新疆花蠶豆根腐病菌的分離、培養(yǎng)和致病性研究

新疆花蠶豆根腐病菌的分離、培養(yǎng)和致病性研究

甘薯是一種廣泛分布于世界各地的蔬菜和豆類。它主要分布在黃淮地區(qū)和黑龍江恢復(fù)區(qū)。隨著人民生活水平的提高,對(duì)包括花蕓豆在內(nèi)的豆類食品種類和數(shù)量的需求越來(lái)越多。然而,多種病害時(shí)常危害花蕓豆的種植,其中根腐病是花蕓豆的重要病害之一,一般可減產(chǎn)10%~20%,重病地可減產(chǎn)40%,甚至絕收。因此,查明花蕓豆根腐病病原,掌握其發(fā)病規(guī)律并制定相應(yīng)的防治措施,對(duì)于花蕓豆種植業(yè)健康發(fā)展無(wú)疑具有重要意義。近年來(lái),花蕓豆在新疆的種植面積不斷擴(kuò)大,同時(shí)根腐病的發(fā)病率也不斷上升。雖然,已經(jīng)從病原、病原的生物學(xué)特性及藥劑處理多角度嘗試進(jìn)行了花蕓豆根腐病的初步研究,但新疆相關(guān)花蕓豆根腐病的研究還極少。因此,本研究旨在探索不同條件下花蕓豆根腐病的發(fā)病規(guī)律,為花蕓豆根腐病的防治提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面供試品種為黑河2號(hào),由阿勒泰地區(qū)布爾津縣布爾津鄉(xiāng)種子公司提供。病土、病株采集于布爾津花蕓豆連作5年以上的發(fā)病田。1.2樣品的制備1.2.1培養(yǎng)基pda將采集回來(lái)的病株、病土和帶菌種子分別接入普通培養(yǎng)基[馬鈴薯葡萄糖(PDA)]和專選擇性培養(yǎng)基(察氏、胡蘿卜、沒(méi)食子、燕麥瓊脂培養(yǎng)基)上。在25~27℃下培養(yǎng),待長(zhǎng)出孢子后進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng),將長(zhǎng)滿菌絲的培養(yǎng)基風(fēng)干后粉碎、封裝;同時(shí)制備空白培養(yǎng)基一份。1.2.2細(xì)菌濾液的制備取病原菌-培養(yǎng)基及空白-培養(yǎng)基各20g,加入1000mL無(wú)菌水,在恒溫條件下浸提42h,過(guò)濾后得到病原原液和空白培養(yǎng)基原液。1.3花制定苗的培養(yǎng)方法土壤進(jìn)行高溫滅菌,種子、花盆嚴(yán)格消毒,花盆直徑150mm,每盆播種10粒,置于25~27℃下恒溫培育幼苗,2d澆1次蒸餾水。病原濾液濃度在10×10倍顯微鏡下,每視野8~10個(gè)孢子,于花蕓豆播種的當(dāng)天、第6d和第10d各接1次,每盆20mL,重復(fù)3次,以空白培養(yǎng)基為對(duì)照。第20d用水將盆土充分浸泡,將土坨輕輕倒出,用流水慢慢沖洗附泥,檢測(cè)根部發(fā)病情況。1.4室內(nèi)生物學(xué)特性試驗(yàn)1.4.1預(yù)處理4.5溫度試驗(yàn):溫度梯度為5℃,10℃,15℃,20℃,25℃,光照時(shí)間0h,通氣條件為棉塞封口;pH值為7。光長(zhǎng)試驗(yàn):光照時(shí)間為8h,12h,16h,溫度為20℃,通氣條件為棉塞封口,pH7。通氣條件試驗(yàn):通氣條件為膠塞封口、棉塞封口、紗布封口,光照時(shí)間0h,pH7。酸堿度試驗(yàn):pH值梯度為3,4,5,6,7,8,光照時(shí)間0h,溫度為20℃,通氣條件為棉塞封口。將浸有病原濾液的濾紙圓餅(直徑6mm)接入PDA培養(yǎng)基上,蒸餾水為對(duì)照,重復(fù)3次。分別于48h,72h,96h測(cè)量菌落生長(zhǎng)半徑。1.4.2試驗(yàn)條件及試驗(yàn)結(jié)果溫度梯度為10℃,15℃,20℃,25℃;土壤含水量梯度為4%,8%,12%,16%,20%;pH梯度為4.0,5.0,6.0,7.0,8.0;容重梯度為1.0,1.1,1.2,1.3,1.5。試驗(yàn)除溫度試驗(yàn)外均在15℃恒溫下進(jìn)行,光照條件均為12h,花盆為150mm,每盆病土重500g,播種10粒,3次重復(fù)。2d補(bǔ)蒸餾水1次,第20d洗根,檢測(cè)發(fā)病情況。1.5內(nèi)部防御試驗(yàn)1.5.1d/l模型材料的制備選取7種殺菌劑:50%多菌靈、70%甲基托布津、50%福美雙、70%甲霜靈錳鋅、50%拌種雙、50%五氯硝基苯、50%甲基立枯靈的可濕性粉劑,加入蒸餾水配制成1000,2000,4000mg/kg溶液。每一溶液吸10mL藥液均勻平鋪于75mmPDA培養(yǎng)基上,無(wú)菌水為對(duì)照。將制備好的4種病原濾液按1∶1的比例混合,把沾有病原濾液混合液的濾紙圓餅(直徑6mm)接入鋪有藥液的培養(yǎng)基上,每皿3個(gè),重復(fù)3次,空白濾液為對(duì)照。于24~26℃恒溫培養(yǎng),14d測(cè)量病原的生長(zhǎng)直徑。1.5.2不同溫度對(duì)盆菌土壤溫度的影響見(jiàn)表17種殺菌劑(同上)分別處理種子,藥劑量為種子重量的0.2%。每盆菌土500g,播種10粒,清水處理為對(duì)照,重復(fù)3次。分別置于15℃下恒溫培養(yǎng),2d補(bǔ)滅菌水1次。第18d洗根調(diào)查發(fā)病情況。1.5.3播深410的強(qiáng)制播種子處理同上,小區(qū)面積9m×9m。于4月10日,4月20日2次播種,播深5cm,播量140g/m2,3行為一個(gè)處理,各處理隨機(jī)排列,重復(fù)3次。待花蕓豆幼苗出土后,調(diào)查出苗數(shù),以后結(jié)合間、定苗,每10d抽取20株苗調(diào)查病情指數(shù)。2結(jié)果與分析2.1室內(nèi)病原體的生物學(xué)特性測(cè)試2.1.1芽孢桿菌屬heterwelling、立枯絲核菌f.oxsporum、木刑法經(jīng)不同培養(yǎng)基分離純化,共獲得4個(gè)真菌分離株,根據(jù)病原形態(tài)和回接植株的發(fā)病癥狀,初步鑒定為:終極腐霉菌(Pythiumultimum)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、木賊鐮刀菌(F.equseti)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani),并分離出孢囊線蟲(Heteroderaglycines)。經(jīng)人工接菌后觀察致病情況,于20d后洗根鑒定結(jié)果顯示,4種病菌對(duì)花蕓豆均具致病性,孢囊線蟲可以制造許多傷口,有利于腐生菌的侵入。2.1.2不同立地條件下木剽刀菌的生長(zhǎng)情況引起花蕓豆根腐病的4種病原菌對(duì)花蕓豆幼苗的致病力是有差別的。調(diào)查發(fā)現(xiàn),經(jīng)單一病原接種,以終極腐霉發(fā)病最強(qiáng),其次為立枯絲核菌,木賊鐮刀菌的致病力最弱。尤其表現(xiàn)在幼苗的成活率和病情指數(shù)上,終極腐霉菌的差異十分明顯,存活率低于對(duì)照9.00個(gè)百分點(diǎn)(表1);病情指數(shù)高于木賊鐮刀菌24.59個(gè)百分點(diǎn)。苗高和側(cè)根數(shù)也具有相同的趨勢(shì)(病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),0級(jí):地下莖和根無(wú)病;1級(jí):地下莖和根有零星病斑,但不連片,須根上無(wú)病斑;2級(jí):地下莖和根有較多病斑,病斑面積占莖和根總面積的1/4以下,須根略微發(fā)病;3級(jí):地下莖和根有多數(shù)病斑,病斑面積占莖和根總面積的1/4以上,但不足1/2,幼苗生長(zhǎng)受阻,須根減少;4級(jí):地下莖和根病斑面積占莖和根總面積的1/2以上,須根病斑連片,部分須根脫落;5級(jí):地下莖和根布滿病斑,須根全部脫落,主根變黑、縊縮)。2.1.3不同通氣條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響溫度是影響病原菌生長(zhǎng)的重要因子之一。在中低溫區(qū),不同溫度下菌落生長(zhǎng)速度的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著溫度的升高幾種病原菌生長(zhǎng)速度均呈現(xiàn)出加快的趨勢(shì),但在整個(gè)試驗(yàn)溫度區(qū)間內(nèi)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)速度最為緩慢。病原菌起始生長(zhǎng)的溫度差異顯著,5℃低溫下只有木賊鐮刀菌和終極腐霉菌能緩慢生長(zhǎng);10℃時(shí)木賊鐮刀菌和終極腐霉菌生長(zhǎng)速度較快。光照時(shí)間不同病原菌的生長(zhǎng)速度反應(yīng)也不同。木賊鐮刀菌和終極腐霉菌對(duì)光照時(shí)間較敏感,隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng),生長(zhǎng)速度逐漸下降;尖孢鐮刀菌則不受光照時(shí)間變化的影響。封口材料不同造成通氣條件的差異,試驗(yàn)結(jié)果顯示,通氣條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響差異不明顯,尤其是終極腐霉菌和立枯絲核菌在各種條件下均能迅速生長(zhǎng)。隨著pH的增加病原菌生長(zhǎng)的速度逐漸加快,但pH大于7以后又有減小的趨勢(shì)。中性偏酸均有利于病原菌的生長(zhǎng)。其中,尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌和終極腐霉菌在pH為3時(shí)均不生長(zhǎng),立枯絲核菌的pH適應(yīng)范圍較寬,在pH為3和8時(shí)仍能生長(zhǎng)得很好;尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌和終極腐霉菌對(duì)pH均比較敏感,在pH中性偏堿時(shí)生長(zhǎng)速度明顯下降,具體情況見(jiàn)表2。2.2最佳抑菌效果試驗(yàn)結(jié)果表明,各種殺菌劑對(duì)混合病原致病菌均有不同程度的抑菌作用,并隨著藥劑濃度的增加抑菌效果逐漸增強(qiáng)。其中,抑菌效果最好的是多菌靈可濕性粉劑,菌群生長(zhǎng)幾乎完全被抑制,菌落擴(kuò)展直徑最小;其次是甲基立枯靈和福美霜,菌群凈生長(zhǎng)量也受到了明顯的抑制,藥劑濃度最高為400mg/kg時(shí),相對(duì)抑菌率分別為93.4%和85.0%;抑制效果最差的是甲霜靈錳鋅,其藥劑濃度為400mg/kg時(shí),相對(duì)抑菌率只有62.5%(表3)。2.3家庭游泳池測(cè)試2.3.1花制定病趨勢(shì)根腐病的發(fā)生與土壤濕度關(guān)系密切,土壤含水量為4%時(shí),種子吸水膨脹困難,發(fā)病率較低。土壤含水量為8%時(shí),植株發(fā)病明顯加重,根部表皮傷口較多。土壤含水量大于16%時(shí),植株發(fā)病率有增大趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果顯示,花蕓豆根腐病的發(fā)生與土壤含水量關(guān)系密切,土壤含水量過(guò)大或過(guò)小均不利于幼苗生長(zhǎng),植株弱小抗病力差,易受病菌侵染而發(fā)病,從而使病情加重。土壤含水量適宜,根腐病發(fā)生就較輕。土壤酸堿度與花蕓豆根腐病的發(fā)生關(guān)系非常密切,土壤酸性程度越高越有利于根腐病的發(fā)生,中性偏酸有利于植株生長(zhǎng),發(fā)病較輕。土壤容重的試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著土壤容重的增加,花蕓豆根腐病的發(fā)病程度逐漸加重。土壤越疏松越有利于花蕓豆幼根生長(zhǎng)發(fā)育,根腐病發(fā)病較輕,土壤過(guò)于緊實(shí)黏重,根系生長(zhǎng)緩慢,不發(fā)達(dá),易受到損傷,有利于病菌侵入,植株發(fā)病較重(表4)。2.3.2根腐病的防治藥劑防效試驗(yàn)結(jié)果與室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果大致相同,但拌種雙在低溫且水分充足的條件下,對(duì)花蕓豆根部有輕度藥害現(xiàn)象。對(duì)根腐病的抑制作用從病情指數(shù)上看,防病效果最顯著的是多菌靈,較對(duì)照低30.8個(gè)百分點(diǎn),其次是甲基托布津和福美雙,只有拌種雙高于對(duì)照2.4個(gè)百分點(diǎn)。各處理的出苗率均明顯高于對(duì)照,以甲基托布津、福美雙處理的種子出苗率最高,分別高于對(duì)照21.7和16.1個(gè)百分點(diǎn);其次是甲基立枯靈和多菌靈。根長(zhǎng)和株高情況均好于對(duì)照(表5)。2.3.3保苗、保苗和防效分期播種的花蕓豆出苗情況顯示,早播田以福美雙保苗效果最好,高于對(duì)照16.3個(gè)百分點(diǎn),甲基立枯靈最差比對(duì)照少0.6個(gè)百分點(diǎn),其余各處理均有不同程度的保苗效果。適播田出苗率普遍高于早播田,保苗效果以福美雙最好,高于對(duì)照9.7個(gè)百分點(diǎn),其次是五氯硝基苯和多菌靈,也顯著好于對(duì)照。各處理的保苗幅度略低于早播田,早播對(duì)防效影響比較大的是甲基托布津和五氯硝基苯。防效比較穩(wěn)定的藥劑是福美雙、五氯硝基苯和多菌靈,在各種條件下均有保持較高程度的防病效果(表6)。病情指數(shù)也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì),值得注意的是甲基立枯靈對(duì)花蕓豆根系的伸長(zhǎng)有不同程度的抑制作用,拌種雙的藥害現(xiàn)象在田間表現(xiàn)不明顯。3不同藥劑處理對(duì)新疆花東南角的影響通過(guò)病原分離、鑒定,初步確定引起新疆花蕓豆根腐病的病原主要由終極腐霉菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、孢囊線蟲等多種病原菌侵染所致。其中,致病力以終極腐霉菌、立枯絲核菌較強(qiáng),其他幾種病原菌較弱。經(jīng)過(guò)對(duì)致病菌生物學(xué)特性的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致新疆花蕓豆根腐病的各種主要病原菌,其生物學(xué)特性差異顯著。終極腐霉菌和木賊鐮刀菌較耐低溫,5℃即可生長(zhǎng),尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)發(fā)育要求較高溫度,15℃生長(zhǎng)速度仍較為緩慢。木賊鐮刀菌和終極腐霉菌受光照時(shí)間影響較大,喜歡黑暗的條件。通氣條件對(duì)病原菌影響不大,厭氧狀態(tài)大多數(shù)病原菌仍能正常生長(zhǎng)。中性偏酸的環(huán)境有利于病原菌的生長(zhǎng),立枯絲核菌的適宜生長(zhǎng)范圍更寬一些。由此來(lái)看,早春低溫的環(huán)境條件下,植株生長(zhǎng)發(fā)育速度較慢,而終極腐霉菌、木賊鐮刀菌和立枯絲核菌等在土壤中卻能正常生長(zhǎng)、侵染和發(fā)病,從而導(dǎo)致新疆花蕓豆根腐病常常在