工業(yè)微生物菌種選育技術(shù)

工業(yè)微生物菌種選育技術(shù)

微生物是發(fā)酵行業(yè)的重要因素。決定發(fā)酵過程的成功，以及特定發(fā)酵產(chǎn)品是否具有工業(yè)化價值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工業(yè)化價值,因此需要對菌株進(jìn)行選育和改良,以提高產(chǎn)品的質(zhì)量,降低成本。原生質(zhì)體融合技術(shù)是起源于20世紀(jì)60年代的一項重要的菌種改良技術(shù),是將親株細(xì)胞分別去除細(xì)胞壁后進(jìn)行融合,經(jīng)基因組間的交換重組,獲得融合子的過程。與其他育種技術(shù)相比,原生質(zhì)體融合技術(shù)具有重組頻率高、受結(jié)合型或致育型限制小以及遺傳物質(zhì)傳遞完整且不需要完全了解作用機(jī)制等優(yōu)點,因而被國內(nèi)外微生物育種學(xué)者廣泛應(yīng)用。1974年,匈牙利的Ferenczy成功將白地霉(Geotrichumcandidum)營養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體進(jìn)行融合,使原生質(zhì)體融合技術(shù)首次應(yīng)用于微生物中。接下來的幾十年,該技術(shù)的基本實驗方法逐步完善,現(xiàn)已作為一項十分有用的技術(shù)廣泛應(yīng)用于工業(yè)微生物菌種選育中。本文就原生質(zhì)體融合技術(shù)的過程及其應(yīng)用于微生物育種方面的最新進(jìn)展做了簡要綜述,并分析了目前存在的問題及未來的發(fā)展方向。1原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合,遺傳穩(wěn)定性分析原生質(zhì)體融合技術(shù)一般分成五大步驟:直接親本及其遺傳標(biāo)記選擇,雙親本原生質(zhì)體制備和再生,親本原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合,融合重組體篩選,遺傳特性分析和測定。1.1最佳酶濃度和作用時間的確定原生質(zhì)體的制備首先要去除細(xì)胞壁,當(dāng)前去壁的方法主要有機(jī)械法、非酶法和酶法,現(xiàn)在使用較多的為酶法。在放線菌和細(xì)菌中,主要采用溶菌酶,酵母菌和霉菌一般用蝸牛酶、消解酶或纖維素酶等。影響原生質(zhì)體制備和再生的因素很多:在菌齡上,為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化,一般選擇對數(shù)生長期或生長中期的菌體,也有的采用生長后期的菌。酶濃度以及作用時間也會影響原生質(zhì)體的制備和再生率,一般來說酶濃度越高,作用時間越長,原生質(zhì)體制備率就越高,但酶解時間過長又會影響再生率。對于不同的菌體,優(yōu)化其最適酶濃度和作用時間非常必要。本實驗室在琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)的原生質(zhì)體制備和再生實驗中發(fā)現(xiàn)采用對數(shù)生長中期的菌更易于原生質(zhì)體化,在酶解琥珀酸放線桿菌(A.succinogenes)過程中,最適的酶濃度大大低于其他革蘭氏陰性菌,且最佳酶解時間較短,原生質(zhì)體的再生率高。另外,菌體的預(yù)處理,酶的處理溫度,滲透壓穩(wěn)定劑等都會影響微生物原生質(zhì)體的制備和再生。1.2peg的選擇由于在自然條件下,原生質(zhì)體發(fā)生融合的頻率非常低,因此在實際育種過程中要采用一定方法進(jìn)行人為誘導(dǎo)融合。在微生物原生質(zhì)體融合中,誘導(dǎo)融合方法主要有化學(xué)法(一般采用PEG結(jié)合高Ca2+、pH誘導(dǎo)法)、物理法(包括電融合和激光誘導(dǎo)融合法等)。當(dāng)用PEG法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合時,很多因素影響融合頻率。如PEG聚合度、PEG濃度和作用時間、離子種類和濃度、融合劑pH、溫度等。一般來說相對分子質(zhì)量為1000-6000的PEG都是有效的,PEG的濃度為30%~50%,不同相對分子質(zhì)量的PEG溶液在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)時是同效的。在融合過程中,適量的Ca2+、Mg2+有助于融合,而K+、Na+則會降低融合率。PEG溶液一加入,融合就能較長時間地有效進(jìn)行,但由于PEG有一定的毒性,因而大部分學(xué)者認(rèn)為PEG處理時間一般控制在1~10min即可。1.3組合子的篩選1.3.1基因信息融合子檢測融合雙親為不同的營養(yǎng)缺陷型,原生質(zhì)體融合后于基本培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。由于雙親都喪失了合成某種物質(zhì)的能力,在基本培養(yǎng)基上不能生長,而在融合子中,缺陷的遺傳物質(zhì)得到互補(bǔ),所以可在基本培養(yǎng)基上長出菌落,利用這種方法即可檢出融合子。Dai等以大腸桿菌(Escherichiacoli)W4183(Arg-)及Fu20-1(Leu-)為親本進(jìn)行融合,在不加Arg、Leu的培養(yǎng)基上篩選出融合子。1.3.2基于融合子的篩選微生物的抗藥性是由遺傳物質(zhì)決定的,不同種微生物對同種藥物的抗性存在差異,利用這種差異即可對融合子進(jìn)行篩選。楊合同等將帶有抗苯菌靈標(biāo)記的哈茨木霉菌株(Trichodermaharzianum)T9和帶有潮霉素B標(biāo)記的康寧木霉菌株(T.koningii)Tk7a進(jìn)行原生質(zhì)體融合,用含有苯菌靈和潮霉素B的平板篩選,得到帶有兩親本共同抗性的融合子。1.3.3再生后的融合子通過滅活標(biāo)記篩選融合子是指將單親或雙親的原生質(zhì)體經(jīng)紫外線照射、加熱或經(jīng)過某些化學(xué)藥劑處理,使其喪失在再生培養(yǎng)基上再生的能力,兩親株融合后,融合子損傷互補(bǔ),因而可在再生培養(yǎng)基上存活。駱健美等將兩株高產(chǎn)褐黃孢鏈霉菌(StreptomycesGilvosporeus)SG-2002-1和SG-2002-2的原生質(zhì)體分別經(jīng)過紫外滅活和熱滅活后融合,形成能夠生長繁殖的融合子。這種方法省略了對雙親株的遺傳標(biāo)記,使工作量大大降低,還避免了親本特性的改變。1.3.4不同顏色的融合子在制備原生質(zhì)體時,向酶解液中加入不同熒光色素,使雙親原生質(zhì)體在特定波長下呈現(xiàn)不同顏色,原生質(zhì)體融合后,直接選出帶有兩色熒光的融合子即可。龍建友等將鏈霉素No.24菌株原生質(zhì)體帶上酚藏花紅熒光標(biāo)記,將其誘變株Ms-24菌株原生質(zhì)體帶上伊文思藍(lán)熒光標(biāo)記,融合后,在熒光顯微鏡下篩選同時帶有紅藍(lán)熒光的融合子。1.3.5使用高效化合物利用親本對營養(yǎng)物質(zhì)利用及固氮能力方面的差異來篩選融合子。袁耀武等將能氧化鄰苯二胺的釀酒酵母(S.cerevisiae)及具有分解尿素能力的粟酒裂殖酵母(S.pombe)融合,利用二者的生理特征進(jìn)行顯色反應(yīng),從而篩選融合子。1.3.6形態(tài)差異的菌株選擇利用DNA水平上的分子標(biāo)記或DNA含量、氨基酸含量等生化指標(biāo)來選擇融合子,對具有能直接觀察的形態(tài)學(xué)差異的菌株也可通過形態(tài)差異來選擇融合子。趙航等在稗突臍蠕孢菌(Exserohilummonoceras)和彎孢菌(Curvularialunata)融合實驗中,根據(jù)菌落形態(tài)及大小篩選出了孢子產(chǎn)量高、代謝產(chǎn)毒能力強(qiáng)的融合子。2原生質(zhì)體融合技術(shù)的應(yīng)用2.1原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合常用于抗生素高產(chǎn)菌株的選育,特別是在鏈霉素育種中。Xu等以始旋鏈霉菌(S.pristinaespiralis)CGMCC0957突變菌中普納霉素產(chǎn)量最高的四株菌為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合,得到普納霉素產(chǎn)量比親本高89.4%,達(dá)到0.89g/L的優(yōu)良菌株。Jin等以10株產(chǎn)量較高的多殺菌素產(chǎn)生菌Saccharopolysporaspinosa為出發(fā)菌株,經(jīng)過融合,得到高產(chǎn)菌株S.spinosa4~7,其產(chǎn)量可達(dá)到547mg/L,較出發(fā)菌株提高了200.55%以上,在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵168h,多殺菌素產(chǎn)量可達(dá)到428mg/L。在酶制劑產(chǎn)生菌的選育研究中,原生質(zhì)體融合技術(shù)也應(yīng)用廣泛。主要用于提高菌種產(chǎn)酶活力。Khattab等將Aspergillusniger黑曲霉經(jīng)過紫外或EMS誘變后,篩選出胞外葡萄糖氧化酶(GOD)活性最高的突變株進(jìn)行融合,得到的融合子C-15、C-1、C-18的GOD活性達(dá)到了61.4U/ml、60.8U/ml、62.7U/ml,較初始菌分別提高了386.2%、382.4%、394.3%。原生質(zhì)體融合技術(shù)在構(gòu)建各種代謝物高產(chǎn)菌株方面的應(yīng)用也十分普遍。Yu等以鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)Lr-WT的誘變優(yōu)良菌為出發(fā)菌,通過雙親滅活,用碳酸鈣高糖平板篩選有效融合子,得到具有耐糖和高產(chǎn)兩個表型的改良菌株F2-2,在初糖濃度150g/L發(fā)酵罐中,F2-2的乳酸產(chǎn)量為140g/L,是野生菌的1.8倍。2.2對重金屬廢水的生物酶融合構(gòu)建高效降解菌株,將幾種菌各自突出的降解性能融合到一個菌株中,用于降解污水及土壤中的有害物質(zhì),也是原生質(zhì)體融合技術(shù)的一個重要應(yīng)用。盧顯妍等將對鉻有較高抗性和除鉻性能較高的兩種酵母進(jìn)行融合,篩選出遺傳性狀穩(wěn)定的融合株R32,處理低濃度含鉻廢水時,去除率和還原率可達(dá)到100%,處理高濃度含鉻廢水(200mg/L)時,還原率仍可達(dá)50%以上。崔俊濤等將優(yōu)勢真菌黑曲霉(Aspergillusniger)A-02-10和阿特拉津降解菌青霉(Penicilliumsp)P-02-07滅活融合,得到的融合子在自然土壤中的定殖數(shù)量可維持在6.4×106CFU/g,使土壤中阿特拉津降解半衰期由親本的30天縮短為10天。尹紅梅等將蒽降解菌An和土生優(yōu)勢菌Tu進(jìn)行融合,得到的融合子在被蒽污染的土壤中,初始接種量相同的情況下,存活率明顯高于出發(fā)菌株;40天時,融合菌株對蒽的降解能力比親本高15.2%。玉米秸稈作為動物飼料時,所含木質(zhì)素會阻礙秸稈的消化,白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)能有效的降解木質(zhì)素,白地霉(Geotrichumcandidium)則可生成單蛋白質(zhì),Zhang等以二者為親本進(jìn)行融合得到的融合子可將秸稈中的木質(zhì)素由109降到54g/kg,同時也使秸稈中發(fā)酵液中蛋白質(zhì)由48增至67g/kg。2.3菌株融合子的制備在微生物發(fā)酵中,很多產(chǎn)酸菌往往隨著酸的積累而使生長受到抑制,從而影響產(chǎn)率。因此,篩選出能在低pH條件下生長代謝的微生物,不僅可以提高產(chǎn)率,還可以有效地減少雜菌污染、簡化產(chǎn)品后處理工藝、降低生產(chǎn)成本。Hou將釀酒酵母(S.cerevisiae)W303用EMS誘變,誘變菌株融合后得到的融合子S3-7乙醇產(chǎn)量較W303提高了13%,且使乙醇的耐受性由6%(v/v)提高至15%(v/v)。很多微生物能在較高溫度下生存,其機(jī)理研究還不是很清楚,但這一特性對改善菌株的耐熱性卻有很高的價值。Shi等將釀酒酵母(S.cerevisiae)SM-3經(jīng)紫外誘變篩選得到的能于43℃生長的兩菌株作為親本進(jìn)行原生質(zhì)體的融合,選育出了能耐受55℃高溫的融合菌。2.4抗b.哈茨木霉trianumt65和短生品抗氧化酶系統(tǒng)的篩選每個菌株都具有某方面優(yōu)良性狀,通過原生質(zhì)體融合技術(shù)將具有所需性狀的兩親本進(jìn)行遺傳物質(zhì)重組,即可獲得兼具兩親本優(yōu)良性狀的新菌株。L?ránt等將哈茨木霉TrichodermaharzianumT66和深綠木霉T.atrovirideT122經(jīng)紫外誘變后篩選出具有MBC抗性及戊唑醇抗性的突變株,二者融合后得到的融合株同時具有MBC和戊唑醇抗性。韋革宏等融合豌豆根瘤菌RhRhizbiumleguminosorum(penr)和大豆根瘤菌Sinorhizobiumxinjiangnesis(cmr),得到具有雙親抗性,且能在雙親寄主植物上結(jié)瘤的融合子。2.5erevisiae的制備通過原生質(zhì)體融合,可能使親本不同代謝途徑的某些環(huán)節(jié)綜合起來,從而形成某些新的性狀或代謝產(chǎn)物。張華山等以糖化酵母(S.diastaticus)和釀酒酵母(S.cerevisiae)為親本,單親滅活融合,獲得1株利用可溶性淀粉發(fā)酵,且淀粉利用率達(dá)64.3%的融合子,在含5.0%淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中,終發(fā)酵酒度可達(dá)6.5%(v/v)。John等以德氏乳桿菌突變株NCIM2025和淀粉酶產(chǎn)生菌(Bacillusamyloliquefaciens)ATCC23842作為親本出發(fā)菌株,進(jìn)行3輪基因組改組,得到4株能直接利用不同來源的淀粉生產(chǎn)乳酸的改組菌株,通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝,最終乳酸發(fā)酵產(chǎn)量為40g/L,淀粉轉(zhuǎn)化率為96%。3原生質(zhì)體融合技術(shù)repommet和雙重質(zhì)體s.frara20世紀(jì)90年代,美國加州Maxgen公司在原生質(zhì)體融合技術(shù)的基礎(chǔ)上提出了基因組重排技術(shù)(genomeshuffling)技術(shù)的概念,基因組重排技術(shù)是經(jīng)典微生物誘變育種技術(shù)與原生質(zhì)體融合技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。首先對微生物菌體進(jìn)行誘變,篩選出正向突變菌株,然后通過原生質(zhì)體“遞推式融合”使正向突變的若干個菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合,篩選出符合育種要求的融合子,從而在短時間內(nèi)獲得性狀得到大幅度提高的菌株。由于此技術(shù)在無需了解微生物遺傳性狀的條件下即能實現(xiàn)微生物的定向育種,獲得正向突變的菌株,自此技術(shù)誕生以來,短短幾年時間里在工業(yè)生產(chǎn)菌種改進(jìn)及開發(fā)方面就獲得了成功的應(yīng)用。2002年,Zhang成功應(yīng)用基因組重排技術(shù)快速提高了弗氏鏈霉菌(S.fradiae)的泰洛星產(chǎn)量。同年,Patnaik等也通過基因組重排技術(shù)提高了乳酸桿菌的耐酸性能。隨后,Dai等將基因組重組技術(shù)應(yīng)用于構(gòu)建高降解工程菌中,成功得到了能耐受8mmol/L五氯苯酚(PCP),且能在48h內(nèi)完全降解3mmol/LPCP的融合子。Hiroyuki等以深海鏈霉菌(S.sp)U121為出發(fā)菌進(jìn)行基因組改組得到了一株羥基檸檬酸產(chǎn)量為原始菌4倍,生長率為原始菌3.5倍的融合菌。王立梅等通過基因組改組技術(shù)得到了在pH3.6下仍能生長,且L-乳酸產(chǎn)量達(dá)到5.67g/L,發(fā)酵溫度提高至40℃的優(yōu)良菌株。在過去的30年中,原生質(zhì)體融合技術(shù)逐步發(fā)展完善,并已成功應(yīng)用于微生物育種技術(shù)中,但是由于融合子的篩選方法對親本菌株要求較高,需要其自身具有或通過人為誘導(dǎo)使其具有某