復合酶對草魚selavolvamer的半纖維素酶的影響

復合酶對草魚selavolvamer的半纖維素酶的影響

隨著人口的增加和資源的消耗，可再生資源的開發(fā)和利用已成為一個共同關注的問題。在植物生長發(fā)育的產物中，半纖維素是顆粒和養(yǎng)分中的主要碳氫化合物。例如，桿重量的25%-50%半纖維素是可再生資源的另一個重要因素。半纖維磷酸酶是提取和提取植物中的其他成分的一個重要問題。同時，一些半纖維素酶可以廣泛應用于食品加工、低聚糖制備、食品加工、紙漿溶解、紙漿糊等。草，又名馬鞭草和傘狀草，位于中國南方，具有很高的營養(yǎng)價值。它是世界上第五大重要的經濟栽培品種。草主要生長在草質纖維中，能有效分解纖維和半纖維素。因此，這些酶系的研究對于草質纖維的開發(fā)和利用具有重要意義。這只是誘導、分布和重新定位半纖維素酶系。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器主要試劑購于美國SIGMA公司,包括:木聚糖(xylan,frombirchwood),果膠,p-nitrophonyl-α-L-arabinofuranoside,p-nitrophonyl-β-xyloside,p-hydroxybenzoicacidhydrazide(PAHBAH),phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF);其它試劑:羧甲基纖維素(CMC)購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;3-(N-Morpholino)propanesulfonicacid(MOPS)購于上海申能博彩有限公司.UV-2000分光光度計(UNICO),IECmultiry高速冷凍離心機(ThermoIEC).1.2種子培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基草菇(Volvariellavolvacea)菌種:由南京師范大學何強泰先生惠贈.種子培養(yǎng)基:蔗糖20g/L,KH2PO40.6g/L,MgSO40.5g/L,VB10.5mg/L,瓊脂20g/L.搖瓶培養(yǎng)基:各種不同的碳源10g/L,KH2PO40.6g/L,MgSO40.5g/L,VB10.5mg/L.1.3蘑菇的生長和粗酶的制備1.3.1蘑菇1種子在37℃靜止培養(yǎng)4～5d,搖瓶于37℃,200r/min培養(yǎng)4～5d.1.3.2離心除雜液制備將草菇的搖瓶培養(yǎng)液用尼龍布過濾,取濾液;在4℃以9600r/min離心10min,取上清液;用80%飽和度的硫酸銨在4℃沉淀并平衡2h,在4℃以9600r/min離心10min,取沉淀;用適量的pH6.5的MOPS溶解,所得的溶液即胞外酶液.1.3.3mops的勻漿將草菇的搖瓶培養(yǎng)液用尼龍布過濾,取菌絲體;用25mmol/LpH6.5的MOPS洗3遍后,將菌絲體在4℃用勻漿器勻漿10min,加入適量的pH6.5的MOPS得到勻漿液;在4℃以9600r/min離心10min,取上清液,即得到胞內酶液.1.4酶活性測定1.4.1mops-pahbahv的合成100μL質量分數0.5%的木聚糖,酶液20μL25mmol/L,pH6.5的MOPS反應5min,結束后,加600μL終止劑/顯色劑PAHBAH[配方為:V(0.5mol/LNaOH):V(溶于0.5mol/LHCl的質量分數為5%PAHBAH)=4∶1],沸煮10min,冷卻后測A410值.1.4.2rophonyl--xylo創(chuàng)造取30μL的酶液,加10μL20mmol/L的p-nitrophonyl-β-xyloside,加160μL的25mmol/LpH6.5的MOPS,45℃反應30min,再加入700μL1mol/L的Na2CO3終止反應,測A405值.1.4.3hocyl--l-arab內即:4-3,5-三甲基-5,5-三甲基-5,5-三甲基-5,5-甲基-5,5,5-甲基-5,5,5,5-特征參比hocyl-4e,4e的合成取30μL的酶液,加10μL25mmol/L的p-nitrophonyl-α-L-arabinofuranoside,加160μL的25mmol/LpH6.5的MOPS,45℃反應30min,再加入700μL1mol/L的Na2CO3終止反應,測A405值.1.4.4酶單位u的定義1在該反應條件下,1min內催化產生1μmol產物所需的酶量.1.5酶屬性的測定1.5.1最合適反應溫度的測量1在20～80℃范圍內,每隔5℃,分別測定酶活.以酶活最高為100%,計算相對酶活.1.5.2計算相對活性在不同的pH條件下分別測定酶活,以酶活最高為100%,計算相對活性.在pH3.8～5.8范圍內,緩沖液是50mmol/L鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液,在pH5.8～8.0范圍內,緩沖液是50mmol/L磷酸緩沖液.1.5.3溫度值的測定在相對穩(wěn)定的pH條件下,使酶在某個溫度下保溫不同的時間,再測定相對酶活,以未保溫(4℃保存)的酶樣活性為100%,確定酶的半衰期為1h的溫度值.1.5.4ph穩(wěn)定1酶在不同的pH條件下保溫相同的時間,分別測定殘留酶活性與不保溫的酶活比,計算百分比.緩沖液的選擇參考1.5.2方法.2結果與分析2.1木聚糖酶的組成半纖維素酶系中的木聚糖酶主要是胞外酶,木糖糖苷酶是胞內酶,阿拉伯糖苷酶胞內、胞外都有(見表1).這樣的分布與酶的催化作用有一定的相關性,木聚糖酶是內切酶,主要作用于木聚糖主鏈,因為木聚糖主鏈很難進入細胞膜,所以木聚糖酶主要分布在胞外.木糖糖苷酶主要分解低聚木糖,產生菌體能直接利用的糖,因此木糖糖苷酶主要分布在胞內.而阿拉伯糖苷酶主要是分解側枝,與木聚糖酶和木糖糖苷酶有協同作用,因此胞內、胞外都有.研究中木聚糖酶的主要誘導因子是木聚糖,木糖糖苷酶的主要誘導因子也是木聚糖;阿拉伯糖苷酶是木聚糖、CMC、果膠混合誘導.2.2反應的最佳條件2.2.1反應溫度1最合適的溫度由圖1可以看出,半纖維素酶系中的木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的最適反應溫度是60℃,木糖糖苷酶的最適反應溫度是55℃.2.2.2最合適反應ph1由圖2可知,阿拉伯糖苷酶的最適反應pH是5.0,木聚糖酶的最適反應pH是5.8,木糖糖苷酶的最適反應pH是6.6.2.3酶的穩(wěn)定性2.3.1木聚糖酶的測定由圖3可以看出,阿拉伯糖苷酶在pH4.6～6.6時都比較穩(wěn)定,在pH5.8時最穩(wěn)定;木聚糖酶在pH5.0～7.4比較穩(wěn)定,在pH5.8時最穩(wěn)定;木糖糖苷酶在pH5.8～7.4比較穩(wěn)定,在pH7.0時最穩(wěn)定.2.3.2糖苷酶半衰溫度的測定由圖4可知,半纖維素酶系中的阿拉伯糖苷酶保溫1h,酶活的半衰溫度為60℃,木聚糖酶的半衰溫度為52℃,木糖糖苷酶的半衰溫度為55℃.3半纖維素酶系統草質纖維是一個復合結構,其中木質素由芳香烴衍生物以C—C鍵和—O—鍵縱橫交聯在一起,其側枝又與半纖維素結合形成一個十分致密的網絡結構,將纖維素緊緊包裹在里面,所以要降解纖維素,必須先降解木質素和半纖維素.目前,國內對半纖維素酶的研究集中在對木聚糖酶的研究,而對阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶研究還較少,對于這兩種酶酶學特性的研究,將有利于我們對草質纖維的有效降解及對半纖維素酶的有效應用.草菇有降解半纖維素的一整套酶系統.使用不同