的再生頻率，并且具有良好的實驗穩(wěn)定性和重復(fù)性。不同植物的種類、細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)、特定的植物培養(yǎng)技術(shù)的成熟程度等在建立受體系統(tǒng)時均需考慮。理論上講，植物的體細(xì)胞都具有再生完整植株的潛能，即具有全能型。但是在組織培養(yǎng)的實踐中并不是所有的體細(xì)胞都能再生出完整的植株。植物細(xì)胞的全能性把具有較強全能性的細(xì)胞從植物組織抑制性影響下解脫出來，使其處于獨立發(fā)育的離體條件下；賦予細(xì)胞一定刺激，即營養(yǎng)物質(zhì)、激素等調(diào)控物質(zhì)。培養(yǎng)技術(shù)不成熟、深度的分化難以逆轉(zhuǎn)等原因，可造成不能再離體條件下表現(xiàn)全能性。只有具備成熟的組織培養(yǎng)條件，保證經(jīng)外源基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能繼續(xù)分化成完整植株，才能作為基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)。植物基因轉(zhuǎn)化率低，再生頻率有不同程度的降低，有的甚至不能再生。因此再生系統(tǒng)必須高效，并且具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。2.較高的遺傳穩(wěn)定性植物受體系統(tǒng)接受外源DNA后不影響其自身的遺傳體系，同時又能穩(wěn)定地將外源基因遺傳給后代，保持遺傳的穩(wěn)定性。組織培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞無性系變異非常普遍，而這些變異與組織培養(yǎng)的方法、再生途徑及外植體的基因型等都有密切關(guān)系。因此，在建立基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)時應(yīng)充分考慮到這些因素，確保轉(zhuǎn)基因植物的遺傳穩(wěn)定性。3.具有穩(wěn)定的外植體來源轉(zhuǎn)化的外植體一般采用種子，無菌實生苗的胚軸、子葉或幼葉，可進(jìn)行離體快速繁殖的材料如一些植物的試管苗，以及可較高頻率誘導(dǎo)的營養(yǎng)變態(tài)器官等。4.對選擇性抗生素敏感抑菌抗生素的條件：對植物細(xì)胞無毒害作用或毒性較?。挥行У匾种萍?xì)菌生長，特別是農(nóng)桿菌，例如頭孢霉素。選擇性抗生素：淘汰非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植株植物受體材料對所選用的抗生素有一定的敏感性；抗生素對受體植物沒有嚴(yán)重的毒性，不會很快殺死植物細(xì)胞，否則轉(zhuǎn)化細(xì)胞也難以生活，例如潮霉素，卡那霉素。5.對農(nóng)桿菌侵染有敏感性對于利用農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒為載體所介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化而言，需要植物受體材料對農(nóng)桿菌敏感。不同的植物，甚至是同一植物的不同組織細(xì)胞對農(nóng)桿菌侵染的敏感性也有很大差異。因此，在選擇農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)前必須測試受體系統(tǒng)對農(nóng)桿菌侵染的敏感性，只有對農(nóng)桿菌侵染敏感的植物材料才能作為其受體系統(tǒng)。植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)20世紀(jì)70年代以來，對植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的研究已進(jìn)行了大量的工作，先后建立了多種有效的受體系統(tǒng)，適應(yīng)于不同轉(zhuǎn)化方法的要求和不同的轉(zhuǎn)化目的。這些受體系統(tǒng)類型各有所長。植物非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)二、植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng)外植體經(jīng)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，并通過分化培養(yǎng)或得再生植株的受體系統(tǒng)。2.1植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)類型特點：易于接受外源基因，轉(zhuǎn)化率較高；擴(kuò)繁量大，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株；外植體試材廣泛，多種組織器官均可誘導(dǎo)愈傷組織；再生植株無性系變異較大，遺傳穩(wěn)定性較差；嵌合體多；適用的植物范圍廣。直接分化再生系統(tǒng)外植體細(xì)胞越過脫分化產(chǎn)生愈傷組織階段而直接分化出不定芽獲得再生植株。特點：獲得再生植株的周期短，操作簡單；可較好維持受體植物的遺傳特征；轉(zhuǎn)化的外源基因能穩(wěn)定遺傳；再生植株無性系變異較大，遺傳穩(wěn)定性較差；嵌合體多；轉(zhuǎn)化頻率較低。原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體是“裸露”的植物細(xì)胞，能直接高效地攝取外源基因，因而轉(zhuǎn)化效率高且適合于現(xiàn)在建立的所有的轉(zhuǎn)化方法；原生質(zhì)體再生系統(tǒng)通常處于相對均勻和穩(wěn)定的控制環(huán)境中，從理論上說，有利于準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)化和鑒定；通過原生質(zhì)體培養(yǎng)，細(xì)胞分裂形成基因型一致的細(xì)胞克隆，因此再生植株的嵌合體少；原生質(zhì)體培養(yǎng)經(jīng)歷許多復(fù)雜的生長、發(fā)育過程，因此細(xì)胞無性系的變異更為強烈，遺傳穩(wěn)定性更差；原生質(zhì)體培養(yǎng)周期長、難度大、再生頻率低，局限性也較大。胚狀體再生系統(tǒng)胚狀體是指經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生而形成的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)，又稱為體細(xì)胞胚。與有性胚一樣，在一定條件下可發(fā)育成完整的植物體。有些植物本身在自然條件下其珠心組織或助細(xì)胞就可自發(fā)地形成胚狀體。組培過程中，一些體細(xì)胞及其單倍體細(xì)胞也誘導(dǎo)形成胚狀體。特點：胚狀體胚性細(xì)胞接受外源DNA能力強，是理想的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；多數(shù)為單細(xì)胞起源，嵌合體少；具有兩極性，可分化出芽和根，減少生根培養(yǎng)環(huán)節(jié)；利用轉(zhuǎn)基因胚狀體可以生產(chǎn)人工種子；個體遺傳背景一致、無性系變異小、胚結(jié)構(gòu)完整、成苗快、數(shù)量大等，有利于轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)和推廣；現(xiàn)今普遍認(rèn)為胚狀體是較理想的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。2.2植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立的程序外植體的選擇選擇幼年型的外植體近根部、莖尖區(qū)、生長點區(qū)的組織器官一般為幼年型。選擇繁殖能力強的外植體減數(shù)分裂前的幼嫩花序和減數(shù)分裂后的珠心組織作為外植體是建立高頻再生系統(tǒng)及其理想的材料。選擇萌動期的外植體離體培養(yǎng)芽休眠和萌動時間與田間自然條件十分相似，離體培養(yǎng)同樣要經(jīng)過休眠期。選擇具有強再生能力基因型的外植體外植體的再生能力與其基因型有直接關(guān)系。應(yīng)對同一植物的不同基因型的外植體進(jìn)行再生能力篩選。選擇遺傳穩(wěn)定性好的外植體遺傳穩(wěn)定性好的才能將轉(zhuǎn)入的基因以及本身的優(yōu)良性狀保留。總體來看，采用胚、幼穗、頂端分生組織、幼葉、幼莖等作為外植體。培養(yǎng)基的確立培養(yǎng)基的類型富集元素平衡培養(yǎng)基：如MS培養(yǎng)基KNO3含量較高的培養(yǎng)基：如B5、N6、SH中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基：如H、Nitsch、Miller、Blaydes低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基：如White、WS、HE、Blaydes培養(yǎng)基選擇原則：同一物種的培養(yǎng)基有雷同性，不同亞種、品種間基本培養(yǎng)基類型基本相同；同一植物的不同組織器官的基本培養(yǎng)基類型基本相同；組培所需營養(yǎng)成分與田間栽培有相似性；MS培養(yǎng)基是大多數(shù)植物的通用培養(yǎng)基；無機(jī)鹽濃度是基本培養(yǎng)基類型的重要因素，應(yīng)作為培養(yǎng)基選擇的重要參數(shù)；有機(jī)成分主要是種類的變化，含量變化不大；蔗糖濃度不可忽視，應(yīng)該在確定基本培養(yǎng)基類型后研究最適的蔗糖濃度；提高磷酸根的水平可以抵消IAA對芽的已知作用，促進(jìn)芽的分化；水解酪蛋白能加強激動素誘導(dǎo)分化作用，特別當(dāng)有高水平的IAA時更為顯著。激素選擇原則：生長素。影響莖和節(jié)間伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等。組培中促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織和生根。如IBA、NAA、2,4-D、2,4,5-T；細(xì)胞分裂素。促進(jìn)細(xì)胞分裂，改變頂端優(yōu)勢，促進(jìn)芽的分化等。如ZT、BAP、6-BA、2-ip和KT；細(xì)胞分裂素與生長素的比例是激素使用的關(guān)鍵，根據(jù)培養(yǎng)的目的進(jìn)行調(diào)節(jié)，原則是生長素明顯高于細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞脫分化誘導(dǎo)愈傷組織，反之促進(jìn)細(xì)胞分化；細(xì)胞分裂素與生長素種類對不同植物敏感性不同。同一植物不同組織在愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化過程對激素的要求也不同；有些植物不能活難以得到芽的分化，可使用一些不常用的激素或激素抑制物，可能啟動芽的分化。如脫落酸、2,3,5-三碘苯甲酸（0.02mg/L）、7氮吲哚硝基苯酰溴（0.01-0.1mg/L）。抗生素敏感性試驗受體植物的敏感性試驗：加入對植物細(xì)胞無毒害作用的抑菌性抗生素的生長，又不影響植物的正常生長；對植物轉(zhuǎn)化體篩選的抗生素濃度試驗，既能有效地抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，使之緩慢地死亡，又不影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長。設(shè)計出愈傷組織誘導(dǎo)或分化再生培養(yǎng)基，加入不同種類不同濃度梯度的抗生素，將未經(jīng)轉(zhuǎn)化的受體材料置于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)并觀察該抗生素對其分化再生的影響。農(nóng)桿菌的敏感性試驗及菌種的選擇農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化是目前最成功的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，但宿主有一定局限性，即使是同一植物，不同菌株的敏感性也不同。因此選擇受體植物敏感的菌株是成功轉(zhuǎn)化的重要因素。培養(yǎng)野生型農(nóng)桿菌；用牙簽挑取菌體，穿刺受體植物組織中；幾周后觀察腫瘤或發(fā)根的誘發(fā)情況；可用帶標(biāo)記（報告）基因農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。2.3植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立的常見問題植物組織培養(yǎng)的污染問題污染是組培過程中最主要的問題，對轉(zhuǎn)基因植株的快繁增加了生產(chǎn)成本，造成人力、物力和財力的很大損失。滅菌劑：滅菌效果好、對外植體損傷小易洗脫、對環(huán)境和實驗人員影響小。常用乙醇、汞和抗生素；此外紫外和臭氧發(fā)生器也應(yīng)用于組培生產(chǎn)。外植體內(nèi)生菌：內(nèi)生細(xì)菌可以由導(dǎo)管進(jìn)入到外植體的內(nèi)部。植物組培苗污染的防治措施：獲得優(yōu)良外植體：采取地點、季節(jié)和外植體本身的特性；物理方法：挖除污染培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)移未污染外植體和切除污染外植體；培養(yǎng)基加入防腐劑山梨酸和苯甲酸或者抗生素等；濾紙橋瓶外生根法。滅菌要徹底。各種培養(yǎng)基以及接種過程中使用的各種器具都要嚴(yán)格滅菌。首先是培養(yǎng)基的滅菌，耐高溫的培養(yǎng)基需要在121-123℃條件下滅菌20-30min。一些不耐高溫的物質(zhì)，可采取細(xì)菌過濾器除去其中的微生物。其次，在接種的過程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌，特別是在不慎接觸到污染物時，極易由于器具引起污染。第三，對于被污染的培養(yǎng)瓶和器皿要單獨浸泡，單獨清洗，有條件的滅菌后再清洗。環(huán)境消毒。尤其是在夏季，高溫高濕條件下污染率更高。接種和培養(yǎng)環(huán)境要保持清潔，定期進(jìn)行熏蒸或噴霧消毒。高錳酸鉀和甲醛熏蒸效果好，但對人體有一定的傷害，一般每年熏蒸2-3次。平時接種室和培養(yǎng)室可采用紫外線照射消毒或噴2%來蘇爾消毒。臭氧消毒機(jī)對環(huán)境消毒效果較好，而且使用靈活方便，對人體的傷害也相對較小。嚴(yán)格無菌操作。在接種時要嚴(yán)格無菌操作，避免人為因素造成污染。為了使超凈工作臺有效工作，要定期對過濾器進(jìn)行清洗和更換。每隔一定時間要檢測操作區(qū)的帶菌量，如果發(fā)現(xiàn)過濾器失敗，則要整塊更換。試管苗的玻璃化現(xiàn)象指組織培養(yǎng)過程中的特有的一種生理失調(diào)或生理病變，試管苗呈半透明狀外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。玻璃化苗絕大多數(shù)為來自莖尖或莖段培養(yǎng)物的不定芽。通常玻璃化苗恢復(fù)正常的比例很低，在繼代培養(yǎng)中仍然形成玻璃花苗，因此，玻璃化苗是試管苗生產(chǎn)中亟待解決的問題。產(chǎn)生機(jī)制：葉片無功能性氣孔，由于保衛(wèi)細(xì)胞的功能失調(diào)不能關(guān)閉氣孔，玻璃化的葉片不具有柵欄組織，只有海綿組織。在莖內(nèi)有輸導(dǎo)組織，但導(dǎo)管和管胞木質(zhì)化不完全。由于玻璃化植株組織畸形，吸收與光合作用功能不全，因而一般不易再回復(fù)成正常的試管苗，分化能力降低，難以繼代擴(kuò)繁，更難以移栽成活。培養(yǎng)物的褐化褐變是指在組培過程中，培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基逐漸變褐，培養(yǎng)材料也隨之變褐而死亡的現(xiàn)象。褐化機(jī)理：三、植物非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)組織培養(yǎng)條件要求較高，儀器設(shè)備昂貴，轉(zhuǎn)化率低，操作復(fù)雜及有些植物組織培養(yǎng)困難等許多問題制約基因工程發(fā)展。植物有些組織、器官和細(xì)胞同樣具有基因轉(zhuǎn)化的條件，再生能力強，分裂旺盛，分化程度低，取材方便，無需組織培養(yǎng)過程，可與常規(guī)育種更緊密結(jié)合，為非組織培養(yǎng)受體系統(tǒng)。3.1植物生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)利用植物自身的生殖過程，以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)，誘導(dǎo)出胚性愈傷組織細(xì)胞，發(fā)育成單倍體，建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化。如花粉管導(dǎo)入法、花粉粒浸泡法、子房微針注射法等。生殖細(xì)胞作為受體細(xì)胞，具有更強的接受外源DNA的潛能；受體細(xì)胞是單倍體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化基因無顯隱性的影響，使基因充分表達(dá)。通過人工加倍可稱為純合二倍體，縮短簡單的選育純化過程；利用植物自身的授粉過程操作方便、簡單，將現(xiàn)代的分子育種與常規(guī)育種緊密結(jié)合；受季節(jié)限制，只能在短暫的開花期內(nèi)進(jìn)行，無性繁殖的植物不宜采用。特點：3.2植物種子受體系統(tǒng)種子是新一代植物的原始體。胚芽的細(xì)胞與卵細(xì)胞類似，具有旺盛的分裂能力和強大的再生能力。只要將外源基因?qū)敕N子的胚細(xì)胞中，即可發(fā)育為一個完整的植株，所以植物種子是天然的受體系統(tǒng)。3.3植物莖尖分生細(xì)胞受體系統(tǒng)莖尖是莖的頂端分生組織及其周緣部分，有形成莖和側(cè)生葉的營養(yǎng)莖尖和形成花序或花的生殖莖尖。分生區(qū)位于莖尖的最前端，是典型的頂端分生組織，包括最頂端、沒有分化的原分生組織和其下方稍有分化的初分生組織；分生區(qū)細(xì)胞可以不斷地進(jìn)行細(xì)胞分裂，增加細(xì)胞數(shù)目，還可促進(jìn)細(xì)胞的分化，從而發(fā)育成完整的植株；所以把外源基因?qū)肭o尖生長點細(xì)胞，可獲得轉(zhuǎn)基因植株。3.4植物質(zhì)體受體系統(tǒng)核基因轉(zhuǎn)化是植物基因工程的主要研究方向。但有一些難以克服的弊端，如細(xì)胞核基因組大、背景復(fù)雜、導(dǎo)入的外源基因難以控制、外源基因表達(dá)效率低、后代不穩(wěn)定、對于來自原核的基因必須加以修飾改造等。植物中細(xì)胞核、質(zhì)體、線粒體都包含有DNA，相對獨立又相互聯(lián)系的三個遺傳系統(tǒng)。葉綠體轉(zhuǎn)化的優(yōu)點：不會出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默的現(xiàn)象，外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量更高；可同時進(jìn)行多種外源基因的表達(dá)，類似于原核體系中的多順反子；母性遺傳，后代不出現(xiàn)形狀分離，并可避免外源DNA在田間擴(kuò)散污染。第二節(jié)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化迄今所獲得的近200多種轉(zhuǎn)基因植株中80%以上是利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)產(chǎn)生的。約93屬643種雙子葉植物對根癌農(nóng)桿菌敏感。裸子子午對該菌同樣具有敏感性，能誘發(fā)腫瘤。一般認(rèn)為單子葉植物對農(nóng)桿菌不具敏感性，但近年來有報道，農(nóng)桿菌對單子葉植物也有侵染能力。1.常用的根癌農(nóng)桿菌菌株2.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序2.1工程載體的構(gòu)建一元載體系統(tǒng)二元載體系統(tǒng)2.2目標(biāo)菌株的制備根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化2.3工程菌液制備制備純度高、生長旺盛、侵染能力強的農(nóng)桿菌侵染液單克隆、對數(shù)生長期、去除抗生素的培養(yǎng)基2.4外植體的預(yù)培養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞分裂，分裂狀態(tài)的細(xì)胞更容易整合外源DNA，因而提高外源基因的瞬時表達(dá)和轉(zhuǎn)化率；田間取材的外植體通過預(yù)培養(yǎng)起到馴化作用，使外植體適應(yīng)于試管離體培養(yǎng)的條件，并保持活躍的生長代謝狀態(tài)；減少外植體轉(zhuǎn)化過程中雜菌污染率，如果外植體上帶污染源時，在預(yù)培養(yǎng)中被篩選掉；有利于侵染接種的外植體能與培養(yǎng)基平整接觸。引物外植體在開始培養(yǎng)過程中，由于其迅速生長而出現(xiàn)上翹或卷曲，使農(nóng)桿菌的接種切面離開培養(yǎng)基使農(nóng)桿菌不能生長實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。2.5外植體的農(nóng)桿菌接菌一般采用浸泡法?？刂仆庵搀w在菌液中浸泡的時間。太短農(nóng)桿菌尚未接種到傷口面，不能轉(zhuǎn)化，太長導(dǎo)致外植體因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐，一般不要超過30分鐘；菌液濃度對不同植物的外植體有一定差異，濃度范圍是OD600=0.05-0.7，一般采用較低的OD值和較短的浸泡時間；浸泡后外植體要在滅菌后適度吸干，時間太長外植體失水萎蔫，不吸干易造成菌體過多，影響共培養(yǎng)。2.6外植體的共培養(yǎng)接種菌體后的外植體培養(yǎng)在誘導(dǎo)愈傷組織或不定芽分化的固體培養(yǎng)基上，在外植體細(xì)胞分裂、生長的同時，農(nóng)桿菌在外植體切口面也增殖生長，該兩者共同培養(yǎng)過程稱之為共培養(yǎng)。共培養(yǎng)是整個轉(zhuǎn)化過程中非常重要的環(huán)節(jié)，引物農(nóng)桿菌附著，T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在這共培養(yǎng)時期內(nèi)完成，因此共培養(yǎng)技術(shù)條件的掌握是轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。共培養(yǎng)：農(nóng)桿菌只有在創(chuàng)傷部位生存16小時后才能誘發(fā)腫瘤，所以共培養(yǎng)時間必須長于16小時。但不宜太長，否則農(nóng)桿菌過度生長，植物細(xì)胞受到毒害而死亡；農(nóng)桿菌增殖適度和生長狀態(tài)與其侵染能力直接相關(guān)。增殖生長不良，轉(zhuǎn)化概率很小，過度增殖，引起毒害導(dǎo)致褐化死亡；共培養(yǎng)培養(yǎng)基目前采用加入激素的方法，與愈傷誘導(dǎo)或不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同。2.7外植體脫菌共培養(yǎng)后外植體表面及淺層組織中必須進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，使外植體更好地生長發(fā)育。用無菌水清洗外植體，將表面殘留的農(nóng)桿菌清洗；用抗生素（羧芐青霉素、頭孢霉素、替卡西林等）清洗外植體，抑制農(nóng)桿菌生長；在選擇培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基里加入抗生素持續(xù)對外植體脫菌。不同抗生素對不同植物細(xì)胞影響不同。目前使用最多的是頭孢霉素，濃度一般為500mg/L左右。2.7外植體選擇培養(yǎng)不同的植物、外植體組織對不同的篩選敏感。目前常用的抗生素有潮霉素、卡那霉素、除草劑等。根據(jù)選擇和再生的關(guān)系：先再生后選擇。在愈傷組織誘導(dǎo)或不定芽的分化過程中不加入選擇壓，獲得了愈傷組織、不定芽或再生植株后，再在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。缺點：嵌合體嚴(yán)重，假轉(zhuǎn)化體多，后期工作量大。先選擇后再生。在愈傷組織誘導(dǎo)或不定芽分化培養(yǎng)一開始就加入選擇壓，只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞能進(jìn)行正常生長發(fā)育及轉(zhuǎn)化體的再生。出現(xiàn)假陽性轉(zhuǎn)化植株的原因：外植體的再生部位與選擇培養(yǎng)基未充分接觸，選擇壓不起作用；轉(zhuǎn)化細(xì)胞對非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的滋養(yǎng)作用；T-DNA未整合到染色體上，只是瞬時表達(dá)；生理性抗性植株。愈傷組織的誘導(dǎo)將水稻種子用75%酒精浸泡30S，進(jìn)行表面消毒。倒掉酒精。0.1%HgCl2晃動消毒20min，回收升汞。用滅菌水清洗殘留的升汞，重復(fù)5次。用滅菌的吸水紙吸干水分，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基NMB培養(yǎng)基。28℃暗培養(yǎng)15d，將水稻胚性愈傷挑出轉(zhuǎn)移到新的NMB培養(yǎng)基。水稻轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)（農(nóng)桿菌侵染法）共培養(yǎng)將誘導(dǎo)的愈傷轉(zhuǎn)接到新的NMB培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)3-5d，進(jìn)行活化。將活化好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到無菌燒杯中，倒入適量農(nóng)桿菌懸浮液，覆蓋愈傷組織?；蝿訜?，使菌液與愈傷組織充分接觸，室溫10min。取出愈傷組織，用已經(jīng)滅菌的吸水紙吸干菌液。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基，26℃暗培養(yǎng)2-3天。抗性愈傷組織篩選將共培養(yǎng)的愈傷組織集中到無菌燒杯中。加入含有少量吐溫-20的滅菌水，晃動5min充分清洗愈傷組織。重復(fù)5次。加入含500mg/L的頭孢霉素的無菌水，晃動清洗10min。取出愈傷組織，置于滅菌吸水紙，超凈工作臺2-3h晾干愈傷。將愈傷組織轉(zhuǎn)入含相應(yīng)抗生素的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)30d。抗性愈傷的再生將篩選出的具有抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)接至有相應(yīng)抗生素的預(yù)分化培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)10d。將預(yù)分化的愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗生素的分化培養(yǎng)基上，26℃，12h光照、12h黑暗培養(yǎng)30d。待再生小苗長至2cm時，將其轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，26℃，12h光照、12h黑暗培養(yǎng)10d。將生根小苗轉(zhuǎn)移大田栽培。水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)番茄轉(zhuǎn)化系統(tǒng)擬南芥轉(zhuǎn)化系統(tǒng)第三節(jié)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌的純化培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化植物材料的預(yù)培養(yǎng)和切割菌株在植物外植體上的接種和共培養(yǎng)誘導(dǎo)毛根的分離和培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的確認(rèn)和選擇轉(zhuǎn)化體毛狀根的植株再生培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的生物測定和分析發(fā)根農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化的影響因素：發(fā)根農(nóng)桿菌的種類及濃度植物種類及外植體類型外植體預(yù)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間培養(yǎng)基類型、激素、酚類等化學(xué)因子光照、溫度、pH值、傷害處理等物理因子發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的應(yīng)用促進(jìn)生根增強抗逆性次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)第四節(jié)植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化植物病毒的侵染機(jī)制：病毒先黏附于細(xì)胞膜上，兩者的膜相并合，病毒的遺傳物質(zhì)由并合處進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，或者由于膜的卷曲病毒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后脫去套膜和殼膜，放出遺傳物質(zhì)。接著在分子水平上進(jìn)行如下的過程：DNA進(jìn)入細(xì)胞核，在宿主細(xì)胞系統(tǒng)下進(jìn)行DNA復(fù)制；mRNA將病毒信息傳到細(xì)胞質(zhì)；mRNA利用宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)合成病毒蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)一部分殘留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，結(jié)合到質(zhì)膜上，另一部分進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，組成病毒衣殼；病毒顆粒進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)，在質(zhì)膜上發(fā)育；發(fā)育成熟的病毒顆粒排到細(xì)胞外。病毒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基本條件病毒的核酸中應(yīng)該包含目的基因；作為載體的病毒本身必須能夠在植物細(xì)胞中正常復(fù)制增殖，又不至于過分?jǐn)_亂寄主的正常生理功能；病毒接種的方法必須簡單可行，以適合較大規(guī)模的實際應(yīng)用；病毒基因能耐受修飾改造以改變某些生物學(xué)特性，主要就是減弱或消除病毒的致病性；病毒基因組能耐受插入報告基因、目的基因等，同時又不改變病毒的特性。病毒載體轉(zhuǎn)化的優(yōu)點簡便易行、廉價、能與常規(guī)育種緊密結(jié)合；現(xiàn)有的許多轉(zhuǎn)基因技術(shù)都可以應(yīng)用于病毒的基因轉(zhuǎn)化，如電擊法、基因槍法、原生質(zhì)體法、共培養(yǎng)法、脂質(zhì)體法等；脂質(zhì)體在介導(dǎo)植物病毒RNA的轉(zhuǎn)化方面應(yīng)用很多，脂質(zhì)體包裹植物裸露RNA后，與原生質(zhì)體在特定的融合條件下保溫，可獲得較高的感染率。病毒載體與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的比較：植物病毒載體能把外源基因直接導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，而Ti質(zhì)粒載體是通過侵染轉(zhuǎn)化等復(fù)雜的轉(zhuǎn)移過程而完成；Ti質(zhì)粒載體將外源基因整合到植物核DNA上，而植物病毒載體不影響宿主細(xì)胞核基因組的結(jié)構(gòu)，從而防止無限傳代擴(kuò)散，比較安全可靠；病毒載體具有高效的自我復(fù)制能力，轉(zhuǎn)化植物可得到高拷貝的外源基因，有利于外源基因的表達(dá)和功能實現(xiàn)。Ti質(zhì)粒載體一般拷貝數(shù)低，外源基因蛋白產(chǎn)物低于細(xì)胞可溶性蛋白質(zhì)的1%；病毒能系統(tǒng)侵染整株植物，避免再生培養(yǎng)，可較快地獲得轉(zhuǎn)基因植物；植物病毒的寄主范圍較廣，一種病毒基因組構(gòu)建的載體可用于多種不同的植物的遺傳操作。病毒載體缺點：外源基因沒有整合到基因組，遺傳不穩(wěn)定；病毒載體仍然存在致病的可能性；病毒載體中的外源基因很容易丟失。第五節(jié)DNA直接導(dǎo)入法基因轉(zhuǎn)化化學(xué)誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化2.物理法誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化低能離子束介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化PEG、多聚L-鳥氨酸、磷酸鈣及高pH條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子。PEG使細(xì)胞膜之間或DNA與膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連。轉(zhuǎn)化步驟：Ti質(zhì)粒DNA提取，或直接提取植物的DNA作為目的基因；原生質(zhì)體分離；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。質(zhì)粒與原生質(zhì)體一起保溫培養(yǎng)，加入PEG，pH8-9；離心收集原生質(zhì)體，或用鈣離子溶液使PEG逐步稀釋；篩選轉(zhuǎn)化子。PEG法優(yōu)點：對細(xì)胞傷害少，轉(zhuǎn)化順利；再生植株來源一個原生質(zhì)體，避免嵌合體產(chǎn)生；PEG法轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體易于選擇轉(zhuǎn)化體；受體植物不受種類的限制，只要能建立原生質(zhì)體再生體系的植物都可以采用PEG法轉(zhuǎn)化。PEG法缺點：原生質(zhì)體再生系統(tǒng)建立比較困難；轉(zhuǎn)化率低；原生質(zhì)體再生的無性系植株變異較大；脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)功能性合成人工膜，然后把DNA包裹在人工膜內(nèi)。將脂質(zhì)體與原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中混合，加入PEG或PVA，再用高pH、高鈣離子溶液漂洗，通過原生質(zhì)體的吞噬或融合可將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn)化步驟：用反相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體；RNA或DNA核酸制備；脂質(zhì)體純化；脂質(zhì)體原生質(zhì)體保溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體選擇培養(yǎng)。電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化電激