實(shí)驗(yàn)報(bào)告 之 果蠅及其他物種的遺傳分析

果蠅及其他物種的遺傳分析班號：周二上午組號：一組組員：風(fēng)英鄧潔201011202942塔吉尼沙姑麗尼格爾專業(yè)：生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)日期：2012年10月-11月摘要：本綜合實(shí)驗(yàn)以果蠅雜交實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，將同工酶分析實(shí)驗(yàn)和遺傳分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)有機(jī)的相結(jié)合，利用果蠅實(shí)驗(yàn)中獲得的材料，進(jìn)一步從基因組和蛋白質(zhì)水平上對不同的物種或者同一物種不同個(gè)體之間的差異以及遺傳性親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。首先通過經(jīng)典的果蠅雜交實(shí)驗(yàn)，利用野生型和黑檀體殘翅果蠅兩對性狀來驗(yàn)證非等位基因的自由組合定律。接下來通過對小鼠、魚、大果蠅以及親代果蠅和子代果蠅同工酶的分析進(jìn)行探究種群的基因結(jié)構(gòu)的變化和種內(nèi)、種間的親緣關(guān)系。最后，通過對于油松的親子代遺傳標(biāo)記分析，檢驗(yàn)油松的種子來源是否可靠，并分析其潛在父本和具體的位置。關(guān)鍵詞：果蠅雜交非等位基因自由組合同工酶遺傳分子標(biāo)記SSR分析Abstract:Thiscomprehensiveexperimentindrosophilahybridizationexperimentasthefoundation,willisozymeanalysisexperimentandgeneticmolecularmarkersexperimentoforganiccombination,theuseofdrosophilaobtainedfromtheexperimentmaterial,furtherfromthegenomeandproteinleveltodifferentspeciesorthesamespeciesdifferencesbetweendifferentindividualsandinheritedgeneticrelationshipandevolutionaryrelationshiptocarryontheanalysis.Firstofallthroughtheclassicaldrosophilahybridizationexperiment,theuseofwildtypeandebonybodyresidualwingfruitfliestwocharactertoverifynonallelicfreecombinationlaw.Nextthroughthemice,fish,bigfruitfliesandparentalfruitfliesandprogenydrosophilaisozymeanalysistoexplorethechangeofpopulationgeneticstructureandkindofinside,theinterspecificrelationship.Finally,throughtheforpinustabulaeformisfilialgenerationsofgeneticmarkeranalysis,inspectionofpinustabulaeformisseedsourcesisreliable,andanalyzesitspotentialmaleparentandthespecificposition.【原理】1.1果蠅雜交實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)中教師提供給學(xué)生多種突變類型的果蠅，學(xué)生經(jīng)過小組的討論決定使用哪些類型和具體實(shí)驗(yàn)方案。因此整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程是在完全開放狀態(tài)下進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)過程涉及到基因的顯隱性、連鎖、上位等多種關(guān)系，同時(shí)也會出現(xiàn)一些與期望值不同的結(jié)果。要求學(xué)生在一段時(shí)間內(nèi)安排好實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的現(xiàn)象和問題，并做出分析和判斷。果蠅（Drosophilamelanogaster）是雙翅目昆蟲，屬果蠅屬，約有2500種。通常用作遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)材料的是黑腹果蠅。它的生活史從受精卵開始，經(jīng)歷幼蟲、蛹、成蟲階段，因此是一個(gè)完全變態(tài)過程，1,。其作為實(shí)驗(yàn)材料有許多優(yōu)點(diǎn)：1.體型小，在瓶內(nèi)容易人工飼養(yǎng)2.易飼養(yǎng)。在常溫下，以玉米粉等作飼料就可以生長，繁殖。3.生長迅速，繁殖能力強(qiáng)。十二天左右就可完成一個(gè)世代，每個(gè)受精的雌蠅可產(chǎn)卵400～500個(gè)，因此在短時(shí)間內(nèi)就可獲得大量的子代，便于遺傳學(xué)分析。4.染色體數(shù)少。只有4對。有巨大染色體，并且遺傳背景清楚。5.突變性狀多，而且多數(shù)是形態(tài)突變，便于觀察。2果蠅生活史果蠅在25℃時(shí)，從卵到成蠅需10天左右，成蟲可活26～33天。果蠅的生活史如下：雌蠅→減數(shù)分裂→卵受精雄蠅→減數(shù)分裂→精子第一批成蟲羽化（第八天）（可活26～33天） 產(chǎn)第一批卵蛹（第四天）第二次蛻皮 第一批卵孵化（第二天） （第零天）第一次蛻皮幼蟲（第一天）果蠅的生活周期和各發(fā)育階段的經(jīng)過時(shí)間3果蠅的性別及突變性狀的鑒別：果蠅的每一體細(xì)胞有8個(gè)染色體（2n=8），可配成4對，其中3對在雌雄果蠅中是一樣的，稱常染色體。另外一對稱性染色體，在雌果蠅中是XX，在雄蠅中是XY。果蠅的雌雄在幼蟲期較難區(qū)別，但到了成蟲期區(qū)別相當(dāng)容易。雄性個(gè)體一般較雌性個(gè)體小，腹部環(huán)紋5條，腹尖色深，第一對腳的跗節(jié)前端表面有黑色鬃毛流蘇，稱性梳（Sexcombs）。雌性環(huán)紋7條，腹尖色淺，無性梳。實(shí)驗(yàn)中選用的果蠅突變性狀一般都可用肉眼鑒定，例如紅眼與白眼，正常翅與殘翅等。而另一些性狀可在解剖鏡下鑒定，如焦剛毛與直剛毛等?，F(xiàn)列表如下：實(shí)驗(yàn)中使用的果蠅突變品系影響部分突變名稱基因符號染色體上座位翅眼色體色剛毛翅形殘翅白眼黑體焦剛毛小翅vgwbsnmIIR67.0X1.5IIR48.5X21.0X36.1焦剛毛的基因座為sn3,本文簡寫為sn。4雌雄果蠅的辨認(rèn)個(gè)體大小雌大-雄小背面條紋雌5-雄3腹部形態(tài)雌尖-雄鈍腹片數(shù)量雌6-雄4交配器官雌產(chǎn)卵器-交尾器性梳有無雌無-雄有5．果蠅雜交實(shí)驗(yàn)知識與原理黑體果蠅的體色為黑色（e），與之相對應(yīng)的野生型果蠅的體色為灰色（E），灰色對黑色為完全顯性，控制這對相對性狀的基因位于第三號染色體上,果蠅的長翅為（VG）,殘翅為（vg）長翅對殘翅完全顯性，控制這對形狀的基因位于在二號。用具有這兩對相對性狀的兩純合親本雜交，性狀的遺傳行為應(yīng)符合自由組合定律。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹浚?.掌握遺傳學(xué)模式動物果蠅的特征與培養(yǎng)法2.學(xué)習(xí)雜交實(shí)驗(yàn)設(shè)置3.驗(yàn)證/分析遺傳學(xué)規(guī)律【實(shí)驗(yàn)方法和步驟】2.1果蠅雜交實(shí)驗(yàn)1.設(shè)計(jì)雜交組合：F1代雜合子F2代出現(xiàn)性狀分離①♀黑檀體長翅×♂灰體殘翅；雜交自交F1代雜合子F2代出現(xiàn)性狀分離②♀灰體殘翅×♂黑檀體長翅。領(lǐng)取果蠅瓶后做好標(biāo)記，放入相應(yīng)的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以便挑選。2.收集處女蠅：①放飛生長好、接近羽化蛹多的成蠅；②清除成蠅后，連續(xù)地在間隔為10小時(shí)左右的時(shí)間點(diǎn)收集處女蠅，通常為早上7：00，下午4：00，晚上10：00。每次收集完都要保持培養(yǎng)瓶內(nèi)無成蠅。3.雜交接種：分別取兩種組合各10對親本進(jìn)行雜交，次日檢查，如有死亡及時(shí)補(bǔ)。4.移出親本蠅：當(dāng)部分蛹變黑時(shí)進(jìn)行，此時(shí)F1即將孵出。凍存親本蠅：留正反交的雄雌蠅各40只（20只DNA實(shí)驗(yàn)、20只蛋白實(shí)驗(yàn)），儲存于4個(gè)小管中，作為后續(xù)“遺傳標(biāo)記”實(shí)驗(yàn)的材料。為防止失敗，可留存活蠅適當(dāng)時(shí)間。配制新培養(yǎng)基，供F1同胞交配使用。5.移出親本蠅：當(dāng)部分蛹變黑時(shí)進(jìn)行，此時(shí)F1即將孵出。凍存親本蠅：留正反交的雄雌蠅各40只（20只DNA實(shí)驗(yàn)、20只蛋白實(shí)驗(yàn)），儲存于4個(gè)小管中，作為后續(xù)“遺傳標(biāo)記”實(shí)驗(yàn)的材料。為防止失敗，可留存活蠅適當(dāng)時(shí)間。配制新培養(yǎng)基，供F1同胞交配使用。6.F1代果蠅的觀察和交配：在第一只F1代果蠅出現(xiàn)后10天內(nèi)，大約孵出7-9d時(shí)，觀察統(tǒng)計(jì)F1的性別、性狀及其對應(yīng)的數(shù)量，并選10對再雜交于1個(gè)新瓶，同時(shí)取20對凍存。7.移出F1代果蠅：在F1雜交，我們F1代雜交過程中正交雌雄比例4：5，反交雌雄比列2：8一周后，放飛F1。8.觀察、統(tǒng)計(jì)F2代的結(jié)果：在第一只F2代果蠅出現(xiàn)后10天內(nèi)，觀察統(tǒng)計(jì)F2的性別、性狀及其對應(yīng)的數(shù)量。正反交雌、雄果蠅均凍存20只用于后期的遺傳標(biāo)記實(shí)驗(yàn)?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】果蠅雜交實(shí)驗(yàn)親本類型和雜交組合親本♀（EEvgvg）×♂（eeVGVG）♀（eeVGVG）×♂（EEvgvg）F1數(shù)量♂♀♂♀32262329果蠅雜交實(shí)驗(yàn)F2代性狀數(shù)量統(tǒng)計(jì)表親本：P正交：♀（eeVGVG）×♂（EEvgvg）F2性狀灰體長翅（EEVGVG）黑檀體長翅（eeVGVG）灰體殘翅（EEvgvg）黑檀體殘翅（eevgvg）♂153496618♀162435711總數(shù)3159212329比例10.8：4：5.3：1果蠅雜交實(shí)驗(yàn)F2代性狀數(shù)量統(tǒng)計(jì)表親本：P反交：♀（EEvgvg）×♂（eeVGVG）F2性狀灰體長翅（EEVGVG）黑檀體長翅（eeVGVG）灰體殘翅（EEvgvg）黑檀體殘翅（eevgvg）♂106473810♀119444312總數(shù)225918122比例10.2：4.1：3.6：1【果蠅雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】：1.理論上F2代的形狀符合灰體長翅：黑檀體長翅：灰體殘翅：黑檀體殘翅=9：3：3：1①反交：♀（EEvgvg）×♂（eeVGVG）時(shí)，F(xiàn)2 個(gè)體總數(shù)為419，對其進(jìn)行適合度x2=(225-235.7)2/235.7+(91-78.6)2/78.6+(81-78.6)2/78.6+(22-19)2/19=2.99=此時(shí)0.25<P<0.5，說明與理論比數(shù)間沒有顯著差異；②正交：♀（eeVGVG）×♂（EEvgvg）時(shí)F2個(gè)體總數(shù)為559，對其進(jìn)行適合度檢驗(yàn)x2=(315-314.4)2/314.4+(92-104.8)2/104.8+(123-104.8)2/104.8+(29-34.9)2/34.9=5.72，此時(shí)0.25<P<0.1,說明與理論比數(shù)間沒有極顯著差異。通過對這次正反雜交實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)值理與論值之間沒有極顯著差異，可以證明自由組合定律并且可以證明兩隊(duì)相對形狀都不是伴性遺傳。2果蠅及其他物種的遺傳標(biāo)記分析（同工酶實(shí)驗(yàn)）【實(shí)驗(yàn)原理】同工酶：是指催化反應(yīng)相同，但結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的一族酶。是受遺傳體系決定的酶的不同分子形式。根據(jù)分子量、電荷，可以利用電泳分離。酯酶（Est）：催化酯類化合物水解的酶系.乳酸脫氫酶(LDH)：催化乳酸脫氫反應(yīng)的酶.應(yīng)用：遺傳育種、基因定位應(yīng)用：遺傳育種、基因定位。LDH染色原理：乳酸乳酸丙酮酸LDHNAD+NADHNBT(黃)NBTH(藍(lán)紫)PMS（氫遞體）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握同工酶分析的方法技術(shù)2.理解同工酶分析的遺傳學(xué)意義【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】果蠅及其他物種的遺傳標(biāo)記分析（同工酶）（1）提取酶液：將5只藍(lán)槍頭口事先在酒精燈上燒圓，制成槍頭杵子；取實(shí)驗(yàn)材料（普通果蠅30只、大果蠅10只、小鼠肝0.1g、魚肝0.1g）置于1.5ml離心管；加入700μL液氮后，在冰上用槍頭杵子搗碎至樣品成粉末狀且發(fā)白；在冰上，加入80μL組織勻漿液，充分懸浮樣品，每靜置7~8min吹打幾次,如此重復(fù)3次；4℃，13000rpm離心5min；移上清于另一離心管，-20℃保存。（2）配制分離膠（7.5%），配方如下：雙蒸水/mL4.94mL1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）/mL2.50mLAcr/Bis（30%）/mL2.50mLTEMED/μL10μL10%Aps/μL50μL總體積/mL10mL注入兩玻璃夾縫中（加到離短玻璃上緣2cm），膠面上加1cm蒸餾水（自然凝膠后傾出、除干凈）。配制濃縮膠（4%），配方如下：雙蒸水/mL2.21mL0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）/mL1.25mLAcr/Bis（30%）/mL1.50mLTEMED/μL10μL10%Aps/μL25μL總體積/mL5mL 加入兩玻璃夾縫中，并在兩玻璃板夾縫中水平插入梳子（注意有棱一面在短玻璃側(cè)），待凝膠后在緩沖液中小心拔出梳子。（3）樣品制備：酶液10μL與上樣緩沖液10μL（1:1）在PE手套上混勻。（4）加樣：小心地向每個(gè)上樣孔加入20μL的樣品，加樣順序依次為小鼠、魚、大果蠅、黑腹果蠅親代、黑腹果蠅后代F2，再順次重復(fù)一遍。（5）電泳：4℃冰盒中，180V電泳。（6）停止電泳:指示劑溴酚蘭移至底部約0.5cm時(shí)，切斷電源。（7）染色：在電泳過程中配染色液，在抽屜中避光保存；電泳結(jié)束后，小心從玻璃板中取下膠。去掉濃縮膠，將分離膠進(jìn)行染色至酶帶顯色。Est和LDH染色約20min，P0染色約5-10min，染色中注意要避光。（8）脫色、固定、保存：染色后的膠置于7%乙酸?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果和分析】EST染色結(jié)果結(jié)果分析：本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為模糊，無法準(zhǔn)確區(qū)分條帶數(shù)和條帶位置，但可大概看出黑腹果蠅后代和黑腹果蠅親代的羧基酯酶（Est）大致相同，其酯酶應(yīng)為二聚體；黑腹果蠅的條帶比較清晰，大果蠅，小鼠和魚的條帶比較模糊；大果蠅中間的條帶與黑腹果蠅親代和子代的兩個(gè)條帶位置相近，可推測黑腹果蠅和大果蠅親緣還是較近的。根據(jù)所學(xué)習(xí)的知識得二者都屬于果蠅屬。LDH染色結(jié)果結(jié)果分析：本實(shí)驗(yàn)基本未得到結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，染色后瓊脂糖膠上只有小鼠和魚處有模糊的條帶，小鼠條帶呈藍(lán)紫色、魚的條帶呈較模糊的黃色，最下端的為溴酚藍(lán)。沒有出現(xiàn)預(yù)期的5條條帶的酶譜。綜合分析：Est染色原理：酯的水解產(chǎn)物與偶氮化合物（如堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽）結(jié)合產(chǎn)生紅褐色物質(zhì)。查文獻(xiàn)可知，以萘乙酸酯（本實(shí)驗(yàn)中是醋酸α-萘酯和醋酸β-萘酯）為底物的同工酶屬于羧基的酯酶類，一般為單鏈或二聚蛋白質(zhì)[1]胡能書.同工酶技術(shù)及其應(yīng)用。也即說明羧基酯酶（Est）具有多態(tài)性。另羧基酯酶是由同一基因座位的復(fù)等位基因控制產(chǎn)生的同工酶即等位酶，一般是由一個(gè)基因座位的少數(shù)幾個(gè)突變而形成的等位基因控制產(chǎn)生；酶座位的多態(tài)性程度較高[2][1]胡能書.同工酶技術(shù)及其應(yīng)用[2]同工酶分析技術(shù)[3]張貴生.鑭暴露對鯉魚腦和肌肉中酶和脂質(zhì)過氧化水平的影響.水生生物學(xué)報(bào),2008,32(4):602—605查閱文獻(xiàn)知，酯酶的不同同工酶對醋酸—α萘酯和醋酸—β萘酯有不同的親和力，而且這種親和力是穩(wěn)定的，即每次先于醋酸—α萘酯或醋酸—β萘酯作用的同工酶，每次都顯褐色或紅色，如果是醋酸—α萘酯和醋酸—β萘酯同時(shí)能作某些同工酶的底物，則該同工酶總是染成紫褐色。本實(shí)驗(yàn)中條帶染色后顏色不盡相同，有的呈褐色，有的呈紫褐色，便是由于上述原因所致。查文獻(xiàn)可知，制樣對于材料沒什么特殊要求，只需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)工作的要求，通常是取新陳代謝比較活躍的部位。本實(shí)驗(yàn)中取材為魚或小鼠的任何一組織，前面提到魚的肝和肌肉中羧基酯酶（Est）酶譜條帶數(shù)不同，試推測取材組織可能對酶譜分析有一定影響，但未查閱到相關(guān)文獻(xiàn)解釋這究竟是什么原因所致。LDH染色查文獻(xiàn)可知，乳酸脫氫酶的幾種同工酶都是四聚體，由兩種不同肽鏈（亞基）α和β構(gòu)成，至少受兩個(gè)基因所控制?？刂痞羴喕慕凶鯝基因，控制β亞基的叫做B基因。例如絕大多數(shù)硬骨魚的乳酸脫氫酶就是由A和B兩個(gè)基因控制的，如果用基因型來表示，則LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5分別相當(dāng)于B4、B3A1、B2A2、B1A3和A4五種基因型。認(rèn)為B基因在生物進(jìn)化的過程中由A基因突變而來。另外，在魚類、鳥類和哺乳類中發(fā)現(xiàn)LDH還有第三個(gè)亞基，它的控制基因叫做C基因，由它控制的酶叫做C4LDH，在電場的分布明顯趨于陽極。隨后在魚類肝中發(fā)現(xiàn)的這種C4LDH，在電場中的分布明顯趨于陰極。后來證明C基因是由B基因突變而來。用分子雜交的方法證明無論是鳥類、魚類或哺乳類中，決定它們LDH同工酶的A、B、C三個(gè)基因都是同源的。LDH1泳向陽極，對熱、尿素耐受性強(qiáng)，LDH2、LDH3、LDH4按順序泳動速率減慢，LDH5在原位，最易被熱、尿素變性。本次實(shí)驗(yàn)中，LDH染色的結(jié)果十分不理想。造成這種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能有多種原因，首先是實(shí)驗(yàn)中，SDS電泳時(shí)膠底部形成一個(gè)較大條帶，導(dǎo)致部分區(qū)域?qū)щ姴蛔?，從而是電泳結(jié)果存在問題；另外，組織提取時(shí)也可能存在一些問題，因?yàn)橐旱獡]發(fā)性較高，而且加入液氮后組織塊變成快狀，很難研磨；實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)不夠理想的首要原因是染色效果不夠理想。綜上：查文獻(xiàn)可知，酶帶的產(chǎn)生既有它的遺傳背景，也會受生理（發(fā)育階段和存在的組織器官）、各種實(shí)驗(yàn)因素（染色方法、酶的濃度、電泳分辨率等）的影響。導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想的因素很多，情況較為復(fù)雜。前面提及，取的魚和小鼠的組織器官具有隨機(jī)性，且教師提供的魚和小鼠材料已經(jīng)處死，其發(fā)育階段也不清楚；在加液氮研磨材料時(shí)，由于液氮極易揮發(fā)，可能研磨不充分，最終酶提取液中酶濃度較低，未達(dá)到聚丙烯酰胺凝電泳的分辨率，進(jìn)而出現(xiàn)一片彌散或沒有條帶的現(xiàn)象；研磨及所有的步驟均由小組4人一起完成，各樣品分別由不同的同學(xué)進(jìn)行研磨及后續(xù)操作，不同人的操作能力、細(xì)心程度和實(shí)驗(yàn)狀態(tài)等都有不同程度地差異，使得隨機(jī)誤差較大，也可能會造成不同樣品間濃度、酶活性等存在顯著差異；此外通過電泳將同工酶的不同亞基進(jìn)行分開，膠塊質(zhì)量也會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3油松親子代遺傳標(biāo)記分析（葉綠體SSR實(shí)驗(yàn)）【實(shí)驗(yàn)原理】1.油松基本知識：?葉綠體基因組為單倍型；油松葉綠體來自父本。?比較種子胚葉綠體與潛在父本葉綠體基因組，可進(jìn)行父源(花粉供體)分析。（另從胚乳可獲得母源基因）–胚葉綠體單倍型與采集種子的樹的葉綠體單倍型：一致：可能為自交；不一致：可能為異交。?這種判斷誤差的大小與基因取樣位點(diǎn)的多寡相關(guān)2微衛(wèi)星DNA又稱短串聯(lián)重復(fù)，或簡單重復(fù)序列SSR?；蜷L度為1~6nt，重復(fù)次數(shù)n=10~60；多位于基因組非編碼區(qū)，可認(rèn)為是中性標(biāo)記；其變異豐富，稱共顯性特征。這些小的串聯(lián)排列的重復(fù)序列經(jīng)常是通過核苷酸鏈的滑動錯(cuò)配或者其它未知的過程來改變它們的長度，從而導(dǎo)致微衛(wèi)星在數(shù)量上的差異。微衛(wèi)星的突變率高：每代每個(gè)配子的每個(gè)位點(diǎn)有25×10-5～1×10-2突變，因此造成了它們的多態(tài)性。微衛(wèi)星寡聚核苷酸的重復(fù)次數(shù)在同一物種的不同基因型間差異很大。微衛(wèi)星通常是復(fù)等位的，代表每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)目高度可變。3親本分析親本分析，是根據(jù)遺傳定律和親子代的形態(tài)、生理、遺傳特征，判斷親本來源和特征的分析方法。根據(jù)松科植物的重要特點(diǎn)：（1）物種形成歷程中經(jīng)歷了廣泛的雜交與漸滲(兩物種的雜交后代與親本反復(fù)回交，把某一親本的性狀帶至另一親本，可使一個(gè)物種的基因插入到另一物種)。（2）兩種質(zhì)體基因遺傳方式不同：線粒體基因?yàn)槟赶颠z傳（通過種子傳播，基因流有限）；葉綠體基因?yàn)楦赶颠z傳（通過花粉和種子傳播，基因流廣泛）。本次實(shí)驗(yàn)的測序?qū)煞N不同引物的產(chǎn)物同時(shí)測定，基于如下原則（1~2個(gè)）：兩種引物的大小盡量有較大差異，所以將pt4(150bp，黃)與pt9(88bp，黃)組合（均為黃色但大小不同）；兩種引物的標(biāo)記熒光顏色不同，所以將pt2(150bp，黃)與pt6(160bp，藍(lán))組合（大小相近但顏色不同）。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.比較種子胚葉綠體與潛在父本葉綠體基因組，進(jìn)行父源分析2.熟識實(shí)驗(yàn)操作技能【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】3油松親子代遺傳標(biāo)記分析（葉綠體SSR）課前準(zhǔn)備滅菌（具有石英砂和磁珠的Fastprep管，1.5ml指管，藍(lán)槍頭、黃槍頭、白槍頭），120℃，20min；確保DNA提取試劑盒中的PW和GDDNA提?。?）每組領(lǐng)取種子（1顆），并記錄種子來源；（2）分裝全班所需裂解液GP1（～700μL/管樣品），65℃預(yù)熱；（3）剝?nèi)∮退煞N子胚和胚乳，分別置于Fastprep管中，做標(biāo)記；（4）在Fastprep組織破碎儀中，以5級速度，破碎Fastprep管中樣品（20sec）；（5）在通風(fēng)櫥中，向預(yù)熱的GP1中加入巰基乙醇（終濃度為1%），取700μL含巰基乙醇GP1加入每管已破碎的樣品中（破碎完的樣品需迅速加入GP1，以防止DNA降解）；（6）在65℃水浴鍋中水浴45min，期間每隔5-10min上下顛倒混勻一次；（7）水浴結(jié)束，取出晾2-3min，加入700μL氯仿，上下顛倒混勻。12000rpm，離心5min；（8）小心從離心機(jī)中取出（防止破壞分層），吸取上層水相于一個(gè)新離心管中，加入700μLGP2，上下顛倒混勻；（9）將上一步混勻液體分兩次移入吸附柱CB3中，靜置3min，12000rpm，離心30s，棄掉廢液；（10）加入500μL去蛋白液GD，12000rpm，離心30s，棄掉廢液；（11）加入700μL漂洗液PW，12000rpm，離心30s，棄掉廢液；（12）加入500μL漂洗液PW，12000rpm，離心30s，棄掉廢液；（13）12000rpm，再次離心2min，充分去除漂洗液；（14）將吸附柱至于一個(gè)干凈的離心管中，通風(fēng)櫥中晾10min，使吸附柱中酒精充分揮發(fā)；（15）加65℃預(yù)熱的洗脫緩沖液TE，50μl（務(wù)必懸空加到吸附柱的中央），靜置5min。12000rpm，離心2min；（16）將上一步離心產(chǎn)物吸出，重新加入到吸附柱中，靜置5min，12000rpm離心2min，以提高DNA洗脫效率。（17）保留離心產(chǎn)物，做好標(biāo)記；丟棄吸附柱。2.3.3PCR每組4對引物（pt2,pt4,pt6,pt9,各10μM），2個(gè)DNA樣品。（1）配制反應(yīng)液（20μL/每對引物）：?2μLbuffer（10mMTris·HClpH8.3，50mMKCl）?1.5μLMgCl2（1.5mM）?1.6μLdNTP（4種各0.2mM）?0.48μL前導(dǎo)引物（0.24μM，熒光標(biāo)記）?0.48μL后置引物（0.24μM）?0.16μLTaq酶（0.8U）每對引物取19μL混合液，加1μLDNA模板，混勻。（2）反應(yīng)條件：–95℃預(yù)變性5min?94℃1min?55℃50s?72℃–72℃后延伸8min2.3.4電泳及PCR產(chǎn)物量估算（1）制備電泳緩沖液（5×TAE）500ml：24.2gTris，5.71ml冰乙酸，3.72gEDTA，定容至1000ml）。使用前將5×TAE稀釋成1×TAE用作工作液。（2）配制1%瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖0.5g，加入50ml1×TAE電泳緩沖液，用光譜爐加熱煮沸至瓊脂糖全部融化,即成凝膠液；待凝膠液溫度降至60℃時(shí)，加入2.5μLGoldview，混勻后灌制凝膠板。根據(jù)電泳膠板大小決定配制/灌膠量，一般常溫凝固30min內(nèi)即成凝膠。（3）1%瓊脂糖電泳：每樣孔2μL6×LoadingBuffer+5μLPCR產(chǎn)物+5μLH2O；2μLMarker（DL2000）（點(diǎn)于左側(cè)第一孔）；恒壓120V，時(shí)間20min。2.3.5PCR（1）變性液：–0.5μLPCR產(chǎn)物pt2TAMARA（約5-10ng）+0.5μLPCR產(chǎn)物pt6FAM（約5-10ng）+0.3μLRox+7.7μL甲酰胺；–0.5μLPCR產(chǎn)物pt4TAMARA（約5-10ng）+0.5μLPCR產(chǎn)物pt9TAMARA（約5-10ng）+0.3μLRox+7.7μL甲酰胺；（2）變性程序：94℃,4min；取出置-20℃,3min。（3）測序（用3100測序儀測序）（4）數(shù)據(jù)讀取(Genemapper軟件）【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】3.3油松親子代遺傳標(biāo)記分析（葉綠體SSR）100bP250bP100bP250bP圖三：PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳分析：1）.由于我們的梳子空太大了，點(diǎn)樣的時(shí)候有部分點(diǎn)到了其他組的凝膠里面，因此造成了13,14,15,16四個(gè)孔的產(chǎn)物跑的不對稱有點(diǎn)奇怪。2）.最左邊為MarkerDL2000，從左往右上樣順序依次為胚（引物）pt2、pt4、pt6、pt9和胚乳（引物）pt2、pt4、pt6、pt9。凝膠下邊為上樣處。3）.胚的葉綠體基因以pt2和pt6為引物與胚乳葉綠體基因以pt2為引物進(jìn)行PCR，聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶較弱。表三本組種子的胚及胚乳的單倍型Pt6pt2Pt6pt2結(jié)果分析對胚和胚乳引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析，可得本組胚和胚乳葉綠體的4種SSR的序列長度：胚：pt2pt4pt6pt9基因長度分別為：15216689胚乳：pt2pt4pt6pt9基因長度分別為本組種子胚乳的單倍體為149-153-166-88由于胚pt2在PCR過程中就出現(xiàn)了問題，PCR不是很好，因此未能得到結(jié)果。全班胚和胚乳引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析匯總標(biāo)號Pt2Pt4pt6Pt9單倍型潛在父本母本雜交型114914916287149-149-162-87218_1421