dna重組技術(shù)的研究進(jìn)展

dna重組技術(shù)的研究進(jìn)展

現(xiàn)代生物學(xué)研究需要對(duì)dna技術(shù)的重組。細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA重組現(xiàn)象,稱(chēng)為體內(nèi)(invivo)重組。由于新技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)在可以由人工操作在細(xì)胞外進(jìn)行DNA重組,稱(chēng)為體外(invitro)重組。人工重組的DNA分子可以送回到活細(xì)胞里面去。經(jīng)典遺傳學(xué)揭示出細(xì)胞的染色體上存在著基因(gene),即DNA分子上一段特定的核苷酸序列,具有重組、突變、轉(zhuǎn)錄和對(duì)其他DNA片段有調(diào)控作用的遺傳學(xué)功能,它是不同物種以及同一物種的不同個(gè)體表現(xiàn)出不同性狀的根本原因?；蛲ㄟ^(guò)DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代,并通過(guò)控制蛋白質(zhì)的合成使遺傳信息得以表達(dá)。如果重組的DNA是具有功能的基因,就可以通過(guò)表達(dá)而使受體表現(xiàn)新性狀。所謂基因工程(geneengineering)或生物技術(shù)(biotechnology)就是運(yùn)用重組DNA技術(shù)改變物種的基因,進(jìn)而改造出人們所期望的生物性狀,并使之穩(wěn)定地遺傳給下一代。重組DNA技術(shù)在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生等基礎(chǔ)研究和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥保健等實(shí)際應(yīng)用兩方面均有重要意義。通過(guò)DNA的重組獲得基因的克隆是研究基因的結(jié)構(gòu)、功能及演化的基礎(chǔ)?；蚩寺〖夹g(shù),又被稱(chēng)為分子克隆技術(shù)、重組DNA技術(shù)、基因工程、基因操作或基因的無(wú)性繁殖等。在整個(gè)基因克隆的過(guò)程中,DNA的重新組合是一個(gè)十分關(guān)鍵的步驟,它直接決定著整個(gè)克隆的成功與否。隨著時(shí)間的推移,研究的深入,越來(lái)越多的DNA重組方法被應(yīng)用到生產(chǎn)和科研當(dāng)中。為了進(jìn)一步闡明及比較各種DNA重組方法的異同和優(yōu)劣,本文就目前已報(bào)道的DNA重組技術(shù)進(jìn)行了概述,重點(diǎn)闡述了各自的原理、步驟、特點(diǎn)及實(shí)際應(yīng)用等方面。1重組子和克隆經(jīng)典克隆方法產(chǎn)生于20世紀(jì)70年代初,是最早應(yīng)用的基因克隆方法,它要求首先需從細(xì)胞或組織中分離并獲得含有目的基因的DNA片段,然后利用能識(shí)別特異DNA序列的限制性?xún)?nèi)切核酸酶(restrictionendonuclease)切斷DNA雙鏈,產(chǎn)生兩個(gè)單鏈黏性末端(stickyend)或平齊末端(bluntend),如果被插入的載體DNA具有相同的末端,那么在適宜的條件下,具有黏性末端的兩種片段可經(jīng)堿基間的氫鍵互補(bǔ)配對(duì),形成雙鏈DNA分子,再在DNA連接酶的作用下形成磷酸二脂鍵,連接成重組DNA分子,而具有平齊末端的兩種片段也可經(jīng)DNA連接酶的作用而組成重組DNA分子,然后在利用重組子轉(zhuǎn)化技術(shù)使該分子在宿主細(xì)胞中復(fù)制,產(chǎn)生多個(gè)完全相同的拷貝,即克隆(clone)。這種傳統(tǒng)的酶切-連接經(jīng)典克隆法,是比較通用且常規(guī)的方法,一直沿用至今。該方法也在獲取基因片段和開(kāi)發(fā)新的載體上不斷改進(jìn),如PCR技術(shù)的建立、基于測(cè)序和DNA合成技術(shù)使該法的適用性越來(lái)越廣,已成為最為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段之一。目前,研究人員已通過(guò)該方法獲得了大量包括植物、真菌、哺乳動(dòng)物、線(xiàn)蟲(chóng)等生物中重要基因和元件的克隆,如:錢(qián)麗等克隆得到了人腫瘤相關(guān)的β2m基因,并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá);張憲銀等克隆了水稻Gt1基因的啟動(dòng)子,并進(jìn)一步證實(shí)該元件具有胚乳特異性表達(dá)的功能。然而在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,這種方法的步驟顯得較為繁瑣,比較費(fèi)時(shí),有時(shí)對(duì)于某些片段失敗率較高,且缺乏DNA序列的一致性;而且在應(yīng)用上也有一定的限制,比如從擁有較大且富含重復(fù)序列的基因組中克隆某個(gè)基因,用這種方法就不太容易找到引物的設(shè)計(jì)位點(diǎn)和可利用的酶切位點(diǎn)。因此,分子生物學(xué)研究迫切需要新的DNA重組技術(shù)來(lái)快速并系統(tǒng)地進(jìn)行可利用基因的操作。2基于重組的隆慶方法2.1獨(dú)特的異質(zhì)重組技術(shù)2.1.1認(rèn)識(shí)到cre-lox的位點(diǎn)抑制劑Liu等于1998年首次報(bào)道了一種基于重組的基因克隆方法——UPS,開(kāi)啟了利用DNA序列間直接重組克隆基因的時(shí)代。該系統(tǒng)是催化含有目的基因片段的特殊載體——通用載體(pUNI)與含有相關(guān)調(diào)控信息的宿主載體(pHOST)之間質(zhì)粒融合。融合質(zhì)粒經(jīng)過(guò)選擇后,使目的基因受控于位于宿主載體上的新的啟動(dòng)子等調(diào)控元件,從而完成目的基因-表達(dá)載體的構(gòu)建。該克隆過(guò)程無(wú)需限制性?xún)?nèi)切核酸酶、DNA連接酶以及許多針對(duì)于亞克隆的體外操作,因而使得重組DNA分子的構(gòu)建過(guò)程更為快速和簡(jiǎn)便。該系統(tǒng)是建立在噬菌體Pl的Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組之上的質(zhì)粒融合系統(tǒng)。Cre基因的轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)物是一種位點(diǎn)特異性重組酶,能夠催化兩個(gè)34bp大小的loxP位點(diǎn)序列(5′-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3′)之間的重組,從而使環(huán)狀溶原性復(fù)制產(chǎn)物Pl二聚體分解。Cre不僅能在不同生物體如細(xì)菌、真菌及哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中行使功能,而且在體外也可催化重組反應(yīng),因此,這種由Cre-loxP介導(dǎo)的質(zhì)粒融合在體內(nèi)外均可發(fā)生。另外,UPS還能夠被用于整個(gè)DNA文庫(kù)與新表達(dá)載體的融合,從而產(chǎn)生出多個(gè)新的文庫(kù)。該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種生物中的基因研究,如王弘等構(gòu)建了一種以GFP為報(bào)告基因的釀酒酵母表達(dá)載體,并同時(shí)驗(yàn)證了其穩(wěn)定性、高效性和準(zhǔn)確性。2.1.2gatew技術(shù)的特點(diǎn)Gateway系統(tǒng)是Invitrogen公司于1999年推出的一種新的克隆策略,是由噬菌體λ整合酶催化的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng),由BP和LR兩個(gè)反應(yīng)組成,可表示為attB×attP←→attL×attR。介導(dǎo)重組反應(yīng)的4個(gè)att位點(diǎn)序列和相關(guān)蛋白是Gateway克隆技術(shù)的基礎(chǔ),它們能被λ和大腸桿菌編碼的克隆酶合劑特異識(shí)別,雙載體發(fā)生融合后,產(chǎn)生出新的質(zhì)粒表達(dá)載體。BP反應(yīng)是利用由λ基因組編碼的整合酶(integrase,Int)和由大腸桿菌編碼的整合宿主因子(integrationhostfactor,IHF)組成的BP克隆酶混和物催化一個(gè)帶有attB位點(diǎn)的DNA片段或表達(dá)克隆和一個(gè)帶有attP位點(diǎn)的供載體(donorvector)之間的重組反應(yīng),把目的片段及其兩端部分位點(diǎn)轉(zhuǎn)移至供載體中,創(chuàng)建一個(gè)入門(mén)克隆,其結(jié)構(gòu)為attL1-基因-attL2。同時(shí),供載體中的ccdB細(xì)胞死亡控制基因及其兩端部分位點(diǎn)被置換出來(lái),單獨(dú)或融合到表達(dá)載體中而形成副產(chǎn)物。LR反應(yīng)是利用由Int、IHF和由λ基因組編碼的切除酶(Xis)組成的LR克隆酶混和物催化一個(gè)帶有attL位點(diǎn)的入門(mén)克隆和一個(gè)帶有attR位點(diǎn)的目的載體之間的重組反應(yīng),使目的片段及其兩端部分位點(diǎn)取代目標(biāo)載體(destinationvector)的ccdB基因及其兩端部分位點(diǎn)而產(chǎn)生最終的表達(dá)克隆,其結(jié)構(gòu)為attB1-基因-attB2。副產(chǎn)物為帶有attP位點(diǎn)的供載體。LR反應(yīng)作為Gateway克隆的主要反應(yīng),可用來(lái)在平行的反應(yīng)中將一個(gè)或多個(gè)目的DNA片段在不同的表達(dá)平臺(tái)之間克隆、重組和轉(zhuǎn)移。目的DNA片段可以是cDNA、部分或完整的基因或者是基因組DNA,可通過(guò)用一對(duì)含有可利用酶切位點(diǎn)的特異引物進(jìn)行PCR,限制性核酸內(nèi)切酶的消化來(lái)制備,也可經(jīng)由設(shè)計(jì)一對(duì)含有attB位點(diǎn)的基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得。Gateway技術(shù)作為一種強(qiáng)大且高效的體外操作系統(tǒng),可應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物以及慢病毒等系統(tǒng)中進(jìn)行分析表達(dá)。自Gateway技術(shù)開(kāi)發(fā)并商業(yè)化以來(lái),在克隆基因及構(gòu)建蛋白質(zhì)表達(dá)載體等方面發(fā)揮了重要的作用。應(yīng)用該技術(shù),已成功克隆出擬南芥轉(zhuǎn)錄因子,在植物及病毒中構(gòu)建表達(dá)載體也非常便捷。能夠進(jìn)行與宿主無(wú)關(guān)的克隆及亞克隆是該技術(shù)的最大特點(diǎn)。由于在克隆的過(guò)程中,重組位點(diǎn)具有高度的專(zhuān)一識(shí)別性,使得重組反應(yīng)后目的基因的方向和開(kāi)放閱讀框能夠保持不變,而且陽(yáng)性率高;克隆酶及位點(diǎn)的不同構(gòu)成還可直接控制反應(yīng)的方向。另外,這種新穎的多功能的通用系統(tǒng)也可用于蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)化。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的成功表達(dá)和純化需要大量的宿主評(píng)估系統(tǒng),沒(méi)有一個(gè)單一的表達(dá)系統(tǒng)適合所有蛋白質(zhì)。優(yōu)化基因表達(dá)的最好方法是在多個(gè)系統(tǒng)中分析目的蛋白,通過(guò)比較分析,選定蛋白質(zhì)表達(dá)的最佳方案。2.1.3u2004端突變的方法:酶切-連接-重組于2004年推出且擁有美國(guó)GeneCopoeia公司及其合資企業(yè)廣州復(fù)能基因有限公司自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的RecJoin專(zhuān)利克隆技術(shù)是對(duì)Gateway技術(shù)的一個(gè)發(fā)展,即目的基因與目的載體的結(jié)合處一端采用Gateway重組的方法,即目的載體一端保留attR位點(diǎn);另一端采用經(jīng)典克隆的方法,即另一端attR位點(diǎn)被替換成酶切位點(diǎn)的序列,克隆的步驟大致為“酶切-連接-重組”。此方法首先在重組att位點(diǎn)與目的DNA片段之間設(shè)計(jì)適宜數(shù)量的核苷酸以構(gòu)成可利用且不影響基因與載體元件表達(dá)的酶切位點(diǎn),它們與基因特異序列連在一起構(gòu)成基因特異引物,與重組位點(diǎn)連在一起構(gòu)成接頭引物,這樣利用兩步PCR將重組位點(diǎn)引入到目的基因的兩端,無(wú)需設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的含有att位點(diǎn)序列的基因特異引物。得到的線(xiàn)性DNA產(chǎn)物既可以用來(lái)進(jìn)行BP反應(yīng)構(gòu)建入門(mén)克隆,而后通過(guò)RecJoin反應(yīng)將目的基因裝入表達(dá)載體中而獲得最終克隆;也可以直接進(jìn)行RecJoin反應(yīng)獲得表達(dá)克隆。利用該技術(shù)構(gòu)建的標(biāo)簽-ORF融合蛋白表達(dá)克隆,由于標(biāo)簽與ORF之間有時(shí)不會(huì)有重組位點(diǎn),這樣就可以減少由于多余氨基酸的產(chǎn)生而對(duì)融合蛋白造成的影響。目前已有研究證實(shí)了運(yùn)用此基因克隆技術(shù)對(duì)于相關(guān)目的蛋白表達(dá)的可靠性。2.2同源重組的影響同源重組是生物界普遍存在的生理現(xiàn)象,從噬菌體、細(xì)菌到真核生物都有能發(fā)生同源重組的種類(lèi)。宏觀(guān)上講,它有助于增加生物體的變異程度,從而推動(dòng)物種的進(jìn)化;從微觀(guān)上看,它有利于細(xì)胞對(duì)體內(nèi)壞基因的修復(fù)。如何把同源重組的方法應(yīng)用到基因克隆中成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外生物學(xué)家研究的熱點(diǎn)之一。2.2.1基于cy-pcr的同源替換重組質(zhì)粒Li和Elledge在2005年首次報(bào)道了一種快速構(gòu)建重組DNA分子的體內(nèi)克隆基因的方法——MAGIC。此方法首先將攜帶含有目的DNA片段的供體質(zhì)粒的一個(gè)細(xì)菌菌株和攜帶受體質(zhì)粒的細(xì)菌菌株進(jìn)行交配,使兩個(gè)質(zhì)粒位于同一個(gè)細(xì)胞內(nèi);然后,供體和受體質(zhì)粒經(jīng)核酸內(nèi)切酶Ⅰ——SceⅠ的消化,各形成兩個(gè)線(xiàn)性片段,進(jìn)而催化同源替換重組,導(dǎo)致重組后該DNA片段受控于受體質(zhì)粒中新的調(diào)控元件。不僅如此,Li和Elledge還利用電穿孔的方法將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中經(jīng)過(guò)MAGIC的模式獲得了該產(chǎn)物的表達(dá)克隆。在細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物中,通過(guò)MAGIC的方法也均能獲得目的基因與其他元件構(gòu)成的重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白。MAGIC構(gòu)建重組DNA不需要DNA的制備,也不需使用位點(diǎn)特異性重組酶,而且整合后非重組背景的水平較低。此方法最有前景的用途是全基因組中的基因操作。因?yàn)槲锓N測(cè)序完成后,根據(jù)鑒定到的基因,能夠通過(guò)MAGIC的方法將它們轉(zhuǎn)換成任何表達(dá)文庫(kù)。這不僅有助于功能基因組學(xué)的研究,而且有助于從基因組工程到蛋白質(zhì)組工程的研究。另外,Paddison等已運(yùn)用該克隆方法成功構(gòu)建了一系列短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的表達(dá)載體。2.2.2采用src催化同源重組Li和Elledge在2007年報(bào)道了一種不依賴(lài)基因序列和連接反應(yīng)的SLIC基因克隆方法。此方法通過(guò)RecA介導(dǎo)的體外同源重組(invitrohomologousrecombination)和不依賴(lài)RecA的單鏈退火(single-strandannealing,SSA)途徑可以將DNA片段整合在一個(gè)反應(yīng)體系中。體外同源重組過(guò)程利用T4DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性在插入片段以及載體片段的末端產(chǎn)生單鏈DNA突出末端,通過(guò)同源序列在體外完成交換重組,達(dá)到DNA片段的重新組合,進(jìn)而完成基因克隆的目的。不僅如此,他們還發(fā)現(xiàn)了SILC可有效地同時(shí)將5個(gè)或者10個(gè)DNA片段整合在一起。SILC的應(yīng)用,不僅避開(kāi)了一些傳統(tǒng)重組方法對(duì)序列的要求,而且當(dāng)在較低的DNA濃度時(shí),用RecA催化同源重組依然能夠很有效地發(fā)揮其作用,這種靈活性將為今后的合成生物學(xué)研究重組DNA的產(chǎn)生提供更多的可能性。白帆等在2008年通過(guò)大腸桿菌的藍(lán)白菌落篩選和對(duì)重組子的酶切分析,驗(yàn)證了利用SLIC方法克隆pUC18中的LacZ基因片段的可靠性,結(jié)果證明SLIC能夠使DNA片段在設(shè)計(jì)的位點(diǎn)處發(fā)生精確的重組。王中山等也通過(guò)SLIC的途徑克隆得到了大腸桿菌編碼細(xì)胞周質(zhì)底物結(jié)合蛋白gsiB基因。2.2.3重組dna分子Gibson等在2009年報(bào)道了另外一種DNA體外重組方法——等溫的單反應(yīng)方法。它要求在50℃條件下首先利用T5核酸外切酶5′端的外切活性在設(shè)計(jì)需要片段連接處產(chǎn)生單鏈DNA突出末端,然后利用PhusionDNA聚合酶和TaqDNA連接酶在單鏈DNA互補(bǔ)區(qū)域特異退火,從而將多個(gè)具有重疊區(qū)域的DNA分子重組在一起。這種整合方法在兩段線(xiàn)性DNA含有40bp以上的同源序列即可進(jìn)行,不僅可用于無(wú)縫構(gòu)建合成的或固有的基因,而且可以進(jìn)行大片段DNA的人工合成,是一種非常有用的分子克隆工具。2.2.4序列抑制劑序列的序列構(gòu)建及克隆技術(shù)流程Clontech公司出產(chǎn)的In-FusionPCRCloningKit和GenScript公司出產(chǎn)的CloneEZPCRCloningKit都是運(yùn)用擁有各自專(zhuān)利的酶產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行線(xiàn)性DNA末端有15個(gè)堿基同源序列的多個(gè)目的片段的重組結(jié)合。二者原理基本相同,以In-Fusion方法為例,當(dāng)發(fā)生PCR克隆時(shí),來(lái)源于痘病毒的In-FusionDNA聚合酶通過(guò)其3′→5′外切核酸酶活性從3′端切除核苷酸,使PCR產(chǎn)物和載體末端暴露出具有重疊區(qū)域序列的單鏈突出末端,然后啟動(dòng)SSA反應(yīng),快速將目的片段定向精確地插入到線(xiàn)性載體中,最后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中通過(guò)修復(fù)產(chǎn)生出目的克隆。這也是一個(gè)無(wú)縫反應(yīng),不會(huì)另外添加其他的核苷酸。此克隆技術(shù)操作簡(jiǎn)單方便,首先,通過(guò)限制性單酶切、雙酶切或PCR獲得線(xiàn)性載體,設(shè)計(jì)并合成與線(xiàn)性載體末端至少有15個(gè)堿基同源序列的基因特異引物,擴(kuò)增目的基因;然后,加入DpnⅠ處理模板,膠回收獲得純化的PCR產(chǎn)物,與自備的線(xiàn)性載體以2∶1的摩爾比混和,加入In-Fusion酶和其指定緩沖液進(jìn)行培育;最后,用TE緩沖液稀釋反應(yīng)產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化并篩選出目的克隆。整個(gè)反應(yīng)通常只需要5~20ng的線(xiàn)性DNA即可進(jìn)行,而且不論片段大小都有較高的重組效率,轉(zhuǎn)化后也很少會(huì)有非線(xiàn)性的載體背景出現(xiàn)。In-FusionPCR克隆是目前最為簡(jiǎn)便有效的體外構(gòu)建重組表達(dá)載體的DNA重組方法。整個(gè)過(guò)程不需要限制性酶、連接酶及磷酸酶,所以不用考慮目的片段中含有的特殊位點(diǎn);而且不需要附加特定的重組位點(diǎn),就能夠高通量的將任何插入片段克隆到任何自備載體中,這有助于實(shí)現(xiàn)分子克隆的自動(dòng)化操作。研究人員已將該技術(shù)應(yīng)用于炭疽桿菌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究、目的基因序列中引入點(diǎn)突變、融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建、抗體可變區(qū)的快速克隆及重組單克隆抗體的表達(dá)等方面。但是由于經(jīng)濟(jì)成本的原因,許多科研人員目前都未把它當(dāng)作大規(guī)模生產(chǎn)克隆的首選方法。2.2.5人工誘導(dǎo)克隆大多數(shù)已公布的克隆系統(tǒng)都需要涉及外源插入片段和載體的體外操作,而Olieric等在2010年則報(bào)道了一種自動(dòng)快速且低成本的體內(nèi)構(gòu)建表達(dá)克隆的方法。該方法要求線(xiàn)性載體和插入片段的末端要有13~20個(gè)核苷酸的重疊區(qū)域,然后將經(jīng)PCR擴(kuò)增和膠純化的插入片段和經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化并膠純化的線(xiàn)性載體以2.5∶1的質(zhì)量比混合進(jìn)行共轉(zhuǎn)化,在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組并整合成表達(dá)質(zhì)粒。該研究使用的載體不但可以進(jìn)行有插入片段的正向選擇或者是只有空載體分子的負(fù)向選擇,而且在N端和C端位置都有可利用的標(biāo)簽,可以在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中啟動(dòng)目的基因編碼蛋白質(zhì)的高效表達(dá)。通過(guò)測(cè)試,將6個(gè)不同來(lái)源、長(zhǎng)度及功能的靶序列克隆到8個(gè)上述載體中,結(jié)果靶蛋白被探測(cè)到有表達(dá)信號(hào)。由于該方法中在處理片段和載體這一步需要做膠回收,因此,這種方法還不能實(shí)現(xiàn)完全意義上分子克隆的自動(dòng)化操作,但是此方法建立了共轉(zhuǎn)化和正負(fù)向選擇的自動(dòng)克隆平臺(tái),可像Gateway或LIC一樣作為高通量的克隆系統(tǒng)應(yīng)用。綜上,這些基于重組的基因克隆技術(shù)建立了一個(gè)新的分子生物學(xué)的發(fā)展方向