卷柏屬藥材穗花杉雙黃酮含量測定

卷柏屬藥材穗花杉雙黃酮含量測定

柏樹是柏樹科的一種干燥的柏樹草。它生長在干燥的巖石上。目前，發(fā)現(xiàn)了約700種，分布在世界各地，中國約50種，約25種藥物。卷柏屬藥用植物中主要成分是雙黃酮,其中包括由芹菜素、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮和異柳杉素等活性物質(zhì),廣泛用于經(jīng)閉痛經(jīng)、癜瘕痞塊、跌打損傷、化淤止血、吐血、崩漏、便血、脫肛等治療中。其中以穗花杉雙黃酮是卷柏的代表性、特征性化學(xué)成分,具有廣泛的藥理活性,研究表明穗花杉雙黃酮及其衍生物可作為一類新的天然的人組織蛋白酶抑制劑,具有神經(jīng)保護作用,且其在卷柏中的含量遠高于其他中草藥。但《中國藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中缺乏對常見卷柏中穗花杉雙黃酮含量的測定,本文旨在建立測定穗花杉雙黃酮含量的反高效液相色譜法,并對常見的5種卷柏屬藥材中穗花杉雙黃酮進行含量測定,為有效控制卷柏藥材及其制劑質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1儀器、試劑和試劑儀器:Agilent110高效液相色譜檢測儀(二極管陣列檢測器);超純水器(960002型,美國Labconco公司);分析天平(沈陽龍騰電子有限公司);超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司,KQ-250型);奧立龍828酸度計(美國奧立龍公司)。試劑:穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品和測定樣品:江南卷柏、簿葉卷柏、深綠卷柏、單籽卷柏、兗州卷柏)購置于中國藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純,山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司);磷酸(優(yōu)級純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);水為重蒸水。1.2方法1.2.1流動相、柱溫色譜柱為PurospherstarC18柱(250×4.6mm,5μm);流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(65:35);超聲波脫氣;流速設(shè)定為0.8ml/min;柱溫設(shè)定為30℃;檢測波長為337nm;理論塔板數(shù)按穗花杉雙黃酮峰計算不低于6000。1.2.2穗花杉雙黃酮準(zhǔn)儲備液的配制準(zhǔn)確稱取穗花杉雙黃酮準(zhǔn)品10.3mg,置于50ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋定容至刻度,渦旋振蕩充分溶解,此溶液為0.206g/L的穗花杉雙黃酮準(zhǔn)儲備液,放入4℃冰箱中備用。1.2.3提取液的制備將上述5種樣品粉碎,過篩后精確稱取1g,置于索氏提取器中,以70ml氯仿回流脫色至無色后過濾,殘渣加入70ml甲醇,充分溶解后加熱回流提取至溶液呈無色,過濾,將提取液蒸干,殘渣復(fù)加甲醇溶解并定容至50ml。1.3統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,均數(shù)以(uf8e5x±s)表示,以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。2結(jié)果2.1方法的特異性研究流動相未干擾穗花杉雙黃酮出峰,出峰時間為19.83±0.14min,見圖1-2。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線方程精密吸取穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品3、6、9、12和15μl依次進樣,每個進樣5次,以穗花杉雙黃酮峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=3853.510X+17.426(r=0.9994,P=0.018),線性范圍為0.05-0.60μg。2.3加標(biāo)回收率試驗精密吸取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液15μl,重復(fù)進樣5次,分別測定峰面積,計算RSD%。精密稱取已知含量的樣品約1.5g,共6份,精密吸取并加入0.2mg/ml的穗花杉雙黃酮溶液1.0ml,按供試液的處理方法,制備溶液。分別量取進樣15μl,計算加標(biāo)回收率。經(jīng)測定RSD%=4.3%,回收率為98.5%,表明本方法準(zhǔn)確,可靠,精密度高。2.4穩(wěn)定試驗取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每隔2h進樣一次,共5次,測定峰面積,計算RSD%,結(jié)果表明RSD=0.15%,穩(wěn)定性良好。2.5樣品中穗花杉雙黃酮濃度的測定5種卷柏樣品分別稱取相同重量,按照項目“1.2.3”程序制備溶液,并按“1.2.1”色譜條件進樣,每次進樣10μl,每個樣品進樣5次,測定樣品中穗花杉雙黃酮濃度,見表1。3卷柏類藥物中穗花杉雙黃酮含量測定的價值卷柏類藥物臨床應(yīng)用廣泛,具有多種藥理學(xué)作用,研究表明其主要活性物質(zhì)穗花杉雙黃酮具有組織蛋白酶抑制劑作用,可對氧化和β淀粉狀蛋白質(zhì)引起的神經(jīng)細胞毒性有較強的保護作用,且可以對局部腦組織缺血性抽搐和阿爾茲海默癥等神經(jīng)退化性病變具有一定的治療效果,因此受到醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛關(guān)注?！吨袊幍洹穼戆仡愃幬镏兴牖ㄉ茧p黃酮的作用等雖然有明確記載,但卻缺乏對常見卷柏中穗花杉雙黃酮含量的測定標(biāo)準(zhǔn),極大程度上限制了臨床藥物質(zhì)量的檢驗工作。液相色譜法在穗花杉雙黃酮的含量檢測方面已有應(yīng)用,檢測效果比較好,但部分研究表明梯度洗脫有程序繁瑣,且耗時長等缺點,因此,本研究采用RP-HPLC的方法,以甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相,結(jié)果表明測得穗花杉雙黃酮的線性范圍為0.05-0.60μg/ml,回歸方程為Y=3853.510X+17.426(r=0.9994,P=0.018),線性關(guān)系良好,加標(biāo)回收率為98.5%,且穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好,未出現(xiàn)