國自然申請攻略-04基金標(biāo)書-立項(xiàng)依據(jù)邏輯框架

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「說服力」1框架性思維2按“套路”走3不只是簡單拼湊目錄1框架性思維2按“套路”走3不只是簡單拼湊PART01輾轉(zhuǎn)反側(cè)，立項(xiàng)依據(jù)如何下筆？先理清思路！做好框架！再動筆！「」我們的科學(xué)假說是如何得來的？前期準(zhǔn)備，做到心中有數(shù)12345科學(xué)問題X具有Z效應(yīng)臨床問題發(fā)現(xiàn)XX作用于Y「」1框架性思維2按“套路”走3不只是簡單拼湊PART02為了驗(yàn)證假說并解決問題，我們打算做什么項(xiàng)目內(nèi)容？邊寫邊問7個問題！1234567要解決的臨床問題是什么？為解決這個臨床問題，別人做了什么科學(xué)研究？別人的科學(xué)研究中，有哪些是沒有解決的科學(xué)問題？為了解決這些科學(xué)問題，我們做了什么前期研究？我們的前期研究中，有哪些需要進(jìn)一步探索？我們的科學(xué)假說是什么？「」這是評審專家關(guān)心的也是我們需要逐一解決的按“套路”走HOW?「」六步走M(jìn)ini-review600-800字提出臨床問題Mini-review800-1000字聚焦科學(xué)問題Mini-review600-1000字引入研究對象提出科學(xué)假設(shè)前期工作實(shí)驗(yàn)證據(jù)概括項(xiàng)目研究內(nèi)容文獻(xiàn)佐證按“套路”走「」（1）老齡心肌缺血/再灌注（IR）損傷與缺血預(yù)適應(yīng)（IPC）保護(hù)人口老齡化是當(dāng)今世界一個突出性的社會問題，我國人口老齡化發(fā)展速度尤其之快。提高老年人的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為全社會研究的重要課題。冠心病是引起老年人死亡的最常見原因，其基本病理生理過程是心肌缺血，盡早恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)能夠挽救缺血心肌，但再灌注引起缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusioninjury,IRI）。缺血預(yù)適應(yīng)（ischemicpreconditioning,IPC）是心肌保護(hù)的新概念，是迄今為止最強(qiáng)的內(nèi)源性心肌缺血保護(hù)方法。但由于老齡心肌細(xì)胞發(fā)生退行性變，心肌細(xì)胞自噬能力降低，線粒體功能下降（mtDNA突變），氧化應(yīng)激增強(qiáng)，老齡導(dǎo)致內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的生成減少以及IR損傷中發(fā)重要作用的蛋白質(zhì)（膜受體、下游的激酶、磷酸酶、促炎細(xì)胞因子等）表達(dá)/活性發(fā)生改變等，導(dǎo)致老齡心肌對缺血預(yù)適應(yīng)刺激的敏感性減弱或消失。因此，迫切需要有效的措施改善或恢復(fù)老齡心肌對缺血預(yù)適應(yīng)刺激的敏感性，提高老齡心肌抗缺血損傷的能力，進(jìn)而提高老年人的生存率。

——見附件-案例1《外源性多胺恢復(fù)老齡大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究》

社會問題臨床問題社會需求臨床現(xiàn)象Step1提出臨床問題「」大背景介紹：XX疾病目前現(xiàn)狀（流行病學(xué)），簡要介紹你研究的疾病及其危害。Step1提出臨床問題社會需求老齡化現(xiàn)象冠心病目前已有治療手段缺血性預(yù)適應(yīng)對老年人的效果不好疾病臨床現(xiàn)象疾病治療問題社會問題「」Tips要解決的臨床問題是什么？回答問題Step1提出臨床問題「」據(jù)實(shí)說明問題的嚴(yán)重性引入數(shù)值等更具可信度，更有說服力

TipsStep1提出臨床問題「」（2）多胺代謝帶有多價正電荷的小分子多胺（polyamine,PAs）包括精胺（spermine,SP）,精脒（spermidine,SPD）及腐胺（putrescine,PU），廣泛存在于迄今人們所研究的所有真核細(xì)胞和原核細(xì)胞內(nèi)，為細(xì)胞的生長、分化和增殖所必需，并在許多病理過程中發(fā)揮重要作用……因此，SSAT過度激活（多胺分解代謝增強(qiáng)）引起組織細(xì)胞損傷.（3）多胺的生物學(xué)作用多胺具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)控線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)（MPT）、調(diào)控離子通道、促細(xì)胞增殖及在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用等……Eisenberg證明精脒延長壽命的機(jī)制是通過抑制組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶使組蛋白去乙?；M(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活自噬相關(guān)基因atg7,atg11和atg15,誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。（4）衰老心肌自噬能力下降及其影響的下游事件自噬是存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，通過自噬清出細(xì)胞內(nèi)受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對生物體正常發(fā)育及防治老化有積極的作用。分子水平上的研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)自噬和調(diào)節(jié)衰老的信號通路之間存在相互聯(lián)系……因此提示：衰老的心肌細(xì)胞→自噬能力下降→老化和受損的線粒體堆積→氧自由基產(chǎn)生增加→mPTP開放數(shù)目增加→細(xì)胞凋亡。這可能是老齡心肌喪失缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的重要機(jī)制。小分子多胺在這一級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮怎樣的作用?還不清楚？

Step2聚焦科學(xué)問題小背景介紹：由XX疾病，再趨向本課題研究的方向進(jìn)行切入與引導(dǎo)，讓評委容易跟隨作者的思路！層層深入見附件-案例1

開始提煉關(guān)鍵詞科學(xué)問題雛形「」小背景介紹：由XX疾病，再趨向本課題研究的方向進(jìn)行切入與引導(dǎo)，讓評委容易跟隨作者的思路！層層深入從臨床問題過渡到科學(xué)問題！Step2聚焦科學(xué)問題「」不要泛泛而談層層遞進(jìn)有理有據(jù)

TipsStep2聚焦科學(xué)問題「」再來一個栗子——見附件-案例2《內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥及破骨細(xì)胞分化信號通路在假體周圍骨溶解骨組織中的作用及機(jī)制研究》

小結(jié)「」——見附件-案例2

國內(nèi)外動態(tài)+預(yù)實(shí)驗(yàn)+前期研究對科學(xué)問題進(jìn)一步明確Step3引入研究對象「」為解決這個臨床問題，別人做了什么科學(xué)研究？別人的科學(xué)研究中，有哪些是沒有解決的科學(xué)問題？Step3引入研究對象回答問題「」

我們在前期研究中，臨床上獲取了胃癌組織及其癌旁組織樣本，采用qRT-PCR檢測其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-488在胃癌組織中顯著低表達(dá)。接著通過在線預(yù)測軟件microRNA.org確定了AREG和相應(yīng)miR-488結(jié)合的靶位點(diǎn)，AREG3‘-UTR與miR-488序列間存在特異結(jié)合區(qū)域，說明AREG是miR-488的靶基因（見研究工作基礎(chǔ)）。因此，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)證據(jù)，我們提出了以下假說：在胃癌細(xì)胞中，miR-488下調(diào)AREG基因的表達(dá)，減少了其與EGFR的結(jié)合，從而抑制了ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致胃癌血管新生受阻，減少細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且對化療敏感性有一定影響（見圖3）。

——見附件-案例3《miR-488靶向調(diào)控AREG基因介導(dǎo)ERK信號通路對胃癌血管生成及化療敏感性的調(diào)控機(jī)制》

Step4提出科學(xué)假設(shè)

我們在前期研究中，臨床上獲取了胃癌組織及其癌旁組織樣本，采用qRT-PCR檢測其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-488在胃癌組織中顯著低表達(dá)。接著通過在線預(yù)測軟件microRNA.org確定了AREG和相應(yīng)miR-488結(jié)合的靶位點(diǎn)，AREG3‘-UTR與miR-488序列間存在特異結(jié)合區(qū)域，說明AREG是miR-488的靶基因（見研究工作基礎(chǔ)）。因此，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)證據(jù)，我們提出了以下假說：在胃癌細(xì)胞中，miR-488下調(diào)AREG基因的表達(dá)，減少了其與EGFR的結(jié)合，從而抑制了ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致胃癌血管新生受阻，減少細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且對化療敏感性有一定影響（見圖3）?！姼郊?案例3《miR-488靶向調(diào)控AREG基因介導(dǎo)ERK信號通路對胃癌血管生成及化療敏感性的調(diào)控機(jī)制》

「」圖3？Step4提出科學(xué)假設(shè)

我們在前期研究中，臨床上獲取了胃癌組織及其癌旁組織樣本，采用qRT-PCR檢測其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-488在胃癌組織中顯著低表達(dá)。接著通過在線預(yù)測軟件microRNA.org確定了AREG和相應(yīng)miR-488結(jié)合的靶位點(diǎn)，AREG3‘-UTR與miR-488序列間存在特異結(jié)合區(qū)域，說明AREG是miR-488的靶基因（見研究工作基礎(chǔ)）。因此，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)證據(jù)，我們提出了以下假說：在胃癌細(xì)胞中，miR-488下調(diào)AREG基因的表達(dá)，減少了其與EGFR的結(jié)合，從而抑制了ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致胃癌血管新生受阻，減少細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且對化療敏感性有一定影響（見圖3）。——見附件-案例3《miR-488靶向調(diào)控AREG基因介導(dǎo)ERK信號通路對胃癌血管生成及化療敏感性的調(diào)控機(jī)制》

「」簡潔清爽style高端大氣styleStep4提出科學(xué)假設(shè)「」Anyway！一圖勝千言！分子機(jī)制圖很必要！Step4提出科學(xué)假設(shè)「」我們的科學(xué)假說是什么？回答問題Step4提出科學(xué)假設(shè)「」情況1：申報人前期基礎(chǔ)扎實(shí)（延續(xù)性研究）前期我們在國家自然科學(xué)基金課題的資助下（NO.30770878，2007-2010，本人為課題主持人）在離體灌流成年大鼠心臟上首次發(fā)現(xiàn)，IPC處理能夠上調(diào)成年大鼠心肌的多胺合成代謝（多胺合成限速酶ODC表達(dá)增加，總多胺池增加），給予ODC特異性抑制劑α-difluoromethylornithine(DFMO)取消了IPC介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用，證明多胺是介導(dǎo)IPC心肌保護(hù)作用的內(nèi)源性信號分子（見后面工作基礎(chǔ)）；進(jìn)一步證明IPC誘導(dǎo)的ODC/多胺通路上調(diào)主要與PKC、Erk1/2、PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。文章發(fā)表在MolCellBiochem.2009(332)135–144上。之前我們的另一項(xiàng)國家自然科學(xué)基金資助課題(NO.30470688，2005—2007,本課題申請人為第二完成人）的研究發(fā)現(xiàn),缺血/再灌注(IR)損傷心肌多胺代謝失衡，腐胺增加，精脒、精胺減少總多胺池耗竭。外源性精胺(1mmol/L)能補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)的多胺池，并通過下調(diào)死亡受體通路、抑制線粒體凋亡通路、清除自由基、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載發(fā)揮心肌保護(hù)作用。文章發(fā)表在EuropeanJournalofPharmacology2007,（562）236–246.上（見后面工作基礎(chǔ)）。

——見附件-案例1

Step5前期實(shí)驗(yàn)證據(jù)「」情況1：申報人前期基礎(chǔ)扎實(shí)（延續(xù)性研究）

前期我們在國家自然科學(xué)基金課題的資助下（NO.30770878，2007-2010，本人為課題主持人）在離體灌流成年大鼠心臟上首次發(fā)現(xiàn)，IPC處理能夠上調(diào)成年大鼠心肌的多胺合成代謝（多胺合成限速酶ODC表達(dá)增加，總多胺池增加），給予ODC特異性抑制劑α-difluoromethylornithine(DFMO)取消了IPC介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用，證明多胺是介導(dǎo)IPC心肌保護(hù)作用的內(nèi)源性信號分子（見后面工作基礎(chǔ)）；進(jìn)一步證明IPC誘導(dǎo)的ODC/多胺通路上調(diào)主要與PKC、Erk1/2、PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。文章發(fā)表在MolCellBiochem.2009(332)135–144上。之前我們的另一項(xiàng)國家自然科學(xué)基金資助課題(NO.30470688，2005—2007,本課題申請人為第二完成人）的研究發(fā)現(xiàn),缺血/再灌注(IR)損傷心肌多胺代謝失衡，腐胺增加，精脒、精胺減少總多胺池耗竭。外源性精胺(1mmol/L)能補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)的多胺池，并通過下調(diào)死亡受體通路、抑制線粒體凋亡通路、清除自由基、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載發(fā)揮心肌保護(hù)作用。文章發(fā)表在EuropeanJournalofPharmacology2007,（562）236–246.上（見后面工作基礎(chǔ)）。

——見附件-案例1

Step5前期實(shí)驗(yàn)證據(jù)既往國自然主持情況（相關(guān)項(xiàng)目）既往文章發(fā)表情況（相關(guān)課題）「」

我們在前期研究中，臨床上獲取了胃癌組織及其癌旁組織樣本，采用qRT-PCR檢測其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-488在胃癌組織中顯著低表達(dá)。接著通過在線預(yù)測軟件microRNA.org確定了AREG和相應(yīng)miR-488結(jié)合的靶位點(diǎn)，AREG3'-UTR與miR-488序列間存在特異結(jié)合區(qū)域，說明AREG是miR-488的靶基因（見研究工作基礎(chǔ)）。因此，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，我們提出了以下假說：在胃癌細(xì)胞中，miR-488下調(diào)AREG基因的表達(dá)，減少了其與EGFR的結(jié)合，從而抑制了ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致胃癌血管新生受阻，減少細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且對化療敏感性有一定影響（見圖3）。情況2：申報人前期基礎(chǔ)較差，且相關(guān)的前人研究太少Step5前期實(shí)驗(yàn)證據(jù)「」

我們在前期研究中，臨床上獲取了胃癌組織及其癌旁組織樣本，采用qRT-PCR檢測其表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-488在胃癌組織中顯著低表達(dá)。接著通過在線預(yù)測軟件microRNA.org確定了AREG和相應(yīng)miR-488結(jié)合的靶位點(diǎn)，AREG3'-UTR與miR-488序列間存在特異結(jié)合區(qū)域，說明AREG是miR-488的靶基因（見研究工作基礎(chǔ)）。因此，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，我們提出了以下假說：在胃癌細(xì)胞中，miR-488下調(diào)AREG基因的表達(dá)，減少了其與EGFR的結(jié)合，從而抑制了ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致胃癌血管新生受阻，減少細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且對化療敏感性有一定影響（見圖3）。生信預(yù)測預(yù)實(shí)驗(yàn)情況2：申報人前期基礎(chǔ)較差，且相關(guān)的前人研究太少Step5前期實(shí)驗(yàn)證據(jù)「」回答問題為了解決這些科學(xué)問題，我們做了什么前期研究？Step5前期實(shí)驗(yàn)證據(jù)「」

本課題將在原有工作基礎(chǔ)上，在器官、細(xì)胞及分子水平上觀察青年與老年IR與IPC心肌多胺代謝變化的規(guī)律和特點(diǎn)，探討老齡心肌IR損傷及IPC保護(hù)和多胺水平變化的內(nèi)在聯(lián)系。觀察外源性多胺對老齡IPC心肌細(xì)胞自噬、線粒體功能、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響。通過誘導(dǎo)或阻斷自噬（siRNA干擾）和調(diào)控線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)（開放或抑制mPTP）干預(yù)，探討外源性多胺是否通過誘導(dǎo)自噬/減少線粒體損傷/抑制氧化應(yīng)激/抗凋亡級聯(lián)重現(xiàn)老齡心肌IPC保護(hù)作用。并進(jìn)一步細(xì)胞、亞細(xì)胞水平上探討多胺發(fā)揮作用的準(zhǔn)確效應(yīng)靶點(diǎn)。以上問題的解決將能夠驗(yàn)證我們提出的“多胺是介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)的內(nèi)源性信號分子、多胺代謝通路可能成為老年心肌缺血/再灌注損傷防治的新靶點(diǎn)”的假說。目前，國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本課題的完成，為老齡心肌缺血/再灌注損傷的防治提供一種新思路、新靶點(diǎn)和新的技術(shù)平臺。具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

——見附件-案例1

但關(guān)于老齡IR與IPC心肌多胺代謝的特點(diǎn)和規(guī)律如何？外源性多胺能否恢復(fù)老齡心肌對IPC刺激的敏感性？如果能，其機(jī)制是什么？以及多胺在老齡IPC心肌保護(hù)中作用的準(zhǔn)確效應(yīng)靶點(diǎn)是什么？這些還不清楚，這些是本課題研究的主要內(nèi)容。Step6概括研究內(nèi)容「」Tips：大致提出解決方法即可有哪些需進(jìn)一步探索

本課題將在原有工作基礎(chǔ)上，在器官、細(xì)胞及分子水平上觀察青年與老年IR與IPC心肌多胺代謝變化的規(guī)律和特點(diǎn)，探討老齡心肌IR損傷及IPC保護(hù)和多胺水平變化的內(nèi)在聯(lián)系。觀察外源性多胺對老齡IPC心肌細(xì)胞自噬、線粒體功能、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響。通過誘導(dǎo)或阻斷自噬（siRNA干擾）和調(diào)控線粒體通透轉(zhuǎn)運(yùn)（開放或抑制mPTP）干預(yù)，探討外源性多胺是否通過誘導(dǎo)自噬/減少線粒體損傷/抑制氧化應(yīng)激/抗凋亡級聯(lián)重現(xiàn)老齡心肌IPC保護(hù)作用。并進(jìn)一步細(xì)胞、亞細(xì)胞水平上探討多胺發(fā)揮作用的準(zhǔn)確效應(yīng)靶點(diǎn)。以上問題的解決將能夠驗(yàn)證我們提出的“多胺是介導(dǎo)缺血預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)的內(nèi)源性信號分子、多胺代謝通路可能成為老年心肌缺血/再灌注損傷防治的新靶點(diǎn)”的假說。目前，國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本課題的完成，為老齡心肌缺血/再灌注損傷的防治提供一種新思路、新靶點(diǎn)和新的技術(shù)平臺。具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。