利用重組自交系群體構(gòu)建的大豆分子遺傳圖譜整合

利用重組自交系群體構(gòu)建的大豆分子遺傳圖譜整合

到目前為止，已有150多種細菌和老細菌、兩種植物（arabidopsisthara和ory澤）以及一系列非脊椎動物和動物，包括人類的全組序列的研究完成。但對大多數(shù)的植物物種來說，由于基因組本身的復雜性及其資金等原因，DNA分子遺傳圖譜的構(gòu)建及不斷利用新開發(fā)的標記飽和遺傳圖譜仍然是結(jié)構(gòu)基因組研究和分子遺傳學研究的重要內(nèi)容之一。大豆(Glycinemax)就是其中之一。1988年，Apuya等利用大豆的2個栽培種[Glycinemax(L.)Merr.]Minsoy和Noir1雜交得到的F2群體，構(gòu)建了大豆的第一張分子遺傳圖，該圖包含了4個連鎖群，僅有11個RFLP標記。以此為標志，大豆進入了分子作圖的時代。隨后，又有多種DNA分子標記(如SSR、AFLP、RAPD)應用到大豆遺傳圖譜的構(gòu)建中，直至1999年以前，RFLP標記一直占據(jù)主導地位，但是由于RFLP在大豆中的低多態(tài)性及多座位性，使其在大豆分子遺傳圖的大規(guī)模構(gòu)建和飽和中很難得到很好的利用。SSR標記以其共顯性、高多態(tài)性、座位單一且穩(wěn)定等優(yōu)點被Akkaya等(1995)首先應用于大豆分子遺傳圖構(gòu)建。在大豆分子遺傳圖的構(gòu)建過程中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)僅僅依靠單一的標記或某個單一的作圖群體很難構(gòu)建成大豆高密度的分子遺傳圖(ShoemakerandSpecht,1995;keimetal.,1997;Ferreiraetal.,2000;呂蓓等,2005)。1999年Cregan等利用SSR標記對已有的由“Minsoy×Noir1”、“Clark×Harosoy”和“A81-356022×PI468916”3個作圖群體構(gòu)建的3張大豆遺傳圖進行了整合，構(gòu)建了一個包含1423個標記的“公共圖譜”，其中有606個SSR標記，顯示了SSR標記在整合遺傳圖譜中的重要作用。2004年Song等利用新開發(fā)的SSR引物和5個作圖群體“Minsoy×Noir1”、“Minsoy×Archer”、“Archer×Noir1”、“Clark×Harosoy”和“A81-356022×PI468916”，進一步對原來的大豆遺傳圖進行了整合和進一步的飽和，整合成迄今最新的、標記數(shù)目最多的一張大豆“公共圖譜”，其中包含SSR標記數(shù)目達到了1015個。顯而易見，SSR標記已成為大豆遺傳圖譜構(gòu)建及整合中的主力標記。自1997年以來，中國也有多張大豆分子遺傳圖譜構(gòu)建完成(張德水等,1997,科學通報,42(12),1326-1330;劉峰等,2000;吳曉雷等,2001;宛煜嵩等,2005;呂蓓等,2005)，早期的圖譜基本是以RFLP和AFLP標記為主，SSR標記較少，難以和現(xiàn)有的以SSR為主的“公共圖譜”進行比較。目前，在國內(nèi)以SSR標記為主的圖譜中，包含SSR標記最多的是2005年宛煜嵩等利用大豆重組自交系群體(Jinf)構(gòu)建的包含227個SSR標記的圖譜，不過該圖譜中的其中7個連鎖群存在有10個間隙(gap)。2005年呂蓓等利用AFLP技術(shù)對Jinf群體進行了AFLP遺傳作圖，希望消除宛煜嵩等構(gòu)建的連鎖圖上的一些大區(qū)間和間隙并進一步飽和，結(jié)果有52個AFLP標記被整合到遺傳連鎖圖上，實驗結(jié)果證明大部分整合的AFLP標記位于連鎖群的末端或成簇分布，未能很好的填補間隙和飽和圖譜。本研究試圖在以上工作的基礎(chǔ)上，利用“錨定SSR標記”策略，選用2個F2作圖群體(03172和03197)，整合一張基于SSR標記的大豆遺傳圖譜，使其成為大豆基因組和分子育種研究的實用性很強的工作圖譜。1材料和方法1.1fps1的聯(lián)合培育本研究共有3個作圖群體，RIL作圖群體是重組自交系Jinf群體(晉豆23×ZDD2315)，由山西省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所和海南省熱帶農(nóng)業(yè)資源開發(fā)利用研究所聯(lián)合培育(劉學義等,2003);F2作圖群體是黑龍江省農(nóng)科院大豆研究所和海南省熱帶農(nóng)業(yè)資源開發(fā)利用研究所聯(lián)合培育，編號分別為03172(哈交96-9×ZYD677)和編號為03197(黑農(nóng)33×ZDD2315)。F2作圖群體于2004年6月至10月在黑龍江省種植獲得F1植株和F2種子，2004年10月至2005年1月在海南省資源所種植F2種子，分別隨機選取03172群體的95個株系和03197群體的180個株系用于作圖。作圖群體的親本主要性狀見表1。在95個株系的F2群體03172中，共選有132對SSR引物對其進行基因型分析，其中母本基因型占27.8%，父本基因型占26.7%，雜合基因型為45.5%；在180個株系的F2群體03197中，共選用A2和G上的26個SSR引物進行基因型分析，母本基因型為24.1%，父本基因型為21.1%，雜合基因型為54.8%;2個F2組合群體均符合1:2:1的孟德爾的理論分離比率，說明2個F2群體有正常的遺傳結(jié)構(gòu)，可以用于遺傳作圖分析。1.2ssr引物合成以2004年Song等發(fā)表的“公共圖譜”為參照，在USDA的SoyBase數(shù)據(jù)庫(http://soybase.agron.ias/)中選取592對SSR引物，其中441對引物由LifeTechnologyInc.合成，另外151對引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。1.3pcr反應及電泳以大豆苗期新鮮葉片為材料，采用本實驗室常用的CTAB法提取DNA(王珍和方宣鈞,2003)。PCR擴增反應參照Cregan等(1999)采用15μl反應體系，包括30ng總DNA模板，1.5μmol/L引物(上游及下游)，2.5mmol/LdNTP,1.5μl10×PCRbuffer,1.5mmol/LMg2+,1UTaq酶，ddH2O補齊。PCR反應在MJResearchInc.PTC-100型PCR儀上運行，反應程序為94℃預變性5min;94℃變性25s,47℃退火25s,72℃復性45s;35個循環(huán)；72℃延伸10min。電泳方法參照鄭景生和呂蓓(2003)的方法進行。電泳緩沖液：1×TBE，擴增產(chǎn)物4μl,6×loadingbuffer[15%聚蔗糖(Ficoll400型)，0.03%溴酚藍，0.03%二甲苯青FF,0.4%OrangeG,10mmol/LTris-HCl(pH=7.5),50mmol/LEDTA]0.5μl，混合，上樣。采用北京六一儀器廠DYⅢ-88A型電泳槽，300V，電泳2h(視SSR分子量大小及差異帶型的可辨程度調(diào)整電泳的時間)。將電泳后的凝膠放在10%乙醇+0.5%冰乙酸中固定3min，然后在10%乙醇+0.5%冰乙酸+0.2%硝酸銀中染色5min，再用蒸餾水漂洗，最后在3%氫氧化鈉+0.5%甲醛中顯色5～10min。沖洗干凈后記錄帶型。1.4圖譜的重新計算及預處理將母本的帶型(標記基因型)記為“A”，父本的帶型記作“B”，缺失或模糊的帶型記作“-”，雜合及異常的帶型記作“H”。利用Joinmap3.0(Stam,1993)對03172和03197的F2群體進行圖譜的構(gòu)建。為了在計算方法上一致，利用Joinmap軟件對原來的由RIL群體(Jinf)構(gòu)建的圖譜進行重新計算。在進行正式的連鎖分析和分組前先進行數(shù)據(jù)的預處理，把帶型缺失過多的、帶型完全相同的標記進行排除。首先是計算標記間的LOD值和配對重組率，LOD值4.0被應用于F2群體(03172和03197群體)的連鎖群構(gòu)建；LOD值6.0被應用于RIL群體(Jinf群體)的連鎖群構(gòu)建。參照“公共圖譜”對這3個群體對應的連鎖群進行整合，重組值通過Kosambi作圖函數(shù)轉(zhuǎn)換為遺傳距離。2結(jié)果與分析2.1ssr和aflp的擴增本研究在宛煜嵩等(2005)、呂蓓等(2005)研究的基礎(chǔ)上，選用592對SSR引物對03172和03197群體有針對性地進行引物篩選，將有87個新的SSR引物整合到原有SSR圖譜中，構(gòu)建出了一張包含315個SSR和40個AFLP標記的大豆分子遺傳圖，總圖距為1937.6cM，標記間平均圖距為5.48cM(圖1)?？傮w來看，整合后的圖譜與“公共圖譜”有較好的標記對應關(guān)系。與宛煜嵩等(2005)構(gòu)建的圖譜相比A2、C1、C2、D1b、G連鎖群均有大量的標記增加(表2)。2.2標記的排列順序宛煜嵩等2005年利用免費的Mapmaker3.0軟件對Jinf作圖群體進行了SSR圖譜的構(gòu)建。為了圖譜整合的需要，本研究重新利用商業(yè)軟件Joinmap3.0對原有Jinf群體SSR數(shù)據(jù)進行了處理。數(shù)據(jù)分析表明，在同等預設(shè)LOD值條件下，兩種軟件構(gòu)建的圖譜在標記順序和標記間的距離這兩個方面存在差異。標記的順序差異較為突出，如A1連鎖群中有很多標記順序發(fā)生了變化，其中Satt382、Satt599等標記順序與原圖譜相比發(fā)生了明顯的變化，由原來的末端轉(zhuǎn)換到另一邊，與最新的“公共圖譜”有更好的符合度；D2連鎖群中原圖譜中鄰近的Satt461和Satt301在重新構(gòu)建后分開，與“公共圖譜”有很好的一致性；在H連鎖群中這種標記順序的不同尤為明顯，在原圖譜中的H連鎖群上的Satt222～Satt469區(qū)間，原有順序依次為Satt222、Satt279、Satt314、Sat＿118、Sat＿122、Satt541、Satt469，而采用Joinmap3.0進行分析后，標記順序變?yōu)镾att469、Satt541、Sat＿122、Sat＿118、Satt222、Satt279、Satt314，對比“公共圖譜”我們可以清楚的看到后者與“公共圖譜”完全一致(圖2)。宛煜嵩等采用Mapmaker3.0構(gòu)建的圖譜中，存在很多同一個連鎖群上標記由于間隙太大不能連接起來的情況，這種情況在使用Joinmap3.0重新進行連鎖分析后，由于標記順序的改變，大部分可以很好的連鎖起來且與“公共圖譜”的符合度較好，如H、L、K等連鎖群中存在的間隙在重新作圖后間隙消除，在H連鎖群中，隨著Satt222～Satt469區(qū)間的標記順序改變，原來圖譜中包含Satt469的連鎖群就和含有Satt317標記的連鎖群之間的間隙就不復存在；在L連鎖群中，原有圖譜中的Satt561所在連鎖群很好的添加到Satt398所在連鎖群中，消除了一個間隙。盡管在預設(shè)條件相同的情況下，使用不同的作圖軟件處理相同數(shù)據(jù)會產(chǎn)生標記排列順序的變化，從而導致同一連鎖群的標記多少和標記間間隙大小的變化，但我們也看到兩種不同軟件針對大豆Jinf群體SSR標記數(shù)據(jù)作的連鎖圖譜中，大多數(shù)標記的順序還是相同的，相同順序標記之間的圖譜距離幾乎是相同的。如在H連鎖群中雖然其它標記的排列順序在兩種不同軟件所作出的圖譜中有很大的差別，但Satt353、Satt568、Satt442這3個標記在2個圖譜中排列順序沒有發(fā)生變化，其圖距分別為Mapmaker3.0中的15.8cM、16.0cM和Joinmap3.0中的15.0cM、16.1cM，幾乎一致。在連鎖群中其它同樣的情況下，標記之間的圖距也幾乎相同。2.3ssr標記整合本研究是基于宛煜嵩等(2005)構(gòu)建的圖譜的基礎(chǔ)上進行的。選用513對SSR引物對03172群體進行多態(tài)性篩選，共有213對引物有明顯多態(tài)性，多態(tài)率為41.5%；選用531對SSR引物對03197群體進行多態(tài)性篩選，共有231對引物有多態(tài)性，多態(tài)率為43.5%。我們選定了2至3個以上在3個作圖群體中均有多態(tài)性的SSR標記作為圖譜整合的錨定標記(anchoringmarker)。根據(jù)已有的圖譜信息，A2和G連鎖群來源的多態(tài)SSR引物主要針對03197群體的180個株系進行基因型的分析，其它連鎖群來源的SSR引物主要針對03172群體進行基因型分析。從表2中我們可以看出，整合后A2、C1、C2、D1b、G連鎖群添增的標記數(shù)目較多，特別是原來標記數(shù)目較少的C1連鎖群上，標記數(shù)目從7個增加到了25個；除F、H、K連鎖群外其他連鎖群也均有不同程度的增加。通過Jinf圖譜和03172群體作圖數(shù)據(jù)的整合共增加了72個SSR標記，通過對A2、G連鎖群上SSR標記對03197群體的多態(tài)篩選和連鎖分析，共有14個標記添加到A2和G連鎖群上。整合后的圖譜，部分原有SSR標記排列順序發(fā)生，如在A2連鎖群中隨著標記Satt409、Satt228、Satt378的整合添加，原有的間隙得到了消除；Satt333、Satt329、Satt327之間順序也重新排列，整合后的圖譜和“公共圖譜”的符合度更好(圖3)。從圖譜整合的總體情況看，整合前后圖譜各連鎖群的標記順序沒有大的改變。3討論3.1錨定ssr標記在2個以上的作圖群體中對SSR引物進行多態(tài)性篩選，在每個連鎖群中選定在2個以上的作圖群體中均有多態(tài)的SSR標記(crossmappingpopulationsSSR)至少2個作為“錨定標記(anchoringmarker)”，以這些錨定標記引物為基礎(chǔ)，利用Joinmap計算方法進行圖譜的整合策略，我們稱之為“錨定SSR標記”圖譜整合策略。從整合后的圖譜看，尤其是A2、C1、C2、D1b、G連鎖群的整合情況看，這種錨定策略是可行的。整合后的圖譜的各連鎖群沒有出現(xiàn)大的變動，大大減輕了圖譜構(gòu)建中的繁重工作量。但受SSR引物數(shù)目的限制，本研究除A2、C1、C2、G連鎖群外僅有在原Jinf群體作圖后沒有添加到圖譜中的214個SSR引物可供在多態(tài)性篩選添加使用，這在一定程度上影響了03172群體本身的作圖效果。由于在單個連鎖群體中標記數(shù)目較少或因“錨定標記”與其它多態(tài)標記之間遺傳距離太遠，這些標記在連鎖分析時就不能在允許的LOD值范圍內(nèi)形成連鎖群，這種情況就造成了F、H、K未能增加新的標記。在今后的圖譜整合構(gòu)建中，盡量在連鎖群中均勻的選取更多的標記，可避免這種情況的出現(xiàn)。3.2基于jinp3.0的遺傳數(shù)據(jù)處理功能Joinmap3.0是由Stem(1993)開發(fā)的，已經(jīng)開始廣泛應用于遺傳連鎖圖的構(gòu)建。雖然Mapmaker3.0和Joinmap3.0軟件連鎖分析的算法基礎(chǔ)是相同的，但很顯然商用的遺傳作圖軟件Joinmap3.0提供了更加強大的數(shù)據(jù)處理分析功能和良好的用戶操作界面。特別是對原始數(shù)據(jù)的預處理，減少了人為的誤差，連鎖群的整合功能更是Joinmap3.0所獨有的作圖功能。值得注意的是，使用Joinmap3.0對原有Jinf數(shù)據(jù)處理的SSR標記順序比Mapmaker3.0處理的更加符合“公共圖譜”順序，可能與“公共圖譜”是由Joinmap3.0構(gòu)建的有關(guān)。比較兩種軟件的作圖效果，我們認為采用Joinmap3.0來構(gòu)建遺傳連鎖圖的效果應該更好。3.3fpssr標記整合RIL群體和F2群體都是常見的用于遺傳作圖的群體(方宣鈞等,2001)。重組自交系群體用于遺傳作圖有2個優(yōu)點，一是重組自交系作圖群體在家系變成純合前經(jīng)歷了多次減數(shù)分裂，重組程度高于F2群體，以致由RIL群體構(gòu)建的圖譜比F2的有著更高的解析度，在圖譜位置上很臨近的標記也可以區(qū)分開來。二是RIL群體屬于永久群體，適合于做更多的基于圖譜的基因組分析和QTL定位研究。但不可忽視的是構(gòu)建重組自交系群體經(jīng)歷多次的傳代和人為的選擇，群體發(fā)生異常偏分離的可能性很大。群體家系的異常偏分離引起的是基因型的異常偏分離，實際的作圖群體并不一定能夠代表理論群體，導致影響計算標記間的實際遺傳距離。顯而易見，F(xiàn)2群體的優(yōu)點就是圖譜構(gòu)建簡單且不易出現(xiàn)偏分離。在國外發(fā)表的圖譜中用F2群體構(gòu)建圖譜占了相當?shù)谋壤?，國?nèi)在大豆中迄今還未見有