新型重組類人膠原蛋白及其應(yīng)用課件

膠原蛋白傳統(tǒng)提取方法的問題國內(nèi)外重組膠原蛋白概況類人膠原蛋白研發(fā)背景膠原蛋白傳統(tǒng)提取方法的問題類人膠原蛋白研發(fā)背景1膠原蛋白傳統(tǒng)提取方式和面臨的問題[1]He|ckeT．Gelatin，Thefoodtechnologist’sfriendorfoe．InternationalFoodIngredients．2000．1，6-8．病毒隱患動物源疾病(如瘟疫、禽流感等)或人體傳染病(如病毒性肝炎和艾滋病等)病毒的傳染危險[2]排異反應(yīng)異種或異體排斥反應(yīng),導(dǎo)致植入部位無菌性炎癥以及細胞數(shù)量和形態(tài)改變細胞毒性不溶于水，加工過程中所用的酸、堿、鹽溶劑很難脫除完全,產(chǎn)生細胞毒性，并降低細胞粘附性制備方法：○酸水解法○堿水解法○酶解法原料來源：豬/牛/驢/魚等動物的結(jié)締組織123膠原蛋白傳統(tǒng)提取方式和面臨的問題[1]He|ckeT．G2類人膠原蛋白研發(fā)背景FDA、歐盟對

動物源膠原蛋白醫(yī)學(xué)應(yīng)用的限制[2][3][4]Cooperman,L.andMichaeli,D.,1984,Theimmunogenicityofinjectablecollagen.I.A1-yearprospectivestudy.JAmAcadDermatol,10:638-646.

Lee,C.H.,Singla,A.andLee,Y.,2001,Biomedicalapplicationsofcollagen.IntJPharm,221:1-22.Olsen,D.,Yang,C.L.,Bodo,M.,Chang,R.,Leigh,S.,Baez,J.,Carmichael,D.,Per?l?,M.,H?m?l?inen,E.R.,Jarvinen,M.andPolarek,J.,2003,Recombinantcollagenandgelatinfordrugdelivery.AdvDrugDelivRev,55:1547-1567.尋找一種安全、有效并具有良好生物功效的膠原蛋白類材料在組織工程、醫(yī)藥美容等領(lǐng)域受到越來越廣泛的關(guān)注類人膠原蛋白研發(fā)背景FDA、歐盟對動物源膠原蛋白Coope3國外重組膠原蛋白的研究現(xiàn)狀2000年MyllyharjuJ等人使用甲基酵母表達生產(chǎn)準(zhǔn)人纖維膠原蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型[5]1998年NokelainenM等用兩種桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞生產(chǎn)類人特異性軟骨膠原II型[6]2001年NokelainenM等使用四種人類基因報道了使用甲基酵母高水平表達I型前膠原[7]UittoJ等從人皮膚細胞體外培養(yǎng)中得到了Ⅰ，Ⅲ型前膠原[8]VaughnPR等在啤酒酵母中表達出了攜帶有羥基化片斷的類人Ⅲ型膠原蛋白[9]由于哺乳動物細胞和昆蟲細胞培養(yǎng)成本高,周期長,重組膠原蛋白表達量極低(1%左右)，培養(yǎng)只能限于實驗規(guī)模,不可能滿足產(chǎn)業(yè)化、大批量的需求[5]MyllyharjuJ，NokelainenM，Vuorela人KividkkoKI．ExpressionofrecombinanthumantypeI-IIIcollagensintheyeastpichiapastoris．BiochemSocTrans．2000．28(4)，353-7．[6]NokelainenM，TuH，Vuorela^NotbohmH，KivirikkoKI,MyllyharjuJ．High-levelproductionofhumantypeIcollagenintheyeastPichiapastoris．Yeast．2001J蚰30．18(9)．797-806．[7]NokelainenM，HelaakoskiT，MyllyharjuJ，NotbohmH，PihlajaniemiT'FietzekPP，KivirikkoKI．ExpressionandcharacterizationofrecombinanthumantypeIIcollagenswithlowandhighcontentsofhydroxylysineanditsglycosylatedforms．MatrixBi01．1998Jan．16(6)，329-38．[8]UittoJ，BoothBPolakKL．CollagenbiosynthesisbyhumanskinfibroblastsIIIsolationandfurthercharacterizationoftypeIandtypeIIIprocoUagenssynthesizedinculture．BiochimBiophysActa．1980Aug21．624(2)，545—61．[9]VaughnPR，GalanisM，RichardsKM，TebbTA，RamshawJA，WerkmeisterJA．Productionofrecombinanthydroxylatedhumantype1IIcollagenfragmentinSaccharomycescerevisiae．DNACellBi01．1998Jun．17(6)，511—8．國外重組膠原蛋白的研究現(xiàn)狀2000年MyllyharjuJ4中國巨子生物率先實現(xiàn)重組膠原蛋白規(guī)模化生產(chǎn)的突破在中國,西北大學(xué)的范代娣等[10,11]采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴增，得到數(shù)段人膠原蛋白基因段，接著進行拼接重復(fù),轉(zhuǎn)化E.coli(大腸桿菌)，并通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)人源性膠原白，所得重組膠原蛋白表達量高達29.4%[12][10]AdaehiT.,etal.GenerationofhybridtransgenicsilkwormsthatexpressBombyxmoriProlyl-hy-droxylasea-subunitsandhumancollagensinposteriorsilkglands:Productionofcocoonsthatcontainedcollagenswithhy-droxylatedpralineresidues[J].JournalofBiotechnology2006,126(2):205~219[11]駱艷娥,范代娣,花秀夫,張兮.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)類人膠原蛋白的過程研究.西北大學(xué)學(xué)報2005,35(2):180~183[12]膠原蛋白與重組膠原蛋白的研究進展陳光徐珍珍吳銘明膠科學(xué)與技術(shù)第31卷第1期2011年3月Vol.31.No.1Mar.2011.中國巨子生物率先實現(xiàn)重組膠原蛋白在中國,西北大學(xué)的范代娣等[5科技部對類人膠原蛋白的評價世界首創(chuàng)全球唯一國際領(lǐng)先科技部對類人膠原蛋白的評價世界首創(chuàng)6類人膠原蛋白的來源和制備類人膠原蛋白的創(chuàng)新性類人膠原蛋白的實驗研究類人膠原蛋白介紹類人膠原蛋白的來源和制備類人膠原蛋白介紹7質(zhì)粒載體人膠原蛋白基因構(gòu)建原始菌(不具膠原合成能力)重組菌(膠原蛋白生產(chǎn)菌)基因工程菌的構(gòu)建反饋補料壓力脈沖饑餓脅迫定向調(diào)控高密度發(fā)酵離心除雜除雜蛋白除內(nèi)毒素類人膠原蛋白蛋白質(zhì)分離純化類人膠原蛋白的來源和制備質(zhì)粒載體人膠原蛋白基因構(gòu)建原始菌重組菌基因工程菌的構(gòu)建反饋壓8類人膠原蛋白的基本生物學(xué)功能通過基因重組和生物工程技術(shù)得到的，一種水溶性高分子生物膠原蛋白在結(jié)構(gòu)、特性方面與人類膠原蛋白極為相似，命名它為類人膠原蛋白具備膠原蛋白基本生物學(xué)功能：生物相容性生物吸收性細胞粘附性促新細胞形成ECM示意圖類人膠原蛋白的基本生物學(xué)功能通過基因重組和生物工程技術(shù)得到的9類人膠原蛋白的創(chuàng)新性無細胞毒性基因工程單細胞蛋白從根本上杜絕隱患保證醫(yī)學(xué)應(yīng)用安全低排異反應(yīng)無病毒隱患來源于人類基因結(jié)構(gòu)最大程度相似修飾過程去除端肽溶于水沒有酸堿溶劑殘留避免影響細胞代謝類人膠原蛋白的創(chuàng)新性無細胞毒性基因工程單細胞蛋白低排異反應(yīng)無10類人膠原蛋白的創(chuàng)新性單螺旋線性結(jié)構(gòu)pH值6.5-7.5保持皮膚酸堿平衡維持細胞粘附性變性溫度高酸堿度中性變性溫度72℃動物膠原37℃-40℃易于儲運保存使用分子量90kD利于皮膚滲透利用均質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強類人膠原蛋白的創(chuàng)新性單螺旋線性結(jié)構(gòu)pH值6.5-7.5變性溫11類人膠原蛋白的安全性評價實驗全身毒性實驗細胞毒性實驗皮膚刺激實驗眼部刺激實驗皮膚過敏實驗亞慢性毒性實驗遺傳毒性實驗皮下植入實驗由“中國食品藥品檢定研究院”完成的生物學(xué)評價試驗植入實驗評價:小鼠、家兔皮下植入，90天無不良反應(yīng)類人膠原蛋白的安全性評價實驗全身毒性細胞毒性皮膚刺激眼部刺激12類人膠原蛋白透皮與吸收實驗小白鼠背部去毛清潔后，涂抹熒光染料(tritc)標(biāo)記過的明膠和類人膠原蛋白溶液；于4h，8h分別在涂抹試樣區(qū)域取1cm×2cm大小的皮膚，進行冰凍切片，采用熒光顯微鏡觀察；結(jié)果表明：類人膠原蛋白具有較強的透皮吸收行為，而明膠的透皮吸收較差。[14][14]TheTransdermalAbsorptionStudyofHuman-LikeCollagen.AdvancedMaterialsResearch,415-417:1781-1985明膠涂抹8h后明膠涂抹4h后類人涂抹8h后類人涂抹4h后皮下真皮表皮皮下真皮表皮類人膠原蛋白透皮與吸收實驗小白鼠背部去毛清潔后，涂抹熒光染料13類人膠原蛋白促細胞生長實驗[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白對BHK-21細胞生長的影響，西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，35(5):581-584,20050.1%類人膠原蛋白可促進成纖維細胞和上皮細胞的生長，其作用明顯優(yōu)于0.1%的維生素C和0.1%的明膠，其促進細胞生長的速度，是對照組的1.4-1.6倍。類人膠原蛋白促細胞生長實驗[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白14類人膠原蛋白促細胞生長實驗[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白對BHK-21細胞生長的影響，西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，35(5):581-584,2005結(jié)果顯示：應(yīng)用類人膠原蛋白溶液培養(yǎng)細胞，細胞數(shù)量有大幅度增加，細胞形態(tài)正常、透亮飽滿。類人膠原蛋白促細胞生長實驗[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白15類人膠原蛋白細胞親和性實驗結(jié)果顯示：14天時成纖維細胞大量貼附在類人膠原蛋白海綿表面，且生長良好。反映了類人膠原蛋白具有良好的細胞親和性和相容性。類人膠原蛋白海綿表面2BS培養(yǎng)14天后掃描電鏡觀察[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白對BHK-21細胞生長的影響，西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，35(5):581-584,2005類人膠原蛋白細胞親和性實驗結(jié)果顯示：類人膠原蛋白海綿表面2B16類人膠原蛋白組織相容性實驗試驗方法：將類人膠原蛋白海綿、動物膠原蛋白海綿和可吸收明膠海綿分別植入兔子肝臟，4周后開腹觀察植入處的肝組織。[16]類人膠原蛋白生物相容性實驗研究《西北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）》2004年2月第32卷第1期作者：西北大學(xué)范代娣，米鈺，惠俊峰等類人膠原蛋白細胞核形態(tài)正常明膠海綿細胞核皺縮動物膠原海綿細胞核皺縮變形類人膠原蛋白組織相容性實驗試驗方法：[16]類人膠原蛋白生物17類人膠原蛋白組織相容性實驗結(jié)果表明：明膠海綿和動物膠原蛋白海綿植入處造成細胞形態(tài)和數(shù)量改變，組織腫脹，大量炎性細胞浸潤類人膠原蛋白海綿對植入處肝細胞形態(tài)幾乎不造成影響，細胞器的形態(tài)較好；組織相容性好，優(yōu)于供試的其他產(chǎn)品類人膠原蛋白植入處組織形態(tài)正常少量炎性細胞浸潤明膠海綿植入處大量炎性細胞浸潤組織增生，細胞腫脹動物膠原海綿植入處大量炎性細胞浸潤組織增生，細胞腫脹[16]類人膠原蛋白生物相容性實驗研究《西北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）》2004年2月第32卷第1期作者：西北大學(xué)范代娣，米鈺，惠俊峰等類人膠原蛋白組織相容性實驗結(jié)果表明：類人膠原蛋白植入處明膠海18皮膚美容止血材料骨修復(fù)材料人工血管皮下注射填充類人膠原蛋白的應(yīng)用皮膚美容類人膠原蛋白的應(yīng)用19類人膠原蛋白在皮膚美容領(lǐng)域的應(yīng)用皮膚美容:眼膜、面膜、噴霧、原液等系列；用于衰老性肌膚緊致抗衰；日常的肌膚養(yǎng)護；皮炎、痤瘡、敏感肌膚等問題肌膚的修護。類人膠原蛋白在皮膚美容領(lǐng)域的應(yīng)用皮膚美容:20生產(chǎn)環(huán)境為萬級條件下的局部百級，等同于手術(shù)室的潔凈要求親和層析+凝膠過濾層析+超濾的純化工藝，可滿足體內(nèi)植入的要求所采用的為注射用水，無菌、無內(nèi)毒素真正不含防腐劑類人膠原蛋白在皮膚美容領(lǐng)域的應(yīng)用生產(chǎn)環(huán)境為萬級條件下的局部百級，等同于手術(shù)室的潔凈要求親和層21類人膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究可降解止血海綿:主要用于腔內(nèi)、顱內(nèi)的外科手術(shù)止血可吸收明膠海綿動物膠原蛋白海綿進口可吸收紗布類人膠原蛋白止血海綿類人膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究可降解止血海綿:可吸收明膠海22可降解止血海綿:主要用于腔內(nèi)、顱內(nèi)的外科手術(shù)止血馬茂，范代娣殼聚糖-類人膠原蛋白對兔肝創(chuàng)面的止血效果及組織相容性觀察，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，28(12):1122-1124專利成果：一種可生物降解止血海綿材料及其制備方法。專利號：ZL200610041913.3一種規(guī)模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法。申請?zhí)枺?00910218514.3類人膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究可降解止血海綿:主要用于腔內(nèi)、顱內(nèi)的外科手術(shù)止血馬茂，范代娣23骨修復(fù)材料:仿生礦化，制備骨修復(fù)材料，用于骨缺損的修復(fù)類人膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究骨修復(fù)材料:仿生礦化，制備骨修復(fù)材料，用于骨缺損的修復(fù)類人膠24類人膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究人工血管：模擬人體血管結(jié)構(gòu)，仿生制備，用于血管修復(fù)類人膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究人工血管：模擬人體血管結(jié)構(gòu)，25類人膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究注射填充水凝膠應(yīng)用領(lǐng)域采用皮下注射或填充，可用于去皺、豐唇、面部矯形、凹陷填充等。產(chǎn)品特點生物相容性優(yōu)異；降解時間可控；產(chǎn)品可促進注射部位細胞活性和膠原蛋白纖維的再生

類人膠原蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究注射填充水凝膠應(yīng)用領(lǐng)域產(chǎn)品特26研發(fā)團隊研發(fā)成果產(chǎn)業(yè)化之路類人膠原蛋白的科研和產(chǎn)業(yè)化研發(fā)團隊類人膠原蛋白的科研和產(chǎn)業(yè)化27類人膠原蛋白的研發(fā)團隊范代娣：新世紀(jì)“百千萬人才工程”國家人選獲“中國青年女科學(xué)家”提名享受“國務(wù)院特殊津貼”博士生導(dǎo)師研發(fā)團隊：博士研究生20余人碩士研究生50余人類人膠原蛋白的研發(fā)團隊范代娣：28類人膠原蛋白的專業(yè)水準(zhǔn)XiaoxuanMa,DaidiFan,Long-anShang,QiangCai,LeiChi,ChenhuiZhu,YuMi,Yan-eLuo.Oxygentransferratecontrolintheproductionofhuman-likecollagenbyrecombinantEscherichiacoil.BiotechnologyandBiochemistry.2010,55,4：169-174(SCI)WenjiaoXue,DaidiFan,LonganShang.Effectsofaceticacidanditsassimilationinfed-batchculturesofrecombinantEscherichiacolicontaininghuman-likecollagencDNA.JournalofBioscienceandBioengineering.2010.109（3）：257-261(SCI)Xiao-JunWang,Dai-DiFan,Yan-ELuo.BreakthroughModelofRecombinantHuman-LikecollageninImmobilizedMetalAffinityChromatography.AppliedBiochemistryandBiotechnology,2009,158(2),262-276.(SCI)WenJXue,DaiDFan,LonganShang,ChenHZhu,XiaoXMa,YuanYYu.Productionofbiomassandrecombinanthuman-likecollageninEscherichiacoliprocesseswithdifferentCO2pulses.BiotechnologyLetters.2009,31:221-226.(SCI)DaiD.Fan，L.-H.Wang，L.-A.Shangetal.AMicrocalorimetricMethodforStudyingtheBiologicalEffectsofMg2+IononRecombinantEscherichiacoli.ChemicalBiochemicalEngineering,2008,22(3):363-368.(SCI)DAIDFAN,LIHWANG,LONGASHANG,HUIJSHI,XIAOXMA,YUMI,LIFGU,KANGZXU.AmicrocalorimetricmethodtostudytheeffectofkanamycinonthemetabolismofrecombinantEscherichiacoliChemicalEngineeringCommunications,2007，194:1127-1137.(SCI)YanELuo,DaiDFan,LongAShang,HuiJShi,XiaoXMa,YuMi,GuiFZhao.AnalysisofmetabolicfluxinEscherichiacoliexpressinghuman-likecollageninfed-batchculture,Biotechnologyletters,30(4):637-643,2008.(SCI,EI)DaiDFan,YaneLuo,YuMi,XiaoXMa,LonganShang.Characteristicsoffed-batchculturesofrecombinantEscherichiacolicontaininghuman-likecollagencDNAatdifferentspecificgrowthrates.BiotechnologyLetters,2005,27:865–870.(SCI,EI)LUOYane,FANDaidi,MAXiaoxuan,WANGDewei,MIYu,HUAXiufuandLIWenhong.ProcessControlforProductionofHuman-likeCollageninFed-batchCultureofEscherichiacoliBL21.ChineseJ.Chem.Eng.,2005,13(2):276-279.(SCI,EI)HUAXiufu,FANDaidi,LUOYane,HANGXI,SHIHuijuan,MIYu,MAXiaoxuan,SHANGLong'an,ZHAOGuifang.KineticsofHighCellDensityFed-batchCultureofRecombinantEscherichiacoliProducingHuman-likeCollagen.ChineseJ.Chem.Eng.,2006,14(2):242-247.(SCI,EI)……60余篇SCI文獻報道類人膠原蛋白的專業(yè)水準(zhǔn)XiaoxuanMa,Daidi29類人膠原蛋白的專業(yè)水準(zhǔn)國家自然科學(xué)基金：工程控制策略有效解除大腸桿菌培養(yǎng)過程中乙酸抑制機理探索（21076169）國家自然科學(xué)基金：周期性饑餓協(xié)迫對重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)的影響（31000019）國家自然科學(xué)基金：重組類人膠原蛋白大腸桿菌表達體系高密度發(fā)酵的代謝調(diào)控及動力學(xué)（20606026）國家自然科學(xué)基金：重組E.coli類人膠原蛋白表達體系多聚體現(xiàn)象研究(20476085)國家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程發(fā)展計劃：基因工程技術(shù)生產(chǎn)類人膠原蛋白生物材料高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程[發(fā)改高計(2004)2563]國家科技部863計劃：重組類人膠原蛋白Ⅱ可降解材料制造關(guān)鍵技術(shù)及應(yīng)用(2006AA02Z246)國家科技部創(chuàng)新基金：重組基因工程菌生產(chǎn)類膠原蛋白(01C26216110599)國家火炬計劃：類人膠原蛋白(2002EB021307）利用重組類人膠原礦化仿生制備骨修復(fù)材料及應(yīng)用(2007AA03Z456)類人膠原蛋白人工血管體外構(gòu)建過程的工程學(xué)（20776119）新型有機無機雜化納米生物功能材料復(fù)合制備及控制機理（21006079）……13項國家級科研項目類人膠原蛋白的專業(yè)水準(zhǔn)國家自然科學(xué)基金：工程控制策略有效解除30類人膠原蛋白的專業(yè)水準(zhǔn)一種類人膠原蛋白及其生產(chǎn)方法。專利號：