水解酶促脫腐產(chǎn)腐水劑的研究

水解酶促脫腐產(chǎn)腐水劑的研究

它也被稱(chēng)為芥末、黃瓜、霉菌豆腐、長(zhǎng)毛豆腐和乳腐。它是中國(guó)的豆制酸生產(chǎn)產(chǎn)品。發(fā)酵成熟的腐乳具有營(yíng)養(yǎng)豐富,質(zhì)構(gòu)細(xì)膩柔滑,滋味鮮美和誘人食欲的特點(diǎn),是人們喜愛(ài)的開(kāi)胃佐餐食品和調(diào)味品,在眾多的豆制品中占有十分重要的位置。腐乳后酵過(guò)程,微生物所分泌的酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解,不僅使其轉(zhuǎn)化成更有利于吸收的氨基酸和肽類(lèi),氨基酸含量得到很大程度的提高,且使其具有獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)。傳統(tǒng)腐乳生產(chǎn)過(guò)程中,毛霉菌種選育的繁雜,加之腐乳的后酵是一個(gè)漫長(zhǎng)而復(fù)雜的過(guò)程,是蛋白質(zhì)降解,形成腐乳特有風(fēng)味的主要階段,后熟期一般為2~6個(gè)月,甚至更長(zhǎng),因此半成品占用空間大,給擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模帶來(lái)困難,腐乳生產(chǎn)周期冗長(zhǎng),容易受污染。因此,本工作目的在于研究促熟腐乳工藝的可行性,以豆?jié){為原料,采用酶制劑Ⅰ和酶制劑Ⅱ促熟腐乳,通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)地分析制備酶促腐乳的最佳酶解條件,為生產(chǎn)酶促腐乳提供了一定的理論依據(jù)。1材料和方法1.1corelegns菌株的鑒定大豆天津市利民調(diào)料有限公司,并保存于實(shí)驗(yàn)室常溫干燥環(huán)境下;酶制劑Ⅰ、酶制劑Ⅱ帝斯曼(中國(guó))有限公司;雅致放射毛霉Actinomucorelegans菌株(文中簡(jiǎn)稱(chēng)毛霉)本實(shí)驗(yàn)室保藏;H2SO4(分析純)耀華化工廠;K2SO4(分析純)天津市塘沽興華化工廠;CuSO4(分析純)北京化學(xué)試劑公司;NaOH(分析純)北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;甲醛(分析純)中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司。電熱恒溫培養(yǎng)箱天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司;電子分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司;微量凱氏定氮儀廣州尚準(zhǔn)儀器有限公司;自制腐乳壓榨模具。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1b/t1160-2007蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮的測(cè)定參照SB/T10170-2007。水解度(DH):水解度以水解液中總氨基酸態(tài)氮量與總氨量的百分比表示(%)。1.2.2酶促進(jìn)腐敗生產(chǎn)大豆→浸泡→磨漿、煮漿→冷卻→凝乳→劃塊、排水→壓榨成形→接種毛霉→毛坯→密閉水解→滅酶→后酵→酶促腐乳。1.2.3不同因素對(duì)水解度的影響單因素試驗(yàn)研究了酶制劑Ⅰ和酶制劑Ⅱ在不同底物濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量及其復(fù)配對(duì)酶解效果的影響。按以上5個(gè)因素的不同設(shè)定條件進(jìn)行水解度測(cè)定。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)正交試驗(yàn)的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),見(jiàn)表1。以水解度為考察指標(biāo),確定兩種酶水解腐乳的最佳條件,選擇最佳的酶解工藝條件。2結(jié)果與討論2.1單酶酶解的工藝2.1.1底物濃度對(duì)兩種酶水解度的影響在酶解溫度為50℃,加酶量0.01%,酶解時(shí)間4h下,研究底物濃度為4%,5%,6%,7%,8%時(shí)水解度,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,底物濃度較低時(shí),二種酶均隨著底物濃度的升高,水解度上升,且都在6.0%的時(shí)候達(dá)到最大值,底物濃度繼續(xù)升高,則水解度下降。這主要是因?yàn)樵诘蜐舛鹊臅r(shí)候,溶質(zhì)的流動(dòng)性好,酶與底物的結(jié)合充分,水解度逐漸上升;隨著底物濃度的升高,溶質(zhì)的流動(dòng)性變差,酶與底物的結(jié)合不充分,底物與酶結(jié)合量減少,限制了反應(yīng)的進(jìn)行,從而引起水解度的降低。因此選擇底物濃度為6.0%作為最佳底物濃度。2.1.2溫度和溫度對(duì)dh的影響配制底物濃度(固形物含量)為6.0%的豆?jié){,酶濃度為0.01%,酶解時(shí)間為4h,分別控制溫度為40,45,50,55,60℃,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,40~50℃時(shí),DH呈上升趨勢(shì);當(dāng)溫度高于50℃時(shí),DH呈下降趨勢(shì)。這是由于適當(dāng)?shù)募訜峥墒姑富钚赃_(dá)到最佳狀態(tài),同時(shí)也使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松,暴露出更多的酶作用位點(diǎn):但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí),酶蛋白部分變性,反應(yīng)速度下降,因此50℃為該體系的最適水解溫度。2.1.3水解度結(jié)果分析在酶解溫度為50℃,加酶量0.01%,底物濃度(固形物含量)為6.0%時(shí),研究酶解時(shí)間2,3,4,5,6h時(shí)的水解度,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,酶制劑Ⅰ和酶制劑Ⅱ都隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),DH值呈上升趨勢(shì),在4h以后變化趨于平緩,水解4h與水解6h水解度相差不大。這是由于在水解初期,底物濃度較高,對(duì)酶反應(yīng)的抑制作用小,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),產(chǎn)物的反饋抑制作用逐漸增強(qiáng),酶促反應(yīng)速度逐漸降低,最終達(dá)到平衡。因此綜合考慮成本問(wèn)題,4h為最佳酶解時(shí)間。2.1.4酶制劑用量對(duì)水解度的影響配制底物濃度為6.0%的豆?jié){,控制溫度為50℃,分別按0.005%,0.01%,0.015%,0.02%,0.025%(豆?jié){)添加不同量的酶制劑,水解4h后測(cè)定水解度(DH),結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,水解度(DH)隨著酶用量的增加有略微的降低,可能是因?yàn)楫?dāng)酶制劑濃度過(guò)了峰值,酶促反應(yīng)受底物濃度的反饋抑制,導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。因此,酶濃度為選取0.01%作為該體系的最適添加量。2.1.5復(fù)合酶制劑對(duì)水解度的影響由于每一種酶具有專(zhuān)一的特異性酶切位點(diǎn),當(dāng)這類(lèi)位點(diǎn)全部斷裂以后,即使酶沒(méi)有完全失活,或者繼續(xù)加入酶,水解度都難以提高。因此,為了進(jìn)一步提高腐乳的水解度,可以利用不同酶制劑的特異性催化位點(diǎn)的不同,采用復(fù)合酶制劑水解的方法,增加酶制劑的特異性催化位點(diǎn),從而達(dá)到提高水解度的目的。為了節(jié)約成本,結(jié)合酶制劑Ⅰ和酶制劑Ⅱ單因素的最佳酶解條件,實(shí)驗(yàn)中保持酶總量0.01%不變,在底物濃度為6.0%,水解溫度為50℃,酶解時(shí)間4h,以酶制劑Ⅰ∶Ⅱ?yàn)?∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,2∶8,1∶9配制復(fù)合酶制劑加入到豆?jié){中,研究水解度變化,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,使用復(fù)合酶制劑水解腐乳時(shí),水解度有明顯提高,高于單一酶制劑水解腐乳的水解度。其中當(dāng)復(fù)合酶制劑比例為3∶7時(shí),水解度明顯高于其他組。因此,選擇酶制劑Ⅰ∶Ⅱ復(fù)合比為3∶7作為復(fù)合酶制劑最佳配比。2.2酶解最佳條件的確定為獲得復(fù)合酶制劑水解最佳工藝參數(shù),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定酶制劑總濃度為0.01%,酶制劑Ⅰ∶Ⅱ比例為3∶7,以底物濃度、酶解時(shí)間、水解溫度3個(gè)因素為自變量,以水解度為指標(biāo),設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)確定酶解的最佳條件。其實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3。由表2可知,3個(gè)因素對(duì)水解度影響大小順序依次為C>B>A,即酶解時(shí)間>酶解溫度>底物濃度。由表3可知,酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響顯著,底物濃度和酶解溫度對(duì)水解度的影響均不顯著。理論最佳工藝條件為A2B2C3,即底物濃度6.0%,酶解溫度50℃,水解時(shí)間為5h。2.3不同溫度和時(shí)間對(duì)酶促乳酸水解度的影響實(shí)際操作中將正交分析法優(yōu)化的酶解工藝條件適當(dāng)調(diào)整為底物濃度6.0%,酶解溫度50℃,水解時(shí)間為5h,在此條件下得到酶促腐乳的水解度為26.53%,正交試驗(yàn)結(jié)果最高的水解度為25.56%,基本吻合,這表明該酶解工藝較為理想。3酶制劑促熟乳酸工藝驗(yàn)證本文使用