第十二章 動物干細胞技術(shù)簡介

第十二章動物干細胞技術(shù)簡介第一節(jié)干細胞簡介干細胞的定義自我更新和分化潛能的細胞,在細胞發(fā)育過程中處于較原始階段.干細胞的分類干細胞有兩方面區(qū)別于其它細胞的特征：

1，可分化為與自身完全相同的細胞，2，可生產(chǎn)出特異性分化的細胞。

根據(jù)個體發(fā)育過程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細胞可分為兩類：胚胎干細胞及成體干細胞。1.帶間充質(zhì)干細胞：大量存在于臍帶組織中，具有胚胎干細胞類似的增殖能力和多向分化潛能，來源豐富、取材方便、無道德倫理爭議，可獲取的細胞數(shù)量多、活力強，療效顯著，可以擴增和傳代，同時又沒有配型、排斥等問題，不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細胞的理想替代物，也是最具臨床應(yīng)用前景的多能干細胞。2.骨髓間充質(zhì)干細胞：人體骨髓干細胞細胞數(shù)量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，從自體骨髓提取間充質(zhì)干細胞，雖然技術(shù)門檻比較低，但需要抽取病人大量骨髓（往往難以做到），其干細胞數(shù)量也難以穩(wěn)定滿足臨床治療的要求。因此骨髓間充質(zhì)干細胞有一定的局限。3.臍帶血干細胞：臍帶血除了包含正常血液的紅細胞、白細胞，淋巴細胞外，還包含單個核細胞、造血干細胞。目前最具應(yīng)用價值的是利用臍血中的造血干細胞治療白血?。ü撬枰浦玻?。利用臍帶血所含的單個核細胞和造血干細胞治療血液病以外的疾病，由于所含干細胞數(shù)量稀少（僅占臍血細胞的0.98%），雖然有一定的治療效果，但不能等同于真正意義上的間充質(zhì)干細胞治療，可作為間充質(zhì)干細胞治療的補充。4.胚胎干細胞：存在于早期胚胎，獲取胚胎干細胞來源比較困難，道德倫理風(fēng)險不容忽視，因此胚胎干細胞在臨床治療中使用頗受爭議,胚胎干細胞，又稱全能干細胞，存在于未發(fā)育成熟的胚胎，高水平表達端粒酶，可分化為除構(gòu)成臍胎盤，臍帶等之外的任何一種特定類型細胞。即能長成動物的任何組織和器官。(1)全能性干細胞它具有形成完整個體的分化潛能。如胚胎干細胞，具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)特征和很強的分化能力，可以無限增殖并分化成為全身200多種細胞類型，進一步形成機體的所有組織、器官。

(2)多能性干細胞這種干細胞具有分化出多種組織細胞的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。骨髓多能造血干細胞是典型的例子，它可分化出至少12種血細胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細胞。

(3)單能干細胞也稱專能或偏能干細胞。這類干細胞只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細胞分化，如上皮組織基底層的干細胞、肌肉中的成肌細胞或叫衛(wèi)星細胞。第二節(jié)胚胎干細胞的特性形態(tài)學(xué)特征ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細胞核大，有一個或幾個核仁，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)胞漿少，結(jié)構(gòu)簡單。體外培養(yǎng)時，細胞排列緊密，呈集落狀生長。用堿性磷酸酶染色，ES細胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細胞呈淡黃色。細胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細胞彼此界限不清，細胞表面有折光較強的脂狀小滴。細胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀。小鼠ES細胞的直徑7μm～18μm，豬、牛、羊ES細胞的顏色較深，直徑12μm～18μm。特異性標志分子的表達ES細胞的全能性指ES細胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細胞具有發(fā)育成完整動物體的能力，可以為細胞的遺傳操作和細胞分化研究提供豐富的試驗材料。ES細胞發(fā)育全能性的標志是ES細胞表面表達時相專一性胚胎抗原（Stagespecificembryonicant，SSEA），而且可以檢查到OTC4基因的表達，這兩種蛋白是發(fā)育全能性的標志。ES細胞中AKP及端粒酶活性較高，可用于ES細胞分化與否的鑒定。ES細胞的多能性是指ES細胞具有發(fā)育成多種組織的能力，參與部分組織的形成。將ES細胞培養(yǎng)在不含分化抑制物的培養(yǎng)基上，可以形成類胚體。將ES細胞在特定培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可以定向分化成特定組織，如ES細胞在含有白血病抑制因子（LIF）和維生素A酸（RA）的培養(yǎng)基上，可以分化形成全壁內(nèi)胚層，將ES細胞與胚胎細胞共培養(yǎng)或?qū)S細胞注入囊胚腔中，ES細胞就會參與多種組織的發(fā)育。細胞周期的特征端粒酶一種自身攜帶模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，RNA組分中含有一段短的模板序列與端粒DNA的重復(fù)序列互補，而其蛋白質(zhì)組分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA的合成，將其加到端粒的3′端，以維持端粒長度及功能。第三節(jié)胚胎干細胞的分離培養(yǎng)分化抑制物的選擇和培養(yǎng)基的設(shè)計早期胚胎的選擇及培養(yǎng)分離及培養(yǎng)過程ES細胞的鑒定ES細胞的冷凍保存ES細胞系的建立及保存第四節(jié)胚胎干細胞的定向分化胚胎性干細胞定向分化的常用策略分化細胞的鑒定與純化干細胞應(yīng)用細胞替代治療角膜病、糖尿病、帕金森病實例組織替代治療如皮膚、軟組織、骨骼等組織病變器官替代無排斥反應(yīng)的器官移植干細胞培植眼角膜進行眼角膜移植修補手術(shù)干細胞培植心肌細胞治療原發(fā)性心臟病骨髓干細胞可以自行轉(zhuǎn)移到人腦，并可以轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ荦R全的腦細胞治療腦損傷、老年癡呆癥以及帕金森氏綜合癥

骨髓間充質(zhì)干細胞加入造血干細胞造血干細胞增殖分化雙刃劍人類基因組計劃引發(fā)倫理、法律和社會問題克隆人與人獸雜交克隆造成倫理觀念的沖擊生物技術(shù)被別有居心者的使用動物胚胎干細胞的分離培養(yǎng)技術(shù)

EmbryonicStemcells（EScells）一、概述二、胚胎干細胞研究的意義三、胚胎干細胞研究的歷史四、胚胎干細胞分離培養(yǎng)的基本程序五、胚胎干細胞技術(shù)目前存在的問題和發(fā)展遠景胚胎干細胞技術(shù)

EmbryonicStemcells(EScells)一、概述哺乳動物胚胎干細胞（embryonicstemcells,ES細胞）一般是指從早期胚胎經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)分離出來的具有全能性的細胞。ES細胞是由Evans和Kauf-man1981年首次從延遲小鼠囊胚中分離出來的多能性細胞，當時稱之為EK細胞。以后稱之為胚胎干細胞。人胚胎干細胞分離技術(shù)途徑ICMPGCsES細胞的特點：ES細胞具有胚胎細胞的特性，在形態(tài)上表現(xiàn)為體積小、核大，核仁突出，培養(yǎng)時呈克隆狀生長；在功能上，ES細胞具有發(fā)育的全能性，即具有分化為成年動物體內(nèi)任何一種細胞類型的能力。ES細胞具有細胞系的特征，在飼養(yǎng)層上能維持未分化狀態(tài)并實現(xiàn)自我更新。因為可無限增殖，也可冷凍保存。二、胚胎干細胞研究的意義ES細胞在哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究中極有價值的工具；ES細胞是研究細胞分化的理想手段；圖ES細胞是研究基因功能的首選細胞；Es細胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的主要途徑之一；ES細胞治療技術(shù)將引起一場醫(yī)學(xué)革命；ES細胞可用于研究細胞癌變機理和新藥物的篩選。二、胚胎干細胞研究的歷史1、1981年Evans和Kaufman獲得小鼠ES細胞系2、1988年Doetschman獲得倉鼠ES細胞系3、1994年Wheeler和Robert獲得豬ES細胞系4、1998年Thomson獲得人的ES細胞系5、2007年日本的Yamanaka研究小組和美國的JamesThomson研究小組分別獲得誘導(dǎo)多能性干細胞（inducedpluripotentstemcell，iPS細胞）四、胚胎干細胞分離培養(yǎng)的基本程序(一)選擇抑制細胞分化的培養(yǎng)體系1、飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系2、條件培養(yǎng)體系3、培養(yǎng)液中添加分化抑制因子體系四、胚胎干細胞分離培養(yǎng)的基本程序（二）早期胚胎的選擇（三）胚胎干細胞的分離（四）胚胎干細胞的保持（五）胚胎干細胞的鑒定（六）胚胎干細胞的分化潛力驗證五、胚胎干細胞技術(shù)目前存在的問題和發(fā)展遠景1、根據(jù)細胞的分化特點建立更有效的培養(yǎng)體系2、加強胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化研究3、提高家畜胚胎干細胞的分離水平4、加速胚胎干細胞在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第七節(jié)嵌合體Chimera

嵌合體動物：指由2個以上不同的受精卵或3個以上的配子相結(jié)合，有不同基因型的細胞群所構(gòu)成的復(fù)合體。嵌合體動物制作方法：1、集合（凝集）法：在卵裂階段使2個以上的胚胎發(fā)生粘著和結(jié)合。2、注入法：在臨近著床的胚泡期，用顯微操作方法將另一個體的細胞注入到囊胚腔中。

研究現(xiàn)狀：

家畜的嵌合體不但已在個體間和品種間取得成功（綿羊、牛等），而且在異種間也得到了活的后代，如綿山羊人工嵌合體，該技術(shù)對遺傳學(xué)研究具有重要意義，塑造特異性狀的新奇物種，從而為動物園展示了新的前景，嵌合體也被用來研究免疫學(xué)系統(tǒng)的機理。哺乳動物嵌合體生產(chǎn)基本方法示意圖12小鼠胚胎囊胚腔注入嵌合法嵌合體豬Femalepiglet6899developedfromaDuroc-Pietrain

blastocyst(redandblackpigmentation)injectedwithGermanLand-racePGCs(whitepigmentationonheadandlegs).

(B)Chimericpiglets7003(male)and7006(female)withredareasacrossthebackdevelopedfrom‘‘red’’DuroccellsinjectedintoLandraceblastocysts.誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細胞的研究里程碑式的科學(xué)突破細胞重編程的研究概況核移植核移植試驗最初是在兩棲動物中實現(xiàn)的，通過將體細胞核注入到去核卵母細胞中。迄今，人們已經(jīng)獲得了多種核移植動物，也建立了來源于核移植胚胎的胚胎干細胞系。體細胞核移植試驗也具有很大的局限性克隆的效率極低產(chǎn)生的許多后代在各個階段都體現(xiàn)出嚴重的發(fā)育異常由于需要卵母細胞，核移植實驗在人類中的應(yīng)用受到強烈的倫理學(xué)質(zhì)疑這些不足，都制約了核移植技術(shù)的進一步發(fā)展和應(yīng)用。

將成熟的體細胞與多潛能的細胞（ES細胞、胚胎癌細胞等）融合，或者用胚胎干細胞提取物來處理體細胞，也可以在一定程度上使體細胞發(fā)生重編程。利用這兩種方法，可以實現(xiàn)某些多功能性標志分子的重新表達和多種分化潛能的獲得。但是，體細胞與多能性細胞的融合率較低，融合之后的細胞具有兩套染色體，并且在移植后會發(fā)生排斥現(xiàn)象，這就制約了細胞融合的臨床應(yīng)用。有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學(xué)諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？里程碑式的科學(xué)突破2006年11月20日，日本京都大學(xué)的山中伸彌（ShinyaYamanaka)和美國威斯康星大學(xué)的詹姆斯·湯姆森（JamesThomson）分別在《細胞》和《科學(xué)》雜志上發(fā)表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細胞改造成了類胚胎干細胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細胞相媲美。詹姆斯·湯姆森小組的論文發(fā)表在11月20日的《科學(xué)》雜志上俞君英是11月20日《科學(xué)》雜志論文的第一作者2006年8月，日本科學(xué)家山中伸彌小組首先在小鼠身上取得成功誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細胞2006年，Takahashi和Yamnaka將幾個轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化的小鼠皮膚成纖維細胞，進而獲得了類似于胚胎干細胞的多能性干細胞，稱之為“誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細胞”（inducedpluripotentstemcells,iPS細胞）。這一研究明確地證實了分化的細胞可以通過少數(shù)幾個因子的外源導(dǎo)入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)，因而受到了整個生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。在研究誘導(dǎo)多功能性干細胞產(chǎn)生的原理機制之前，先了解一下體細胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細胞的研究進展體細胞重編程的過程體細胞重編程的原理體細胞不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細胞的方法成體細胞核的重編程1.核重編程：核移植后供體核停止本身的基因表達程序，恢復(fù)為胚胎發(fā)育所必需的胚胎化基因表達程序狀態(tài)。此過程包括：染色體結(jié)構(gòu)重建、DNA甲基化、組蛋白乙?；?、印記基因表達、端粒長度恢復(fù)、X染色體失活等。1.1.DNA甲基化1.2.合子型基因的重新激活，如：Oct-42.重塑核結(jié)構(gòu)主要有包括核纖層A、B、C三種核纖層蛋白的重塑3.細胞質(zhì)重編程—miRNAmiRNA是決定細胞分化方向的因子。細胞中miRNA成分的改變能提高細胞對調(diào)節(jié)基因表達重編程。接下來，介紹一下體細胞重編程不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細胞的方法之一：通過特定基因的表達將體細胞重編程過程逆轉(zhuǎn)為干細胞?！盎蛑匦戮幣偶夹g(shù)”，借助“逆轉(zhuǎn)錄酶病毒”為載體,即向皮膚細胞中植入一組4個基因(Oct4,Sox2,c-myc和Klf4)，通過基因重新編排，使皮膚細胞具備胚胎干細胞的功能。這種被改造過的細胞稱作“iPS細胞”。下面簡單介紹一下這些研究中所用到的多能性相關(guān)因子Oc