溫度對溫泉中古細(xì)菌多樣性的影響

溫度對溫泉中古細(xì)菌多樣性的影響

0古細(xì)菌群落的組成長期以來，古細(xì)菌的一些奇怪習(xí)慣和潛在生物研發(fā)的前景引起了人們的關(guān)注。1990年Woese提出了“三域分類學(xué)說”,即將生物界分為真核生物(Eucaryota)、真細(xì)菌(Bacteria)和古細(xì)菌(Archaea)三域。在rRNA進(jìn)化樹上,古細(xì)菌可分為泉古菌門(Crenarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)以及未確定的初古菌門(Korarchaeota)和納古菌門(Nanoarchaeota),其中研究相對深入的是泉古菌門和廣古菌門。目前自然界中已知的可培養(yǎng)微生物僅占0.1%～10%,即便是得到了純培養(yǎng),其形態(tài)和生理也可能發(fā)生很多變化。因此,分子生物學(xué)技術(shù)已成為研究微生物生態(tài)學(xué)行之有效的方法,為揭示自然環(huán)境微生物多樣性提供了一條新的途徑。古細(xì)菌域的分子生態(tài)學(xué)分析顯示許多未培養(yǎng)的古細(xì)菌主要分布在陸地溫泉、淡水湖泊、沿?；蛏詈Ｋ?、海底沉積物或熱溢口以及土壤環(huán)境等。我國是個(gè)溫泉資源豐富的國家,總體上看,主要分布在西藏、云南、廣東、福建、四川以及東部的臺(tái)灣省等地區(qū),在華北燕山山區(qū)也出露有近30個(gè)溫泉,這為我們開展溫泉古細(xì)菌多樣性的研究提供了豐富和寶貴的資源。目前學(xué)者們對溫泉微生物生態(tài)學(xué)的研究主要集中在高溫和超高溫環(huán)境中,對中低溫環(huán)境的研究還相對較少。國際上對陸地溫(熱)泉高溫菌研究比較深入的主要是美國黃石國家公園溫泉,以及冰島和日本的一些高溫溫泉,而國內(nèi)對云南騰沖熱海的溫泉研究開展較早,也較為系統(tǒng),但對華北地區(qū)的溫泉研究甚少。本研究組前期曾對華北承德地區(qū)溫泉中細(xì)菌的多樣性水平進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他地區(qū)的溫泉相比存在一定的差異,而且其中的某些菌種還可以通過自身的代謝來影響溫泉泉華的形成,證明該地區(qū)溫泉中細(xì)菌群落的組成較為特殊。但承德地區(qū)溫泉中古細(xì)菌群落的組成是什么?它們在溫泉生態(tài)系統(tǒng)中扮演著什么角色,是否和細(xì)菌群落有相互作用?目前還未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過構(gòu)建古細(xì)菌的16SrDNA克隆文庫,對我國華北承德地區(qū)兩個(gè)不同溫度的溫泉(61.4℃和74.5℃)中古細(xì)菌的多樣性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析,研究結(jié)果可為該地區(qū)溫泉生態(tài)系統(tǒng)的進(jìn)一步深入研究提供可靠的依據(jù)。1材料和方法1.1水質(zhì)、水資源量樣品采集于2010年6月28—29日,采樣地點(diǎn)為河北承德地區(qū)兩個(gè)不同溫度的溫泉:圍場縣山灣子溫泉(A12)和隆化縣七家溫泉(A14)。山灣子溫泉出露于河谷中部,來自下部花崗巖破碎帶的熱水穿過淺部第四系沉積物而涌出地面。七家溫泉的出露受到北東向斷裂控制,現(xiàn)地表已沒有泉眼,由鉆孔在原泉眼處抽取地下熱水。水樣采集后裝于無菌瓶中,儲(chǔ)存于4℃保溫箱中,盡快返回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。溫度、pH、高程等參數(shù)現(xiàn)場測定(表1),其他物理化學(xué)參數(shù)測定由北京市地質(zhì)工程勘察院實(shí)驗(yàn)室完成。1.2總dna的提取取1L水樣于孔徑為0.22μm的細(xì)菌濾膜上進(jìn)行真空抽濾,將濾膜浸泡于10mL無菌生理鹽水中,超聲波振蕩10min,然后用移液槍反復(fù)吹打使膜上細(xì)胞完全進(jìn)入溶液中。使用離心機(jī)10000r/min離心3min收集菌體。用環(huán)境基因組DNA提取試劑盒提取水樣中的總DNA(參照MPBio試劑盒說明書),提取產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。最后將提取的總DNA置于-20℃下保存。1.3相關(guān)基因片段的pcr擴(kuò)增以基因組DNA為模板,使用古細(xì)菌通用引物對ARC21F(5′-TTCYGGTTGATCCYGCCRGA-3′)和ARC968F(5′-YCCGGCGTTGAMTCCAWTT-3′),PCR擴(kuò)增樣品中的相應(yīng)基因片段。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,52℃退火30s和72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán),最后在72℃下延伸7min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。1.4pcr擴(kuò)增篩選將PCR產(chǎn)物通過克隆試劑盒連接到pEASY-T1克隆載體上,并熱激轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中,然后涂布在含有Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上,于37℃下靜置培養(yǎng)16h。隨機(jī)挑取白色克隆,重新純化培養(yǎng),并用特異性引物對M13M4(5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13RV(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選插入片段。最后將鑒定出的陽性克隆送交中科希林生物科技有限責(zé)任公司完成測序。1.5序列篩選、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建運(yùn)用Bellerophon程序?qū)Λ@得的序列進(jìn)行嵌合體的檢驗(yàn),刪除嵌合體后用Dotur軟件對剩余序列進(jìn)行分類,最后運(yùn)用BLAST程序?qū)⒏黝愋蛄性贕enBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索,并下載相似性最高的序列和相似性較高的已知種的序列作為參考。將所有序列用BioEdit中的ClustalW程序進(jìn)行處理后,用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究所得序列均已提交GenBank,序列登錄號(hào)為JF830106-JF830119。2結(jié)果2.1不同強(qiáng)化項(xiàng)目的熱泉比較根據(jù)《飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》(GB/T8538—2008),對山灣子溫泉(A12)和七家溫泉(A14)兩個(gè)熱泉中的鉀、鈉、鈣、鎂等34個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行分析,表1列出了部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.2dna片段大小及含量兩個(gè)環(huán)境的樣品總DNA的提取結(jié)果如圖1所示,其中1為A12,2為A14。所提DNA的片段大小均約為23kb,表明已獲得較為完整的基因組DNA。并且A260/280比值在1.83左右,說明DNA的純度較高,可以直接用于PCR。2.31不同濃度模板pcr產(chǎn)物的表達(dá)兩溫泉樣品中古細(xì)菌的16SrDNA基因片段擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。泳道1-1和1-2為A12加不同濃度模板后的PCR產(chǎn)物,2-1和2-2為A14加不同濃度模板后的PCR產(chǎn)物,CK為陰性對照。由圖可知,兩樣品用古細(xì)菌通用引物對(ARC21F/ARC968F)進(jìn)行PCR擴(kuò)增均可以獲得單一的目的條帶,片段長度約900bp,無明顯非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象出現(xiàn)。2.4建立克隆信息庫兩熱泉樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后,各隨機(jī)挑取50個(gè)白色克隆建立克隆文庫。用特異性引物對M13M4和M13RV進(jìn)行插入片段篩選后,將鑒定出的陽性克隆進(jìn)行測序,兩個(gè)樣品共得到78個(gè)序列。2.5強(qiáng)化、分類、序列及系統(tǒng)發(fā)育樹運(yùn)用Bellerophon程序檢驗(yàn)并去除嵌合體后,將剩余序列通過Dotur軟件進(jìn)行分類,并繪制兩文庫的飽和曲線(圖3)。從圖3看出,最終可將獲得的古細(xì)菌16SrDNA序列分成13種基因型(A12為3種,A14為10種),兩文庫分析均趨于飽和。將每種基因型的代表序列輸入RDP網(wǎng)站,用Classifier程序確定其系統(tǒng)發(fā)育類群,結(jié)果表明(圖4):A12(74.5℃)文庫中16SrDNA序列分屬3個(gè)類群,分別為Crenarchaeota(33.3%)、Euryarchaeota(62.5%)、UnclassifiedArchaea(4.2%)。A14(61.4℃)文庫中的16SrDNA序列則分屬2個(gè)類群:Crenarchaeota(88.5%)和UnclassifiedArchaea(11.5%),并沒有廣古菌門(Euryarchaeota)微生物的分布。由此可見,兩熱泉的優(yōu)勢種群不同,廣古菌門(Euryarchaeota)是樣品A12的優(yōu)勢類群,而泉古菌門(Crenarchaeota)是A14的優(yōu)勢類群。將每種基因型的序列輸入NCBI網(wǎng)站,用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對,結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出,七家溫泉A14(61.4℃)的基因型種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于山灣子溫泉A12(74.5℃),表明溫度是影響溫泉中古細(xì)菌多樣性水平的關(guān)鍵因素。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn),文庫中序列與許多類似環(huán)境中的古細(xì)菌和環(huán)境克隆密切相關(guān),如:A12-11(MethanosaetathermophilaPT)、A14-16(CandidatusNitrososphaeragargensis)、A14-22(CandidatusNitrosocaldusyellowstoniistrainHL72)、A14-31(Crenarchaeotalsp.clonepJP41)。其中,MethanosaetathermophilaPT是嗜熱產(chǎn)甲烷古細(xì)菌,而CandidatusNitrososphaeragargensis和CandidatusNitrosocaldusyellowstoniistrainHL72是與氨氧化作用密切相關(guān)的古細(xì)菌。為了進(jìn)一步了解這些古細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位,除了數(shù)據(jù)庫中同源性最高的序列之外,本研究還下載了一些同源性較高的已知菌種的序列,與所得序列構(gòu)建了A12和A14兩個(gè)溫泉樣品中古細(xì)菌類群的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。下面分別描述主要類群代表克隆的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。(1)Crenarchaeota泉古菌門是古細(xì)菌的一個(gè)大分支,包括很多極端嗜熱微生物。該類古細(xì)菌是A14(61.4℃)文庫中的優(yōu)勢類群,占88.5%。包括8種基因型,而且這8個(gè)克隆均屬于分類地位相對明確的熱變形菌綱(Thermoprotei)。其中,克隆A14-1在A14文庫中所占比例為37.2%,是該文庫中最豐富的序列類型,它與UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.的相似性達(dá)96%。UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.是Nunoura等從日本Hishikari金礦的地下熱水(60～70℃)中,利用宏基因組的方法推斷出來的未培養(yǎng)微生物。該古細(xì)菌基因組含有一個(gè)16S/23SrRNA操縱子和44個(gè)編碼蛋白的基因。UncluturedCandidatusNitrosocaldussp.可能在地下熱水的硝化過程中起著重要的作用。A14-22在A14文庫中所占比例為34.3%,是該樣品的第二豐富的基因型。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn),該克隆與CandidatusNitrosocaldusyellowstonii的親緣關(guān)系比較密切,同源性高達(dá)99%。CandidatusNitrosocaldusyellowstonii是由Torre等從美國黃石國家公園熱泉沉積物中富集培養(yǎng)出的一株嗜熱硝化古細(xì)菌,可以通過好氧氨氧化進(jìn)行自養(yǎng)生長,并能在高達(dá)74℃的熱環(huán)境中進(jìn)行硝化作用。氨氧化古細(xì)菌的廣泛分布和多樣性證明其對氮循環(huán)的貢獻(xiàn)具有全球性意義,但一直以來發(fā)現(xiàn)的氨氧化古菌主要分布在中低溫環(huán)境中,因此該菌株的發(fā)現(xiàn)大大地?cái)U(kuò)展了硝化作用的溫度限制,并且證明了氨氧化的能力廣泛分布在泉古菌門中。此外,A14-16與CandidatusNitrososphaeragargensis在系統(tǒng)發(fā)育樹聚為一個(gè)分枝(圖5)。CandidatusNitrososphaeragargensis是Hatzenpichler等通過富集培養(yǎng)從西伯利亞Garga溫泉中獲得的一株古細(xì)菌,該菌株是第一株被描述的嗜熱氨氧化微生物,已在46℃的環(huán)境中培養(yǎng)了長達(dá)6年的時(shí)間。研究表明,該古細(xì)菌在中度嗜熱的條件下具有較好的氨氧化性能,在0.14和0.79mM氨濃度時(shí)活性最高,但在3.08mM氨濃度時(shí)部分被抑制。由于該菌的性質(zhì)非常特殊,所以有學(xué)者建議它應(yīng)該屬于除泉古菌界和廣古菌界外的另一個(gè)新的分類單元Thaumarchaeota。克隆A14-1、A14-10、A14-16和A14-22都與氨氧化作用密切有關(guān),它們在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一個(gè)大的分枝(圖5)。該類序列在樣品A14中所占比例高達(dá)77.3%。(2)Euryarchaeota廣古菌門包括古細(xì)菌的大多數(shù)種類,在A12文庫中所占比例高達(dá)62.5%,是該樣品中的絕對優(yōu)勢類群,但在A14文庫中沒有廣古菌門類微生物的分布。此外,A12文庫中的Euryarchaeota都屬于產(chǎn)甲烷鬃毛菌(Methanosaeta),該屬微生物是很多厭氧環(huán)境中最主要的產(chǎn)甲烷古菌。主要克隆A12-11與MethanosaetathermophilaPT(嗜熱甲烷鬃毛菌)的同源性達(dá)98%,是親緣關(guān)系最近的已培養(yǎng)菌種。MethanosaetathermophilaPT最早分離自污泥消化反應(yīng)器,為革蘭氏陰性桿菌,專性厭氧,最適生長溫度為55～60℃,最適生長pH為7左右,只能利用乙酸進(jìn)行生長和產(chǎn)甲烷,不能利用H2-CO2、甲酸、甲胺和甲醇進(jìn)行生長,生長時(shí)不需要NaCl。目前,該菌種的全基因組已經(jīng)獲得了測序。3民宿中細(xì)菌和古細(xì)菌群落的組成第利用分子生物學(xué)方法分析兩熱泉樣品中古細(xì)菌的多樣性,結(jié)果表明熱泉中古細(xì)菌主要分屬泉古菌門(Crenarchaeota)和廣古菌門(Euryarchaeota)兩個(gè)門。其中Euryarchaeota是山灣子溫泉A12(74.5℃)的優(yōu)勢類群,而Crenarchaeota是七家溫泉A14(61.4℃)的優(yōu)勢類群。A14文庫的古細(xì)菌多樣性水平明顯比A12高,表明溫度是影響溫泉中古細(xì)菌多樣性的重要環(huán)境因子。此外,在兩文庫中還存在少量的未分類的古細(xì)菌,這些特殊的微生物類群是認(rèn)識(shí)和研究新型古細(xì)菌的良好材料。產(chǎn)甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)在樣品A12中占統(tǒng)治地位,所占比例高達(dá)62.5%。該屬古細(xì)菌只能利用乙酸作為碳源生長和產(chǎn)甲烷,它們廣泛分布在厭氧環(huán)境中,尤其是各類厭氧反應(yīng)系統(tǒng)中,例如污泥厭氧消化反應(yīng)器、固體廢棄物處理系統(tǒng)、UASB反應(yīng)器和厭氧折流板反應(yīng)器等。在厭氧反應(yīng)器的起始階段,因?yàn)橄到y(tǒng)中乙酸濃度較高,所以產(chǎn)甲烷鬃毛菌往往具有很高的數(shù)量。但像本研究這樣,產(chǎn)甲烷鬃毛菌在74.5℃的溫泉系統(tǒng)中占統(tǒng)治地位的現(xiàn)象在類似研究中還比較罕見。產(chǎn)生這種特殊現(xiàn)象的主要原因可能是,A12溫泉中細(xì)菌和古細(xì)菌之間形成了一種特殊的共生關(guān)系,細(xì)菌在源源不斷地為產(chǎn)甲烷鬃毛菌提供生長所需要的唯一碳源——乙酸。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),在樣品A12的細(xì)菌群落中,厭氧芽胞桿菌屬(Anoxybacillus)細(xì)菌的比例高達(dá)93.5%,占絕對統(tǒng)治地位。該屬細(xì)菌在厭氧條件下可以葡萄糖、果糖、海藻糖和淀粉等多種有機(jī)物為底物進(jìn)行發(fā)酵代謝,最主要的發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸和氫氣。此外,樣品A12細(xì)菌群落的其他成員均為醋弧菌屬(Acetivibrio)細(xì)菌,該屬微生物發(fā)酵碳水化合物的主要產(chǎn)物同樣也是乙酸。因此,山灣子溫泉A12中,細(xì)菌和古細(xì)菌形成了類似厭氧水處理系統(tǒng)中的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌的共生關(guān)系:細(xì)菌主要通過厭氧發(fā)酵有機(jī)物產(chǎn)生乙酸和氫氣,而古細(xì)菌主要以細(xì)菌產(chǎn)生的乙酸為底物進(jìn)行生長和產(chǎn)甲烷。正是這種共生關(guān)系的存在,才導(dǎo)致產(chǎn)甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)在樣品A12中占統(tǒng)治地位。七家溫泉A14的古細(xì)菌群落和與山灣子溫泉A12截然不同,該樣品中77.3%的序列與好氧氨氧化作用有關(guān)。氨氧化作用是好氧微生物將銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮的過程。作為硝化作用的限速步驟,氨氧化作用在氮素生物地球化學(xué)循環(huán)過程中一直備受關(guān)注。長期以來,人們普遍認(rèn)為Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria中的好氧化能自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌是氨氧化作用的主要承擔(dān)者。然而,隨著近年來微生物分子生態(tài)學(xué)研究的不斷深入,人們逐漸發(fā)現(xiàn)氨氧化古菌廣泛分布在海水、土壤、河口沉積物、珊瑚、海綿以及廢水生物反應(yīng)器等各種自然和人工環(huán)境中。在很多條件下,氨氧化古菌的數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氨氧化細(xì)菌。因此,氨氧化古菌在全球氮素循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。早期人們發(fā)現(xiàn)的氨