基于pe28a-egfp基因的重組質(zhì)粒的制備及轉(zhuǎn)化

基于pe28a-egfp基因的重組質(zhì)粒的制備及轉(zhuǎn)化

綠色熒光蛋白質(zhì)（gfp）是日本科學(xué)家在196年發(fā)現(xiàn)并分離出的一種綠色fluent石橋。分子質(zhì)量為26ku,是由238個(gè)氨基酸構(gòu)成的“β-桶”型三維立體結(jié)構(gòu),其中第65～67位氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)形成發(fā)光團(tuán),為主要發(fā)光的位置。GFP的結(jié)構(gòu)賦予了其一些獨(dú)特的性質(zhì):熒光穩(wěn)定、檢測方便、無種屬特異性、不需任何反應(yīng)底物和輔助因子、易于構(gòu)建載體,并且它不會(huì)破壞細(xì)胞生長環(huán)境,對細(xì)胞生理功能無影響等,因此是常用的報(bào)告基因。目前,科研人員根據(jù)不同需要,利用氨基酸序列修飾等方法對GFP進(jìn)行改進(jìn),獲得了一系列優(yōu)良的變異體,發(fā)光的強(qiáng)度和顏色都有變化,如苯丙氨酸64被亮氨酸取代,絲氨酸65被蘇氨酸取代的EGFP熒光強(qiáng)度就增加了35倍。而且出現(xiàn)了紅色、黃綠色、藍(lán)色等多種顏色的熒光蛋白,大大拓寬了GFP研究的領(lǐng)域。近些年,國內(nèi)外掀起了關(guān)于GFP研究的熱潮,已見GFP應(yīng)用于各人源細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌等領(lǐng)域中。本研究以原核生物E.coliBL21為表達(dá)宿主,利用PCR技術(shù)從模板EGFP-N3中克隆得到EGFP片段,并在其2端引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ,對引入酶切位點(diǎn)的EGFP片段和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理,連接后得到重組質(zhì)粒pET28a-EGFP并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中,通過IPTG誘導(dǎo)可以高效表達(dá)。食品安全問題一直是困擾各國的公共衛(wèi)生問題,食源性病原菌又是引起食品安全問題的主要因素之一。通過本研究,期望能夠?yàn)橐院驟GFP作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記食源性病原菌,跟蹤監(jiān)測病原菌的侵染路徑提供理論基礎(chǔ),從而為食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供合理依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1pcr和ssrPEGFP-N3模板、菌株E.coliDH5α(用于質(zhì)粒的保存)、E.coliBL21(用于重組質(zhì)粒的表達(dá))、質(zhì)粒pET28a(復(fù)旦大學(xué)遺傳所);限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ,HindⅢ(紐英倫生物技術(shù)有限公司);T4DNA連接酶、1kbDNAladder(Fermentas公司);DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒(愛思進(jìn)生物技術(shù)公司);DNA純化試劑盒及IPTG(大連寶生物工程有限公司);PCR用試劑(北京全式金生物技術(shù)公司);卡那霉素、瓊脂糖及PCR合成引物等(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);蛋白胨、酵母浸出粉、瓊脂粉等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。1.1.2熒光顯微鏡檢測PTC-200PCR儀(美國Bio-Rad公司);GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);CarlZeissAxio-Scope.A1落射熒光顯微鏡(德國ZeissJena);DYY-6C電泳槽和電泳儀(北京六一儀器廠);TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);UV2300紫外可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。1.2方法1.2.1pcr反應(yīng)體系的建立以PEGFP-N3中EGFP片段為模板,設(shè)計(jì)上游引物:5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′,下游引物:5′-GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3′。分別取4.0μL模板、2μL10μmol/L的上游和下游引物、1.0μLTransStartFastPfuDNApolymerase(5U/μL)、10μL10×Buffer、5.0μLdNTPMixture作為PCR反應(yīng)體系。用無菌水將反應(yīng)液調(diào)至50μL,于95℃條件下預(yù)變性處理2min,然后分別在94℃變性20s、65℃退火20s、72℃延伸30s、最終72℃終延伸5min,整個(gè)PCR反應(yīng)體系共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后,用DNA純化試劑盒回收后待用。1.2.2dna純化及純化取上述經(jīng)DNA純化試劑盒純化后的目的片段作為PCR反應(yīng)的模板,設(shè)計(jì)引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的上游引物(5′-GGAG/AATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′)和引入HindⅢ酶切位點(diǎn)的下游引物(5′-CCGA/AGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC-3′)。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,進(jìn)行DNA純化。純化后的EGFP片段進(jìn)行雙酶切,反應(yīng)體系如下:30μL添加了酶切位點(diǎn)的EGFP片段、5μL10×buffer2、1μLEcoRⅠ(20U/μL)、1μLHindⅢ(20U/μL),用無菌水將反應(yīng)液調(diào)至50μL后,于37℃下保溫1h,然后在65℃條件下處理20min進(jìn)行熱失活。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,DNA純化試劑盒純化回收。另一方面,將pET28a質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒,并進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,切下線性質(zhì)粒條帶進(jìn)行純化回收。1.2.3連接酶系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果將上述含酶切位點(diǎn)的EGFP片段與線性pET28a質(zhì)粒按2:1比例、在45℃下保溫5min后,置于冰浴中冷卻,冷卻后分別加入1μLT4DNA連接酶、2μL10×T4DNA連接酶緩沖液,16℃保溫16h,如圖1所示。連接液轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后,挑選3～5個(gè)菌落做PCR驗(yàn)證,進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定,陽性克隆用于DNA測序。對經(jīng)測序確證的、含pET28a-EGFP重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提純。1.2.4那氧化酶lb液體培養(yǎng)液取1μL“pET28a-EGFP”重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后。隨機(jī)挑選10個(gè)陽性菌落克隆于含卡那霉素(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)液中,37℃、220r/min搖床培養(yǎng)至OD600=0.4時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG,并使其終濃度為1.0mmol/L。將含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液于25℃、110r/min條件培養(yǎng)12h后,制成玻片于熒光顯微鏡下觀察,對在熒光顯微鏡下發(fā)綠光的大腸埃希菌及時(shí)保種,同時(shí),劃線至含卡那霉素(50μg/mL)及IPTG(1mmol/L)的LB固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)12h,觀察菌落形態(tài)。2結(jié)果與分析2.1陽性克隆的初步形成和表達(dá)將EGFP片段與pET28a表達(dá)載體經(jīng)連接液連接后,通過對挑取的單菌落做菌落PCR檢驗(yàn),如圖2所示,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,發(fā)現(xiàn)在約750bp處有清晰條帶(圖2左),與理論相符,初步確定為陽性克隆。進(jìn)一步對陽性菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行提純、用EcoRⅠ和HindⅢ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,可在約750bp處看到目的片段的條帶(圖2右)。最終將PCR產(chǎn)物送往上海美吉生物技術(shù)公司進(jìn)行測序,通過與GenBank序列比對,結(jié)果顯示序列匹配率為100%,由此可以證明目的片段“EGFP”已正確連接到pET28a表達(dá)載體,并且核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變。2.2e.colibl21表達(dá)盡管目的片段EGFP與表達(dá)載體pET28a得到了有效重組,但重組載體pET28a-EGFP是否能在原核系統(tǒng)中得到高效表達(dá)還需進(jìn)一步研究,因此通過利用pET28a-EGFP轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行檢測。在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中篩選陽性克隆,LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.4時(shí),加入IPTG(1mmol/L)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)12h,取少量菌液涂片,在熒光顯微鏡(10×100)下可以明顯觀察到發(fā)綠光的單個(gè)細(xì)菌,將轉(zhuǎn)化成功的E.coliBL21命名為E.coliBL21-1,如圖3所示。而轉(zhuǎn)化菌劃線于含卡那霉素(50μg/mL)與IPTG(1mmol/L)的LB固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后,在自然光下菌落呈綠色如圖4所示,因此可以說明,重組表達(dá)載體pET28a-EGFP能夠在原核系統(tǒng)中得到高效的表達(dá),并且表達(dá)效果較好。3pet28a-egfp的改造型外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)常常對宿主造成很強(qiáng)的代謝負(fù)擔(dān),表達(dá)的目的蛋白有時(shí)會(huì)對宿主菌有“毒性”作用。而GFP恰恰克服了這一障礙,大部分研究認(rèn)為作為分子標(biāo)記物,GFP對細(xì)胞無毒性且對細(xì)胞生長代謝和細(xì)胞功能均無影響,無疑成為眾多科研人員的理想選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇的EGFP是野生型GFP的改造型,其所產(chǎn)生的熒光比野生型GFP亮35倍,可以顯著提高其檢測的靈敏度;同時(shí)本研究中選擇pET28a質(zhì)粒作為表達(dá)載體,該質(zhì)粒含有強(qiáng)啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子,可以使目的基因得到高效表達(dá)。以上表明,pET28a-EGFP重組表達(dá)載體能使EGFP基因和pET28a質(zhì)粒充分發(fā)揮各自的優(yōu)良特性。若GFP直接作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記食源性病原菌,不僅可以克服熒光染料分布不均勻,易滲漏,隨細(xì)胞分裂被稀