分子雜交印跡技術(shù)

分子雜交印跡技術(shù)SouthernblottingEdwinSouthern在1975年提出的分子印跡概念，使用膠、尼龍膜和吸水紙去鑒定一個(gè)復(fù)雜個(gè)體中特定的DNA序列

Northernblotting1977年，GeorgeStark等發(fā)明，檢測(cè)RNA1979年，GeorgeStark發(fā)展出早期的蛋白印跡技術(shù)，將蛋白從電泳凝膠上轉(zhuǎn)移到活化的纖維素上隨后，HarryTowbin發(fā)展出更快速、簡單的電轉(zhuǎn)技術(shù)。1981年，W.NealBurnette正式將這一技術(shù)命名為“WesternBlot”。（Nowinski

ofWestCoast）

Westernblotting

Western免疫印跡電泳轉(zhuǎn)移雜交顯色限制性內(nèi)切酶酶切DNA溶液

RNA樣品蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到NC膜后與標(biāo)記的探針雜交轉(zhuǎn)移到NC膜or尼龍膜后與標(biāo)記的探針雜交轉(zhuǎn)移到NC膜orPVDF膜后與標(biāo)記的探針雜交DNA印跡RNA印跡蛋白質(zhì)印跡免疫技術(shù)Westernblotting（免疫印跡技術(shù)）免疫組化Elisa

(enzyme-linkedimmunosorbentassay)三種免疫技術(shù)的比較檢測(cè)樣本樣本處理電泳固相載體轉(zhuǎn)印顯色觀察檢測(cè)目的免疫印跡蛋白質(zhì)混合溶液中目的蛋白SDS

NC膜、PVDF膜濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)化學(xué)、熒光掃描儀定性免疫組化細(xì)胞或組織固定、包埋、切片、脫蠟、水化

載玻片化學(xué)顯微鏡定位Elisa血清、血漿、尿液、細(xì)胞或組織培養(yǎng)上清液微孔板化學(xué)酶標(biāo)儀定量免疫印跡（WesternBlot）的目的？

目的蛋白是否存在在樣品當(dāng)中；蛋白質(zhì)的分子大??；

分子量的改變；蛋白質(zhì)的表達(dá)情況：上調(diào)或下調(diào)？在不同的樣品中，如疾病和正常的樣品之間的表達(dá)差異性。WesternBlot檢測(cè)蛋白的優(yōu)勢(shì)相對(duì)看家蛋白的校正定量的重要性首先它消除了每個(gè)通道上相同的樣品量的不確定性和誤差，有時(shí)候我們?cè)谏蠘拥臅r(shí)候會(huì)發(fā)生樣品丟失，樣品中的看家蛋白就可以起到歸一化校正，從而可以精確的定量目的蛋白

它消除了膜上探針的剝離和再雜交的不確定性。因?yàn)樵趧冸x和再雜交的過程中，會(huì)丟失掉許多蛋白的信息，這往往是非常難以控制的

可以更精確定量總蛋白里的磷酸化蛋白，如非磷酸化蛋白和磷酸化蛋白的比較

免疫印跡（WesternBlot）的基本原理免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)組分經(jīng)SDS分離后，平行轉(zhuǎn)移到固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，通過免疫試劑來檢測(cè)靶蛋白。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測(cè)。

免疫印跡（WesternBlot）的基本原理

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是一抗，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的一抗起免疫反應(yīng)，再與酶、同位素或紅外熒光標(biāo)記的二抗反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色、放射自顯影或紅外熒光掃描儀檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。WesternBlot的基本步驟WesternBlot的檢測(cè)結(jié)果免疫印跡（WesternBlot）的基本步驟(一)蛋白質(zhì)樣品的制備：

裂解液裂解超聲煮沸冷凍免疫印跡（WesternBlot）的基本步驟1組織的處理方法：PBS洗滌，液氮研磨，180W，6min，0℃超聲波破碎，5000rpm，離心5min，取上清。加入上樣緩沖液煮沸5min，-20℃分裝保存

2細(xì)胞的處理方法：離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，180W,6min，0℃超聲波破碎，5000rpm，離心5min，取上清。也可以直接加入細(xì)胞裂解液，0℃裂解20min，加入上樣緩沖液煮沸5min，分裝后于-20℃保存使用前加入1-4mMPMSF裂解液

?1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5ml

?NaCl0.438g

?TritonX-1000.5ml

?蒸餾水至50ml

?混勻后4℃保存。使用時(shí)，加入PMSF至終濃度為100μg/ml50mMTris-HClpH7.4150mMNaCl1mMEDTA1%Tritonx-1001%脫氧膽酸鈉0.1%SDS

使用時(shí)加入PMSFRIPA（radioimmunoprecipitationassay）裂解液蛋白定量方法

Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）BCA法

定氮法紫外吸收法

Lowry法（Folin-酚試劑法）考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律，因此可以通過測(cè)定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。

操作方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取10支試管，分兩組按下表平行操作。試管編號(hào)0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

標(biāo)準(zhǔn)蛋白(uL)051015202530待測(cè)蛋白質(zhì)溶液(uL)NS(uL)100959085807570考馬斯亮藍(lán)(uL)900900900900900900900900900900

混勻，595nm處測(cè)定OD595nm以O(shè)D595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)，根據(jù)所測(cè)定的OD595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。

1976年由Bradford建立的考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），它的原理是考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。與其他幾種方法比較有很多突出優(yōu)點(diǎn)，因而得到廣泛的應(yīng)用。Bradford法實(shí)驗(yàn)原理1.靈敏度高比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。2.測(cè)定快速、簡便由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。3.干擾物質(zhì)少如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測(cè)定法。

Bradford法的優(yōu)點(diǎn)Bradford法的缺點(diǎn)

1.由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)選用G-球蛋白(通常用BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。2.仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑如TritonX-100、SDS和0.1N的NaOH3.標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。BCA法實(shí)驗(yàn)原理Bicinchoninicacid(BCA)法是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu+。BCA與Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測(cè)定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。BCA法試劑的配制1.試劑A：1％BCA二鈉鹽

2％無水碳酸鈉

0.16%酒石酸鈉

0.4％氫氧化鈉

0.95％碳酸氫鈉混勻，pH值：11.25

2.試劑B：4％硫酸銅

3.BCA工作液：試劑A:試劑B=50:1

4.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液：BSA，1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

試劑１２３４５

空白管測(cè)定管蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(1.5mg/ml)

05102040雙蒸水(mg)10095908060待測(cè)樣品(mg)100BCA工作液(ml)2222222BCA法優(yōu)點(diǎn)1.

操作簡單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；2.準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10μg/ml。

3.經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；

4.抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無影響；

缺點(diǎn)是工作液的配制比較麻煩。

特點(diǎn)免疫印跡（WesternBlot）的基本步驟（二）電泳：制備不連續(xù)電泳凝膠，進(jìn)行SDS

Tris/GlycineSDS通常在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行，其電泳緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于制膠緩沖液，當(dāng)兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動(dòng)界面，并帶動(dòng)加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推動(dòng)，樣品通過濃縮膠后，復(fù)合物在分離膠表面凝聚成一很薄的區(qū)帶。由于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的成分全部濃縮成很小體積的能力，故大大提高了SDS的分辨率。（二）電泳：制備不連續(xù)電泳凝膠，進(jìn)行SDS

1.分離膠的配制(15ml)：(12%分離膠)ddH2O：4.9ml30%儲(chǔ)備膠：6.0ml1.5MTris-HCl：3.8ml(pH8.8)

10%SDS：0.15ml

10%AP：0.15mlTEMED：6μl2.濃縮膠的配制(4ml)(4%濃縮膠)ddH2O：2.8ml30%儲(chǔ)備膠：0.66ml1.0MTris-HCl：0.5ml(pH6.8)

10%SDS：0.04ml

10%AP：0.04mlTEMED：4μl免疫印跡（WesternBlot）的基本步驟免疫印跡（WesternBlot）的基本步驟3.上樣4.電泳上電極緩沖液下電極緩沖液樣品槽上樣器陰極陽極電泳方向聚丙烯酰胺凝膠板垂直電泳裝置免疫印跡（WesternBlot）的基本步驟（三）轉(zhuǎn)移：

1膠條平衡20min;

2膜平衡20min;

3轉(zhuǎn)膜：恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr;4標(biāo)記膜免疫印跡（WesternBlot）的基本步驟（三）轉(zhuǎn)印

放置順序如下：

陰極（頂部）三層轉(zhuǎn)印緩沖液浸濕的吸水紙用轉(zhuǎn)印緩沖液浸濕聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印緩沖液浸濕的硝酸纖維素膜(PVDF膜)三層轉(zhuǎn)印緩沖液浸濕的吸水紙

陽極(底部)●考馬斯亮蘭染色轉(zhuǎn)印結(jié)束后,將凝膠放入平皿中,加入考馬斯亮藍(lán)染色液。室溫下振搖20min。去除染色液,收集保存可重復(fù)使用多次?！衩撋?/p>

免疫印跡（WesternBlot）的基本步驟（四）免疫反應(yīng)：

1、封閉非特異性的結(jié)合位點(diǎn)，室溫封閉1-2小時(shí)或

4℃過夜。2、一抗與抗原反應(yīng)。

3、二抗與一抗反應(yīng)。

4、顯色Odyssey掃描結(jié)果實(shí)驗(yàn)室常用的幾種檢測(cè)方法化學(xué)發(fā)光（顯色）底物顯色（顯色）紅外熒光掃描（Odyssey掃描)DAB顯色法原理：DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）和HRP反應(yīng)產(chǎn)生棕色的不溶終產(chǎn)物。

化學(xué)發(fā)光法（ECL）

原理：在二抗上偶聯(lián)辣根過氧化物酶，然后加入底物。底物在酶的作用下，可以發(fā)出很強(qiáng)的光信號(hào)，在暗房中可對(duì)X-光片感光?；瘜W(xué)熒光法

原理：通過在二抗上標(biāo)記熒光染料，在相應(yīng)儀器設(shè)備上通過固定波長激光激發(fā)后系統(tǒng)采集染料發(fā)出熒光信號(hào)。

WesternBlot常見檢測(cè)方法

不同檢測(cè)方法比較DAB顯色法操作簡便，無需暗房和顯影設(shè)備，顯色直觀，最為大家熟悉當(dāng)數(shù)辣根過氧化物酶HRP和堿性磷酸酶AP，但靈敏度較低，國外已不常見?；瘜W(xué)發(fā)光法（ECL）比底物顯色法靈敏度高，可達(dá)ng水平。但由于是酶促反應(yīng)，不同曝光時(shí)間得到的信號(hào)與樣品量不成線性關(guān)系。定量不夠準(zhǔn)確?；瘜W(xué)熒光法操作簡單，信號(hào)持久，可進(jìn)行精確定量不同檢測(cè)方法比較Odyssey:膜+一抗孵育+熒光標(biāo)記抗體孵育+Odyssey掃描成像ECL:膜+一抗孵育+酶聯(lián)二抗孵育+底物顯色+

UVP掃描成像化學(xué)發(fā)光法

1）將兩種顯色底物1：1等體積混合。

2）將混合物覆蓋在膜表面，1-2分鐘，搖晃使均勻。

3）用保鮮膜把膜包起來，放入夾板中。

4）在暗室中將X光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1min。

5）顯影、定影。

6）根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時(shí)間和曝光區(qū)域，得到最佳結(jié)果。

底物顯色法

辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01MPBS稀釋），平穩(wěn)搖動(dòng)，室溫2hr。棄二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

二氨基聯(lián)苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性產(chǎn)物，靈敏度高，特異性好，缺點(diǎn)就是需要現(xiàn)配現(xiàn)用，顯色后光照數(shù)小時(shí)會(huì)褪色，不能永久保存，需要拍照記錄，而且有毒。

Odyssey進(jìn)行掃描封閉室溫封閉1-2小時(shí)或4過夜。封閉液稀釋的一抗中孵育。用PBS-T搖床洗膜。封閉液稀釋的二抗中孵育，膜在二抗中室溫振蕩2小時(shí)，洗膜（避光）。用PBS洗去膜上殘留的Tween-20，直接通過Odyssey進(jìn)行掃描。Odyssey掃描結(jié)果700nmchannel800nmchannel700and800OverlayOdyssey掃描雙色成像

可用兩種不同波長的紅外染料對(duì)不同的生物分子（蛋白或核酸）標(biāo)記和同時(shí)檢測(cè)，雜交檢測(cè)條件均等，數(shù)據(jù)對(duì)比性強(qiáng)，結(jié)果直觀。兩種染料的最大發(fā)射波長相差100nm，無光譜重疊，因此可用于進(jìn)行兩種信號(hào)間精確的量化分析。紅外熒光掃描成像系統(tǒng)"TheOdysseyreallyspeedsupourapplication,sowegetfasterresults.Ihaven'tusedECLeversincetheOdysseyarrived." -StanimirIvanov,BrownUniversity實(shí)驗(yàn)結(jié)果MarkerS1S2S3S4MarkerS1S2S3S4Odyssey結(jié)果

ECL結(jié)果

結(jié)論Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)具有更好的線性關(guān)系和更精確的定量結(jié)果Odyssey和ECL的相對(duì)靈敏度相差不大Odyssey掃描圖能同時(shí)看到Marker和目標(biāo)蛋白，ECL看不到Marker微孔板In-CellWestern分析

利用Odyssey紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行的ICW是高通量信號(hào)傳導(dǎo)通路分析和藥物篩選的最佳選擇。Odyssey可以直接對(duì)96或384孔板內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行精確的定量檢測(cè)。ICW使用紅外標(biāo)記的二抗直接標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)蛋白，量化微孔板每個(gè)孔內(nèi)的熒光信號(hào)。不僅節(jié)約時(shí)間，提高檢測(cè)效率，還避免了傳統(tǒng)WB易出錯(cuò)的操作步驟，例如裂解細(xì)胞、凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜等。微孔板In-CellWestern分析

OdysseyICW軟件可用來掃描微孔板、樣品定位、精確定量以及數(shù)據(jù)分析。每個(gè)檢測(cè)通道的熒光圖像可獨(dú)立顯示，并采用不同顏色（紅色和綠色）。當(dāng)兩個(gè)圖像相互重疊時(shí)，通過顏色的變化可計(jì)算蛋白的修飾化程度。

微孔板In-CellWestern分析

In-CellWesternDetection

In-CellWesternAnalysis

注意事項(xiàng)：

1、一抗、二抗的稀釋度、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳條件。

2、顯色液必須新鮮配置使用，最后加H2O2。

3、DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì)。4、Odyssey進(jìn)行掃描時(shí)，封閉時(shí)切勿加入Tween-20，在未結(jié)束封閉之前膜不能和Tween-20有任何接觸，否則會(huì)造成背景過高In-GelWesternDetection電泳后無須轉(zhuǎn)膜

異丙醇預(yù)處理膠

抗體1and2孵育洗滌

直接掃描In-GelWesternDetectionOdysseyIn-GelWesternChemiluminescentIn-GelWestern

系列稀釋的轉(zhuǎn)鐵蛋白做抗原，兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白一抗，Alexa680標(biāo)記的羊抗兔二抗（Odyssey)化學(xué)發(fā)光法是用辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase）標(biāo)記的

羊抗兔二抗.

NotransferorblockingNoexpensivekitsIdealfordetectinghard-to-transferproteinsQualitativedetectionWesternblot常見問題

1、一抗如是多抗，可以試著降低一抗的濃度，如一抗是單抗，可適當(dāng)降低二抗的濃度

2、最重要的是確保封閉的充分，封閉最好時(shí)間長點(diǎn)，至少2小時(shí)室溫封閉，時(shí)間允許可4℃過夜封閉

3、洗膜一定要充分,一般PBS-T10分鐘3次，DAB顯色時(shí)，背景過深，DAB顯色時(shí)間不要過長，一般2分鐘足矣。

4、設(shè)陰性和陽性對(duì)照。這樣出來的帶該在哪個(gè)位置，不該在哪個(gè)位置一目了然

雜帶多膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對(duì)齊Westernblot常見問題轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè)凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？

可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。可在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫Westernblot常見問題背景太高膜或者緩沖液污染封閉不充分膜沒有均勻浸濕抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高

原因?qū)Σ咿D(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度Westernblot常見問題Westernblot常見問題1、技術(shù)問題（1）電泳（2）轉(zhuǎn)膜2、抗體問題（特異性、濃度）3、蛋白質(zhì)豐度4、熒光淬滅沒有條帶1、背景過深2、抗體特異性3、洗膜時(shí)間Westernblot常見問題Westernblot常見問題1、加樣量2、ECL試劑3、曝光時(shí)間Westernblot常見問題蛋白質(zhì)降解？內(nèi)參Westernblot常見問題4：加樣量過多6：加樣量偏少Westernblot常見問題

免疫組化和WesternBlot可以用同一種抗體嗎？

免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些是線性的，而有的屬于構(gòu)象型。線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識(shí)