食品酶學(xué)復(fù)習(xí)資料

食品酶學(xué)第一章

酶學(xué)概論酶學(xué)（Enzymology）：是研究酶的構(gòu)造、性質(zhì)，酶的反映機理和作用機制，酶的生物學(xué)功效及應(yīng)用的一門科學(xué)。三、酶工程介紹酶工程由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新的技術(shù)科學(xué),亦即將酶或者細(xì)胞、細(xì)胞器等在一定的生物反映裝置中，運用酶所含有的生物催化功效，借助工程手段將對應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)并應(yīng)用于社會的一門科學(xué)。酶工程分為：化學(xué)酶工程與生物酶工程。生物技術(shù)的四大支柱：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程生物酶工程重要研究內(nèi)容（1）用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）（2）用蛋白質(zhì)工程技術(shù)定點變化酶構(gòu)造基因（突變酶）（3）設(shè)計新的酶構(gòu)造基因，生產(chǎn)自然界從未有過的性能穩(wěn)定、活性更高的新酶。第二節(jié)酶作為催化劑的特點酶和普通催化劑的共性：1.用量少而催化效率高2.不變化化學(xué)反映的平衡點，僅變化反映速度，縮短平衡達(dá)成的時間。3.減少反映的活化能,酶本身在反映前后不發(fā)生變化酶作為生物催化劑的特性：催化效率高、專一性強、反映條件溫和、酶的不穩(wěn)定性及可調(diào)節(jié)性酶作用的專一性：酶的專一性是指一種酶只能催化一種或一類構(gòu)造相似的底物進行某種類型的酶反映。根據(jù)酶的專一性程度不同，可分下列三種：絕對專一性：指一種酶只能催化一種物質(zhì)進行反映，這種高度的專一性稱絕對專一性。相對專一性：一種酶能催化一類構(gòu)造相似的物質(zhì)進行某種相似類型的反映，這種專一性稱相對專一性。1）鍵專一性2）基團專一性立體異構(gòu)專一性：一種酶只能催化一種立體異構(gòu)進行某種類型的化學(xué)反映，而對另一種立體異構(gòu)體則無作用，這種專一性稱立體異構(gòu)專一性。酶不穩(wěn)定，易失活：由于酶是蛋白質(zhì)，凡引發(fā)蛋白質(zhì)變性的因素，亦可使酶變性失活。酶的可調(diào)性：由于酶的催化作用可受多個因素的調(diào)節(jié)，從而變化其催化活性，特別是代謝過程中某些核心性酶，往往是重要的調(diào)節(jié)對象。第三節(jié)酶分子構(gòu)造和功效1.酶分子的構(gòu)成①酶蛋白酶的一級構(gòu)造:它是酶的基本構(gòu)造,是由許多氨基酸按特定的次序排列成的肽鏈,氨基酸之間通過肽鍵(-CH=NH-)連接。酶的二級構(gòu)造:肽鍵進一步盤繞成α-螺旋或并列排列成β-折疊，由不同長短的α-螺旋及不同長度的β-折疊構(gòu)成了蛋白質(zhì)的二級構(gòu)造。酶的三級構(gòu)造:蛋白質(zhì)的二級構(gòu)造，再加上某些沒有規(guī)則的肽鏈段落裝配而成，在此基礎(chǔ)上再盤繞成更高級的三級構(gòu)造（稱作一種亞基）。酶的四級構(gòu)造:相似或不同的亞基構(gòu)成更完整更嚴(yán)密的空間構(gòu)象成為四級構(gòu)造。任何破壞穩(wěn)定二級構(gòu)造的氫鍵或穩(wěn)定三級構(gòu)造的二硫鍵、鹽鍵、酯鍵、范德華力、金屬鍵等，均會使空間構(gòu)象受破壞，造成蛋白質(zhì)構(gòu)造松散，溶解度減少，從而失去其生物學(xué)功效，這稱為蛋白質(zhì)變性作用。酶蛋白有三種形式：①單體酶：單體酶是一條或多條肽鏈構(gòu)成的，僅含有一種活性中心的酶。②寡聚酶：由2個或多個相似或不相似的亞基組合而成的酶。單獨的一種亞基普通不含有酶活性。③多酶復(fù)合體系：指多個酶靠非共價鍵互相嵌合催化持續(xù)反映的體系前一種反映產(chǎn)物為后一種反映的底物，反映依次連接，構(gòu)成一種代謝途徑或代謝途徑的一部分。大多數(shù)的輔酶為核苷酸和維生素或它們的衍生物,輔酶或輔基中往往含有B族維生素。在結(jié)合酶中：1.酶催化作用的專一性由酶蛋白部分決定；2.輔基輔酶的作用是在反映中起傳遞基團、原子和電子的作用;3.金屬離子的作用是：有的是穩(wěn)定酶蛋白分子的構(gòu)象所必需，有的是構(gòu)成酶的活性中心；有的是在酶與底物之間起橋梁作用，亦有的是中和陰離子，減少反映中的靜電斥力。酶學(xué)研究認(rèn)為，在酶蛋白分子上，不是全部構(gòu)成多肽的氨基酸都起作用，而只有少數(shù)的氨基酸殘基與酶的催化活性直接有關(guān)。這些特殊的氨基酸殘基，普通比較集中在酶蛋白的一種特定區(qū)域，這個區(qū)域稱為酶的活力部位或活性中心（activesiteoractivecenter)。酶的活力部位或活性中心由底物結(jié)合部位和催化部位兩個部分構(gòu)成。酶分子不僅有催化功效，同時也含有調(diào)節(jié)功效。因此酶的構(gòu)造中不僅存在著酶的活力部位，并且存在調(diào)節(jié)部位，這個調(diào)節(jié)部位稱酶的別構(gòu)部位（allostericsite)。酶的別構(gòu)部位結(jié)合別構(gòu)配體，這種配體稱為效應(yīng)劑。增進酶的催化能力為正效應(yīng)劑，減少酶的催化能力為負(fù)效應(yīng)劑。酶原與酶原的激活生物體內(nèi)合成的蛋白質(zhì)，有時不含有生物活性，通過蛋白水解酶專一作用后，構(gòu)象發(fā)生變化，形成酶的活性部位，變?yōu)榛钚缘鞍住２缓猩锘钚缘牡鞍踪|(zhì)稱為前體(precursor)。如果這個前體能變?yōu)槊?活性蛋白質(zhì))，這個前體稱為酶原(proenzyme)。酶的多形性與同工酶諸多酶可能催化相似的反映,但其構(gòu)造和物理性質(zhì)有所不同,這種現(xiàn)象稱為酶的多形性。同工酶：指能催化相似的化學(xué)反映，但由于構(gòu)造基因不同，或基因相似,但基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA或者其翻譯產(chǎn)物是通過不同的加工過程產(chǎn)生的酶的一級構(gòu)造、物理性質(zhì)以及其它性質(zhì)有所差別的一組酶。同工酶有下列特點：存在于同一種屬或同一種體的不同組織或同一組織的不同細(xì)胞中。

b.一級構(gòu)造不同，理化性質(zhì)涉及帶電性質(zhì)不同，免疫學(xué)性質(zhì)不同，但空間構(gòu)造中的活性中心相似或相似。

c.往往是四級構(gòu)造的酶類。

d.已發(fā)現(xiàn)一百多個酶含有同工酶性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)最早研究最多的是乳酸脫氫酶，它有五種同工酶。第四節(jié)酶的命名與分類三、酶的數(shù)字編號系統(tǒng)根據(jù)現(xiàn)在已知的3600多個酶催化反映的類型，將酶分為六大類：（1）

氧化還原酶類（oxidoreductases）（2）

轉(zhuǎn)移酶類（transferases）（3）

水解酶類(hydrolases)（4）

裂合酶類(lyases)（5）

異構(gòu)酶類(isomerases)（6）

合成酶類(ligases)同工酶的命名國際生化協(xié)會同工酶分委員會建議同工酶根據(jù)他們在電泳中分離的位置擬定,從電泳中向著陽極移動最遠(yuǎn)的酶開始依次編號。第二章酶促反映的動力學(xué)酶促反映動力學(xué)也稱酶催化反映動力學(xué)(kineticsofenzyme-catalyzedreactions),是研究酶促反映速度以及影響此反映速度的多個因素的科學(xué)。一、酶活力的測定檢測酶含量及存在甚微，很難直接用酶的“量”（質(zhì)量、體積、濃度）來表達(dá)，而慣用酶催化某一特定反映的能力來表達(dá)酶量，即用酶活力的大小來表達(dá)。1、酶活力酶活力(Enzymeactivity)：是指酶催化某一化學(xué)反映的能力，其大小能夠用在一定條件下該酶所催化的某一化學(xué)反映的反映速度(reactionvelocity)來表達(dá)。它表達(dá)樣品中酶的含量。酶活力普通以在最適條件下酶所催化的化學(xué)反映的速度來擬定。酶催化的反映速度可用單位時間內(nèi)底物的減少量產(chǎn)物的增加量來表達(dá)。研究酶反映速度以酶促反映的初速度(initialspeed)為準(zhǔn)引發(fā)酶反映速度減少的因素：底物濃度的減少；酶的部分失活；產(chǎn)物對酶的克制；產(chǎn)物增加引發(fā)的逆反映速度的增加2．酶的活力單位酶活力單位即酶單位（U）是衡量酶活力的大小即酶含量的多少的指標(biāo)。酶單位的定義是：在一定條件下，一定時間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量。（U/g或U/mL）1961年國際酶學(xué)會提出采用統(tǒng)一“國際單位”（IU）來表達(dá)酶活力，規(guī)定為：在最適反映條件下（溫度25℃），1min內(nèi)催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量定為該酶的一種活力單位。即1IU=1μmol/min。1972年國際酶學(xué)委員會又推薦一種新的酶活力國際單位，即Katal（簡稱Kat）單位。規(guī)定：在最適反映條件下，每秒鐘能催化1摩爾（mol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，定為1Katal單位。Kat單位和IU單位之間的換算關(guān)系以下：1Kat=60×106IU1IU=16.67×10-9Kat酶的總活力：樣品的全部酶活力?？偦盍?酶活力×總體積（ml）或=酶活力×總質(zhì)量（g）比活力（Specificactivity）:指每毫克蛋白質(zhì)所含酶活力的單位數(shù)（單位/毫克蛋白）。比活力是酶純度指標(biāo)，比活力愈高表達(dá)酶愈純?；厥章剩óa(chǎn)率,Yield）：回收率是指提純后與提純前酶的總活力之比。它表達(dá)提純過程中酶的損失程度，回收率愈高，其損失愈少。提純倍數(shù)：是指提純后與提純前比活力之比。提純倍數(shù)愈大，提純效果愈佳。在酶的分離純化中每一步始終貫穿比活力和總活力的測定、比較，才干擬定酶的分離純化程度3、酶活力測定辦法終止反映法:酶反映進行到一定時間后終止其反映，再用化學(xué)或物理辦法測定產(chǎn)物或反映物量的變化。持續(xù)反映法:不必終止反映，而是在酶反映過程中用光化學(xué)儀器或電化學(xué)儀器等來監(jiān)測持續(xù)測定反映過程中產(chǎn)物/底物的變化量，對測定的成果進行分析，然后計算出酶活力。測定產(chǎn)物增加或底物減少的辦法１、分光光度法原理：運用產(chǎn)物和底物在紫外光或可見光部分光吸取的不同，選擇某一適宜的波長，測定反映過程中反映進行的狀況。2、熒光法原理：根據(jù)酶促反映的產(chǎn)物或底物的熒光性質(zhì)的差別來進行酶活力的測定。3、同位素法原理：放射形同位素的產(chǎn)物或底物在經(jīng)酶作用后所得的產(chǎn)物，通過適宜的辦法進行分離，從而只需要測定產(chǎn)物的脈沖數(shù)即可換算出酶的活力單位。普通用于標(biāo)記底物的同位素重要涉及3H、14C、32P、35S、131I等。4、電化學(xué)辦法pH測定法，其原理：慣用玻璃電極配合一臺高敏捷度的pH計，跟蹤監(jiān)測反映過程中H+濃度變化的狀況，從而用pH值的變化來測定整個酶促反映的速度，達(dá)成測定有關(guān)酶活力的目的。離子選擇電極測定法如氧電極測定某些耗氧的酶（葡萄糖氧化酶）。二、底物濃度對酶反映速度的影響酶反映速度與底物濃度的關(guān)系曲線米氏常數(shù)的意義當(dāng)V=Vmax/2時，Km=[S]（Km的單位為濃度單位）Km是酶在一定條件下的特性物理常數(shù)，通過測定Km的數(shù)值，可鑒別酶。Km可近似表達(dá)酶和底物親合力，Km愈小，E對S的親合力愈大，Km愈大，E對S的親合力愈小。（最小的底物稱為酶的最適底物或天然底物）。在已知Km的狀況下，應(yīng)用米氏方程可計算任意[s]時的v，或任何v下的[s]。（用Km的倍數(shù)表達(dá)）三、pH值對酶促反映速度的影響過酸過堿造成酶蛋白變性影響底物分子解離狀態(tài)影響酶分子解離狀態(tài)影響酶的活性中心構(gòu)象四、溫度對酶促反映速度的影響在達(dá)成最適溫度以前，反映速度隨溫度升高而加緊酶是蛋白質(zhì)，其變性速度亦隨溫度上升而加緊酶的最適溫度不是一種固定不變的常數(shù)五、激活劑對酶促反映速度的影響但凡能提高酶活性的物質(zhì)，稱為酶的激活劑（activator）。金屬離子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+無機陰離子：Cl-、Br-、I-、CN-、PO43-有機分子:還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、還原型谷胱甘肽金屬螯合劑：EDTA六、克制劑對酶促反映速度的影響但凡使酶的必需基因的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化,但酶并未發(fā)生變性而引發(fā)酶活力減少或喪失的作用則稱為克制作用(inhibition)。造成酶發(fā)生克制作用的物質(zhì)稱為酶的克制劑（inhibitor）。類型:可逆的克制作用不可逆的克制作用應(yīng)用:研制殺蟲劑、藥品研究酶的作用機理，擬定代謝途徑克制作用類型和特點不可逆的克制作用分為：非專一性不可逆克制作用和專一性不可逆克制作用?？赡娴目酥谱饔梅譃椋焊偁幮钥酥谱饔?、非競爭性克制作用和反競爭性克制劑作用。不可逆克制作用(irreversibleinhibition)：指克制劑與酶蛋白中的必需基團以共價形式結(jié)合，引發(fā)酶活力減少或喪失,不能用透析或超濾等物理辦法除去克制劑而使酶復(fù)活,這種克制作用是不可逆的,稱之為不可逆克制作用。例如：二異丙基氟磷酸與胰凝乳蛋白酶和乙酰膽堿酯酶的活性中心絲氨酸結(jié)合克制酶活性。非專一性不可逆克制作用：這類克制劑作用于酶分子上不同的基團或作用于幾類不同的酶。專一性不可逆克制作用：這類克制劑只作用于與酶活性部位有關(guān)的氨基酸殘基或一類酶。實例：有機磷殺蟲劑。可逆克制作用(reversibleinhibition)：克制劑與酶蛋白以非共價方式結(jié)合而引發(fā)酶活力減少或喪失，但能夠通過透析、超濾等物理辦法除去克制劑而使酶復(fù)活，這種克制作用是可逆的，稱之為可逆克制作用。競爭性克制作用(competitiveinhibition)的特點:Km增大當(dāng)[S]→∞時,則Vmax不變竟?fàn)幮钥酥谱饔媚軌蛲ㄟ^增大底物濃度,即提高底物的競爭能力來消除克制劑和底物競爭酶的同一種結(jié)合位點（酶的活性中心），克制劑構(gòu)造和底物構(gòu)造類似非競爭性克制作用(noncompetitiveinhibition)特點Km不變Vmax變小非競爭性克制劑與酶活性中心以外的基團結(jié)合。這類克制作用不會因提高底物濃度而削弱反競爭性克制作用(uncompetitiveinhibition)的特點：Km變小Vmax變小可逆克制的動力學(xué)比較克制類型VmaxKm無克制劑VmaxKm競爭性克制作用不變變大非競爭性克制作用變小不變反競爭性克制作用變小變小某些重要的克制劑不可逆克制劑有機磷化合物—與酶活性直接有關(guān)的絲氨酸上的-OH牢固地結(jié)合，從而克制某些蛋白酶或酯酶。（DFP、敵百蟲、敵敵畏、農(nóng)藥1605等）有機汞、有機砷化合物—與酶蛋白上的-SH作用，從而克制含-SH酶的活性。（對氯汞苯甲酸）氰化物—與含鐵卟啉的酶中的Fe3+結(jié)合，使酶失活.重金屬—能使大多數(shù)酶失活，加入EDTA能夠除去.烷化劑—使酶蛋白中的–SH、-NH2、-OH等發(fā)生烷基化,失活。青霉素—與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性部位Ser-OH共價結(jié)合，使酶失活?？赡婵酥苿┰诳赡婵酥苿┲凶钪匾氖歉偁幮钥酥苿?。如：磺胺藥、氨基葉酸等互動專項題目及分組◆酶在焙烤食品、制糖工業(yè)中的應(yīng)用（10117001-13）◆酶在糊精、麥芽糊精、環(huán)糊精及油脂生產(chǎn)中的應(yīng)用（10117014-26）◆酶在果蔬加工中的應(yīng)用(10117027-39)◆酶在肉制品加工的應(yīng)用(10117040-52)◆酶在乳制品中的應(yīng)用(10117053-64,10108008,39,42)◆酶在貯藏保鮮中的應(yīng)用(10118001-13)◆酶在發(fā)酵方面的而應(yīng)用（10118014-26)◆酶在食品分析中的應(yīng)用(10118027-39)◆酶與食品衛(wèi)生及安全的關(guān)系(10118040-52)◆酶在功效食品中的應(yīng)用((10118053-65,10128023)第三章酶的生產(chǎn)、分離和純化酶來自生物體，涉及動物、植物和微生物。酶的生產(chǎn)：通過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作控制而獲得所需要酶的過程。酶生產(chǎn)的辦法：1、提取2、化學(xué)合成3、發(fā)酵法第一節(jié)酶的發(fā)酵生產(chǎn)50年代后期酶生產(chǎn)的重要辦法，指運用動植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞，重要是微生物細(xì)胞的生命活動而獲得人們所需要的酶的過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。1894年，日本人高峰讓吉初次用米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶作為消化劑。19，Boidin與Effront以枯草桿菌生產(chǎn)淀粉酶用于織物退漿。1947年，日本開始采用液體深層發(fā)酵生產(chǎn)a-淀粉酶。運用微生物發(fā)酵辦法制取酶的優(yōu)點是：1）微生物種類繁多，酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣；2）微生物生長繁殖快，發(fā)酵周期短，易提取酶，特別是胞外酶；3）微生物培養(yǎng)簡樸，培養(yǎng)基來源廣泛，價格便宜。4）可采用微電腦等技術(shù)控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可持續(xù)化、自動化，經(jīng)濟效益高。5）可運用以基因工程為主的當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育新菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。1、產(chǎn)酶菌的獲得1）生產(chǎn)菌的規(guī)定安全可靠，不是致病菌，在系統(tǒng)發(fā)生上與病原體無關(guān)，也不產(chǎn)生毒素。FDA(FoodandDrugAdministration)鑒定、審核后認(rèn)為可用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的生產(chǎn)菌有：枯草桿菌（Bac.subtilis）、黑曲霉（Asp.niger）、米曲霉（Asp.oryzae）、啤酒酵母（Sac.cereusia）、脆壁酵母（Sac.fragieis）。不易變異退化、不易感染噬菌體，產(chǎn)酶穩(wěn)定性好。產(chǎn)酶量高，酶的性質(zhì)符合應(yīng)用需要，最佳是產(chǎn)胞外酶的菌株。能運用便宜原料，發(fā)酵周期短，容易培養(yǎng)。產(chǎn)酶菌可從菌種保存機構(gòu)如ATCC（AmericanTypeCultureCollection）和有關(guān)研究機構(gòu)獲得；普通都是通過篩選（screening）得到。篩選涉及下列環(huán)節(jié)：菌樣采集，菌種分離、純化和生產(chǎn)性能鑒定。2）常見的產(chǎn)酶微生物細(xì)菌：枯草桿菌淀粉酶制糖、脫漿大腸桿菌青霉素?；钢苽淝嗝顾啬负水愋腿樗釛U菌葡萄糖異構(gòu)酶制果糖短小芽孢桿菌堿性蛋白酶皮革脫毛酵母：假絲酵母脂肪酶、尿酸酶等乳品增香、絹絲脫脂等啤酒酵母用于釀造啤酒、飲料酒和酒精等霉菌：黑曲霉酸性蛋白酶啤酒澄清、醫(yī)藥紅曲霉葡萄糖淀粉酶制葡萄糖米曲霉糖化酶和蛋白酶制果糖青霉葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酶、果膠酶等木霉纖維素酶根霉淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等毛霉蛋白酶、糖化酶、果膠酶、凝乳酶等3）菌樣采集相近菌種產(chǎn)生的酶在性質(zhì)上普通相近或相似。胞外酶的穩(wěn)定性和最適反映條件普通和菌的最適生長條件一致；但胞內(nèi)酶的熱穩(wěn)定性普通比菌的最適生長溫度稍低。為獲得能夠降解某種物質(zhì)的產(chǎn)酶菌株，普通可從該物質(zhì)比較豐富的地方尋找。4）菌種分離、純化和生產(chǎn)性能的鑒定產(chǎn)酶菌可采用平板劃線法或直接稀釋法分離純化。初篩多采用平板透明圈法。如篩選水解酶的生產(chǎn)菌，能夠該酶的底物作為平板培養(yǎng)基的重要碳源或氮源，這樣如果菌株包含所需要的酶，通過一段時間的培養(yǎng)后，就會在菌落的周邊形成一透明的水解圈（clearingorlysiszone），從透明圈的大小可大致判斷出菌株的產(chǎn)酶能力。5）產(chǎn)酶菌的篩選：重要依靠其催化的反映的性質(zhì)、底物和產(chǎn)物的特異性等進行設(shè)計。胞外酶篩選：使待檢測的微生物在含有酶作用的不溶性底物如淀粉、纖維素、酪素、細(xì)胞壁等作為培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)后，根據(jù)菌落周邊產(chǎn)生的透明圈的大小能夠曬選到產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶和溶菌酶的高活性菌株。(平板透明圈法)根據(jù)催化反映的產(chǎn)物的酸堿性，在培養(yǎng)基中加入底物和酸堿批示劑，培養(yǎng)后，根據(jù)產(chǎn)生酸或堿，根據(jù)菌落周邊變色圈的大小和顏色深淺進行判斷，從而進行產(chǎn)目的酶菌株的曬選。設(shè)計特定的底物，使其在酶的作用下產(chǎn)生產(chǎn)物，產(chǎn)物遇底物有顏色的變化，菌落周邊產(chǎn)生色圈，則可篩選到產(chǎn)酶的菌株。胞內(nèi)酶篩選：對于酶作用的底物分子質(zhì)量較小，能透過細(xì)胞膜在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生反映，能夠?qū)⑵浼釉谂囵B(yǎng)基中，根據(jù)菌落的顏色進行篩選。對于大多數(shù)的胞內(nèi)酶，是采用培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞破碎物作酶源，經(jīng)酶反映后，根據(jù)酶反映產(chǎn)物的特點，運用產(chǎn)物對紫外的吸取，如輔酶NAD，直接用紫外分光光度法測定；或通過產(chǎn)物的顯色反映等。2.產(chǎn)酶菌的保存和培養(yǎng)1）菌種的保存避免污染，盡量減少轉(zhuǎn)移次數(shù)；避免對種子培養(yǎng)基進行長時間高熱滅菌，以防對種子產(chǎn)生不良影響。菌種保存的基本原理：通過采用低溫、干燥與缺氧的條件，以中斷菌種的繁殖，減少其新陳代謝，使之處在休眠狀態(tài)。菌種保存的辦法諸多，慣用的為斜面低溫保存法，液體石蠟保存法等。有條件的還可采用冷凍真空干燥保存法。2）菌種的活化和擴大培養(yǎng)將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐級擴大培養(yǎng)以恢復(fù)菌種的活力，這就叫菌種活化。為了發(fā)酵時有足夠的菌種，活化了的菌種普通要通過一級至數(shù)級的擴大培養(yǎng)。3）培養(yǎng)辦法固體培養(yǎng)。又稱表面培養(yǎng)（surfaceculture）、曲式培養(yǎng)，即以麩皮、米糠等為基本原料，再加入適量的無機鹽和水分（普通50%左右）作為培養(yǎng)基進行的一種培養(yǎng)方式。設(shè)備簡樸，便于推廣，特別適于霉菌類的培養(yǎng)，由于菌絲體在這種培養(yǎng)基中能較好地伸展、生長，產(chǎn)酶率高。如曲霉和毛霉生產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶，青霉和曲霉生產(chǎn)果膠酶，木霉生產(chǎn)纖維素酶；缺點是：物料運用不完全，勞動量大，易染菌，并且不適于胞內(nèi)酶的生產(chǎn)液體培養(yǎng)。又稱浸沒式培養(yǎng)（submergedculture），采用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐內(nèi)進行的一種攪拌通氣式培養(yǎng)，是現(xiàn)在酶制劑和其它發(fā)酵產(chǎn)品的重要培養(yǎng)方式。液體發(fā)酵需要一定的設(shè)備和技術(shù)條件，動力消耗也較大，但原料運用率和產(chǎn)量都較高，并且培養(yǎng)條件容易控制。3）培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的構(gòu)成：碳源。不適宜使用葡萄糖等易被運用的碳源為培養(yǎng)基，也不適宜提供太豐富的碳源營養(yǎng)。某些碳源是酶的誘導(dǎo)物，定向地增進某些酶地合成，如淀粉可誘導(dǎo)淀粉酶的合成。氮源。氮源是菌體蛋白質(zhì)和核酸的原料。多個微生物對氮源的運用狀況相稱復(fù)雜，有的喜歡無機氮，有的喜歡有機氮，氮源的性質(zhì)，使用的濃度都能對菌的生長和酶的形成帶來不同程度的影響。碳氮比。在某些狀況下，對菌的生長和產(chǎn)酶也有直接關(guān)系。無機鹽。這些離子直接參加細(xì)胞物質(zhì)的構(gòu)成，或者作為酶的活性構(gòu)成部分與活化劑發(fā)揮作用。生長因子。某些微量有機物質(zhì)，重要是B族維生素。它們對微生物的代謝起調(diào)節(jié)作用，有時作為輔酶的構(gòu)成部分，影響酶的活性。在玉米漿、酵母膏和麥芽浸液等天然物質(zhì)中普通含有這些生長因子，不需要另外添加。產(chǎn)酶增進劑。指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì),能明顯提高酶的產(chǎn)率,這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶增進劑。普通有兩種:一種是誘導(dǎo)物，能夠是底物、產(chǎn)物或底物類似物。如纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶。另一種是表面活性劑，如吐溫-80的濃度為0.1%時能增加許多酶的產(chǎn)量,增加細(xì)胞的通透性，改善氧的傳遞速度,還可保護酶的活性影響菌種產(chǎn)酶的因素：◆培養(yǎng)溫度。產(chǎn)酶菌生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。培養(yǎng)溫度也可能直接影響酶合成后的穩(wěn)定性，特別是酶的耐熱性。如：55℃下培養(yǎng)形成的α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性比35℃培養(yǎng)的高許多?！魀H。培養(yǎng)基的酸堿度對產(chǎn)酶影響很大。相稱多的水解酶，產(chǎn)酶的最適pH與酶作用的最適pH相近；有些水解酶和氧化酶則相距甚遠(yuǎn)。諸多微生物能同時產(chǎn)生幾個有關(guān)的酶，變化培養(yǎng)基的pH，可能影響到多個酶的合成比例。通氣量。大多數(shù)產(chǎn)酶菌是好氣菌，因此調(diào)節(jié)通氣量對提高酶產(chǎn)量往往有直接意義。采用液體深層發(fā)酵時，較小的通氣量有助于霉菌的孢子萌發(fā)和菌體生長。而較大的通氣量則常可增進酶的形成。固體發(fā)酵時，菌體生長普通規(guī)定通以空氣，而較小的通氣量卻能明顯提高酶的產(chǎn)量。濕度。對于固體發(fā)酵比較重要，它直接影響產(chǎn)酶率，也與產(chǎn)酶達(dá)成高峰的時間有關(guān)。第二節(jié)提高酶發(fā)酵產(chǎn)量的辦法1、酶的合成調(diào)控機制酶和其它蛋白質(zhì)同樣，它的合成可在復(fù)制（replication）、轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）等多個水平上進行調(diào)節(jié)控制。原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制現(xiàn)在普遍接受的是操縱子模型。這是通過調(diào)節(jié)酶的合成來調(diào)控。另外可通過克制酶的活性來調(diào)控。細(xì)胞所生產(chǎn)的物質(zhì)的合成有兩個負(fù)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，即通過克制酶的活性和阻遏酶的合成來調(diào)節(jié)。1）誘導(dǎo)酶合成的調(diào)節(jié)(添加誘導(dǎo)物提高酶產(chǎn)量)合用于可誘導(dǎo)的酶類，食品工業(yè)應(yīng)用的酶如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、乳糖酶等均屬于誘導(dǎo)酶。在酶合成時最佳的誘導(dǎo)物為該酶的作用底物或其構(gòu)造類似物。加入誘導(dǎo)物后，普通要通過一種極短暫的潛伏期(例如幾分鐘)，誘導(dǎo)才會出現(xiàn)，除去誘導(dǎo)物后，誘導(dǎo)立刻停止。2）酶合成的反饋阻遏(通過減少阻遏物濃度提高酶產(chǎn)量)反饋阻遏是指酶作用的終產(chǎn)物對酶合成產(chǎn)生的阻遏作用，引發(fā)反饋阻遏的終產(chǎn)物往往是小分子物質(zhì)，也稱為共阻遏物。調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生立體阻遏物，當(dāng)終產(chǎn)物或共阻遏物存在時，兩者互相結(jié)合并與操縱基因結(jié)合，RNA聚合酶不起作用，使操縱基因關(guān)閉，酶合成受到反饋克制。若解除阻遏物即無終產(chǎn)物,RNA聚合酶起作用，使操縱基因啟動，酶合成繼續(xù).3）分解代謝對酶合成的阻遏作用分解代謝阻遏作用（或稱為葡萄糖效應(yīng)）是指培養(yǎng)基中由于葡糖糖的存在微生物即使能快速生長，但明顯抑某些分解代謝誘導(dǎo)酶的形成。葡萄糖的存在影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸（cAMP）的產(chǎn)生，cAMP是啟動RNA聚合酶作用中不可缺少的輔助因子，cAMP的缺少造成對分解代謝的酶形成阻遏作用。4）酶合成的細(xì)胞膜透性調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)胞外酶的分泌主動運輸?shù)恼{(diào)節(jié)（透性酶或表面酶）間隔作用調(diào)節(jié)（酶的催化速率受到亞細(xì)胞器構(gòu)造的影響）2、通過發(fā)酵條件的控制提高酶產(chǎn)量菌種產(chǎn)酶性能是決定發(fā)酵效果的重要條件。為了提高酶產(chǎn)量，需對發(fā)酵過程的參數(shù)進行優(yōu)化。(1)通過控制pH來提高酶產(chǎn)量(2)通過控制溫度來提高酶產(chǎn)量(3)通過中間補料提高酶產(chǎn)量(4)通過溶解氧來提高酶產(chǎn)量溶氧速率的調(diào)節(jié)辦法：◆調(diào)節(jié)通氣量◆調(diào)節(jié)氧分壓◆調(diào)節(jié)氣液接觸時間和面積3、通過基因突變提高酶產(chǎn)量基因突變（genemutation）可發(fā)生在構(gòu)造基因上，也可發(fā)生在操縱子其它部位上。前者往往造成酶的構(gòu)造和性質(zhì)變化，而后者則普通引發(fā)酶產(chǎn)量升高或減少?；蛲蛔兛勺园l(fā)地發(fā)生，即自然育種，但機率很小，故在實際工作中需采用某些辦法進行誘變，即誘變育種：物理辦法：紫外線、γ-射線（Co-60）及快中子輻射等。直接引發(fā)核酸分子中四種脫氧核苷酸，特別是C、T發(fā)生變化，造成DNA損傷和畸變?；瘜W(xué)辦法：5-溴尿嘧啶等，通過代謝滲入到DNA中引發(fā)突變；亞硝胍等，直接和DNA中地A、C、G等反映而造成異變；口丫啶黃染料等，能引發(fā)DNA鏈中核苷酸的插入或缺失而造成移碼突變。生物誘變劑：噬菌體用來進行誘變的出發(fā)菌株選擇時應(yīng)注意下列幾點：（1）有一定的目的產(chǎn)物的生產(chǎn)能力（2）對誘變劑敏感的菌株變異幅度大（3）生產(chǎn)性能好的菌株（4）可選擇已經(jīng)誘變后的菌株篩選的目的（1）高產(chǎn)菌株的篩選（2）抗分解代謝阻遏突變株的篩選（3）無孢子突變株的篩選（4）藥品抗性突變株的篩選4、通過基因重組提高酶產(chǎn)量體內(nèi)基因重組（generecombination），涉及通過接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等辦法進行的少數(shù)或者個別基因的重組；也涉及通過原生質(zhì)融合進行的整個染色體的重組。如：質(zhì)粒（plasmid）整合、噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)（phagetransduction）、轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)融合（protoplastfusion）。體外基因重組（generecombinationinvitro），簡稱DNA重組技術(shù)（recombinatantDNAtechnique），或基因工程（geneengineering）。它是運用酶學(xué)辦法將外源基因與載體DNA在體外進行重組，然后將形成的重組子轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞，使所需要的外源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制體現(xiàn)，從而達(dá)成改造生物遺傳特性目的的一種技術(shù)與辦法。5、其它提高酶產(chǎn)量的辦法（變化碳氮比，添加產(chǎn)酶增進劑等）添加表面活性劑。表面活性劑，特別對胞外酶來說，可能由于能增大細(xì)胞膜的通透性，從而提高酶產(chǎn)量。慣用的表面活性劑有:Tween80、TritonX-100(聚氧乙烯異辛基苯基醚)、油酸等?；蚴敲傅恼T導(dǎo)物。食品慣用酶發(fā)酵生產(chǎn)舉例：α-淀粉酶的生產(chǎn)枯草桿菌糖化酶的生產(chǎn)黑曲霉蛋白酶的生產(chǎn)脂肪酶的生產(chǎn)假絲酵母果膠酶的生產(chǎn)臭曲霉固態(tài)法第三節(jié)酶的分離純化辦法酶分離純化的基本原則：1）避免酶失活（denaturation-deactivation），操作必須在低溫下進行，避免過酸過堿，重金屬能使酶失效，有機溶劑能使酶變性，微生物污染以及蛋白質(zhì)水解酶的存在能使酶分解破壞；2）選擇有效的純化辦法；3）酶活力測定貫穿純化過程的始終1.酶的抽提1)預(yù)解決與細(xì)胞破碎提取酶前，普通對原材料進行適宜的預(yù)解決（pretreatmention）。例如：動物材料要先剔除結(jié)締組織、脂肪組織；油質(zhì)種子最佳先用乙醚等脫脂；種子研磨前應(yīng)去殼；微生物材料應(yīng)將菌體和發(fā)酵介質(zhì)分離；部分酚類物質(zhì)含量高的材料如茶鮮葉在細(xì)胞破碎的同時應(yīng)避免多酚吸附蛋白質(zhì)。動植物材料先要進行細(xì)胞破碎（celldisruption），普通采用勻漿器（homogenizer）或加砂研磨。許多材料研磨后可先制成丙酮粉（acetonepowder）。材料粉碎后，低溫下加入5~10倍預(yù)冷的丙酮，攪拌均勻后過濾，低溫干燥。丙酮解決首先能有效地破壞細(xì)胞壁（膜），有助于除去大量脂質(zhì)，使某些與膜結(jié)合的酶易于溶解，另外丙酮粉含水量低，便于保存。但有些酶不能采用此法。細(xì)胞破碎的辦法：(1)機械(勻漿)法(2)超聲波法(3)凍融法(4)滲入壓法(5)酶消化法(6)化學(xué)破碎法（有機溶劑解決和表面活性劑解決riton、Tween）2)抽提辦法大多數(shù)酶屬于球蛋白類，普通都溶于稀鹽、稀酸或稀堿的水溶液。抽提液的選擇要考慮酶的溶解性、穩(wěn)定性以及如何最有助于切斷酶和其它物質(zhì)的聯(lián)系。選擇的pH不能超出酶的穩(wěn)定范疇，遠(yuǎn)離目的酶的等電點。大多數(shù)蛋白質(zhì)在低濃度的鹽溶液中有較大的溶解度，因此普通采用等滲鹽溶液。抽提溫度多控制在0-4℃左右。根據(jù)酶抽提時采用的溶劑或溶液的不同,酶的提取辦法有下列幾個:(1)鹽溶液提取(2)酸溶液提取(3)堿溶液提取(4)有機溶劑提取(1)鹽溶液提取大多數(shù)酶溶于水,并且在一定濃度的鹽存在的條件下,酶的溶解度增加,這稱之為鹽溶現(xiàn)象,但是鹽濃度不能太高,否則溶解度反而減少,出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。普通采用稀鹽溶液進行酶的提取，鹽濃度普通控制在0.02~0.5mol/L的范疇內(nèi)。(2)酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大并且穩(wěn)定性好，這種酶宜用酸溶液提取。(3)堿溶液提取有些酶在堿性條件下溶解度較大且穩(wěn)定性較好，應(yīng)采用堿溶液提取。(4)有機溶劑提取有些與脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中含非極性基團較多的酶,不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機溶劑提取。慣用的有機溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。3)濃縮濃縮（concentration）首先減少純化操作容積，同時酶的穩(wěn)定性也能提高。工業(yè)上可用真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍濃縮和逆向滲入作用進行濃縮。對于少量酶液下述辦法濃縮更適宜：超出濾濃縮（ultrafiltration）；凝膠濃縮；聚乙二醇濃縮法。2.酶的純化原理與辦法1）根據(jù)溶解度的不同，有鹽析法、有機溶劑沉淀法、共沉淀法及選擇性沉淀法和等電點沉淀法等。2）根據(jù)分子大小的差別，有凝膠過濾（層析）法、篩膜分離法和離心法等。3）根據(jù)分子的解離性質(zhì)和所帶正負(fù)電荷的種類及量的不同，有吸附（層析）法、離子交換層析法、電泳法以及聚焦層析法。4）基于酶和底物、輔助因子以及克制劑間含有專一親和作用的特點而建立的多個親和分離法等。5）運用穩(wěn)定性差別而建立的的分離辦法有選擇性熱變性法、酸堿變性法和表面變性法等。6）色譜法。7）結(jié)晶。在酶蛋白質(zhì)提純過程中，當(dāng)酶的純度達(dá)成一定濃度就能夠進行酶蛋白質(zhì)的結(jié)晶。現(xiàn)在，對蛋白質(zhì)結(jié)晶的愛好重要在于制備適合于X-射線衍射研究、中子衍射研究的晶體。合用于這種研究的單晶（最小晶體），其線性大小最少在0.2毫米以上。要培養(yǎng)出這樣的單晶，必須尋找適宜的結(jié)晶條件。慣用的分離辦法(1)沉淀法:鹽析法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法、非離子型聚合物沉淀法、聚電解質(zhì)沉淀法和高價離子沉淀法等。(2)凝膠過濾(3)親和層析(4)染料層析(5)疏水層析(6)電泳法(1)沉淀法沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的辦法。但現(xiàn)在仍然廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實驗室中。沉淀法由于成本底、收率高，因而普通作為初步分離的一種手段。根據(jù)所加入的沉淀劑的不同,沉淀法又分為:鹽析法、等電點沉淀法、有機溶劑沉淀法、非離子型聚合物（PEG)沉淀法、聚電解質(zhì)沉淀法和高價離子沉淀法等。(2)凝膠過濾(gelfiltrationchromatography)凝膠過濾又稱凝膠層析、凝膠排阻層析、分子篩層析等，它是根據(jù)溶質(zhì)分子的大小進行分離的辦法。在酶純化中占有重要位置。優(yōu)點：操作方便、物質(zhì)不變性、可重復(fù)使用等。應(yīng)用：脫鹽、生物大分子按分子的大小分級分離以及分子量的測定。凝膠的種類1、葡聚糖凝膠白色粉末,不溶于水和鹽溶液,因含有大量羥基,親水性大,在水中即顯膨脹,它對弱酸和弱堿穩(wěn)定,其商品名是SephadexG-X。G-后的數(shù)字表達(dá)每克干膠吸水量的10倍。2、聚丙烯酰胺凝膠以丙烯酰胺為單體，通過交聯(lián)劑共聚而成的凝膠物質(zhì)，其商品名是Bio-GelP-X，P-后的數(shù)字乘以1000表達(dá)其分離的最大分子量。3、瓊脂糖凝膠瓊脂糖是瓊脂抽去瓊脂膠之后所得半乳糖自動締合而成的網(wǎng)眼構(gòu)造物質(zhì),孔徑大小由膠的濃度決定。有商品Sepharose2B、4B、6B等規(guī)格,SepharoseCL,Bio-GelA。凝膠層析的操作凝膠的選擇裝柱加樣洗脫凝膠的再生和保養(yǎng)(4)染料層析：用染料做親和配基，這些染料構(gòu)造中都含有三嗪環(huán)。(5)疏水層析：將疏水性基團固定到介質(zhì)上，這些基團與蛋白質(zhì)生物大分子上的疏水區(qū)親和。同一疏水基團對不同蛋白質(zhì)的親和力存在差別，從而達(dá)成分離的效果。(6)電泳法:是靠溶質(zhì)在電場中移動速度不同而分離的辦法。在電泳中，常伴有電滲現(xiàn)象。在電場中，液體相對于一種固定固體的相對移動，稱為電滲。3.酶分離、純化的評價酶純化收支表環(huán)節(jié)酶活力蛋白濃度總體積總活力總蛋白比活力產(chǎn)量純化倍數(shù)（U/ml）(mg/ml)(ml)(U)(mg)(U/mg)(%)普通用電泳法檢測酶的純度，最后的純度原則，固然是唯一的氨基酸次序，但極少用它來鑒定純度。SOD酶純化過程新鮮動物血分離紅血球生理鹽水洗滌破裂紅細(xì)胞有機溶劑萃取沉淀熱變形鹽析過離子交換樹脂柱透析冷凍干燥酶制劑4.酶分子量的測定普通采用超離心沉降速度、凝膠層析和聚丙烯酰胺凝膠電泳辦法和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF）測定酶的分子量。5.酶的劑型與保存酶制劑常以四種劑型供應(yīng)：液體酶制劑。在除去菌體后不再純化而直接制成或加以濃縮，比較經(jīng)濟，但不穩(wěn)定，并且成分復(fù)雜。固體酶制劑。發(fā)酵液通過殺菌后直接濃縮干燥制成，有的則加有淀粉等填充料。純酶制劑。涉及結(jié)晶酶在內(nèi)，普通用作分析試劑或用作醫(yī)療藥品，規(guī)定有較高的純度。固定化酶制劑。是借助物理辦法或化學(xué)辦法將酶固定于水不溶性或者水溶性載體而制成的一種酶制劑形式。影響酶保存期的因素(1)溫度:在低溫條件下(0~4℃)使用、解決和保存。(2)pH值:pH應(yīng)在酶的pH穩(wěn)定范疇內(nèi)，采用緩沖液保存。(3)酶蛋白的濃度:普通酶濃度高較穩(wěn)定,低濃度時易于解離、吸附或表面發(fā)生變性失效。(4)氧:有些酶易于氧化而失活。(5)為提高酶的穩(wěn)定性常加入穩(wěn)定劑。（底物、克制劑和輔酶；對巰基有保護作用的保護劑；Ca2+保護淀粉酶；Mn2+保護溶菌酶）共價調(diào)節(jié)酶共價調(diào)節(jié)酶（covalentregulatoryenzyme）是一類由其它酶對其構(gòu)造進行可逆共價修飾，使其處在活性和非活性的互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶活性。共價調(diào)節(jié)酶普通都存在相對無活性和有活性兩種形式，兩種形式之間互變的正、逆向反映由不同的酶催化。磷酸化是可逆共價修飾中最常見的類型。蛋白激酶的調(diào)節(jié)作用能被催化水解磷酸基團的蛋白質(zhì)磷酸酶逆轉(zhuǎn)。通過磷酸化和脫磷酸化作用，使酶在活性形式和非活性形式之間互變。另外尚有腺苷酸化/脫腺苷酸化、甲基化/脫甲基化，乙?；?脫乙酰基化等。抗體酶(Abzyme)具催化能力的免疫球蛋白稱為抗體酶或催化抗體。通過變化抗體中與抗原結(jié)合的微環(huán)境，并在適宜的部位引入對應(yīng)的催化基團，所產(chǎn)生的含有催化活性的抗體。由兩種途徑獲得抗體酶：①采用過渡態(tài)的底物類似物誘導(dǎo)；②在現(xiàn)有的抗體基礎(chǔ)上，通過化學(xué)修飾或通過蛋白質(zhì)工程向其配體結(jié)合部位導(dǎo)入催化基團。1986年——Pollack,S.J.等人報道了含有催化活性的抗體，被認(rèn)為抗體酶?？贵w酶含有典型的酶反映特性；抗體酶還含有與天然酶相近的米氏方程動力學(xué)及pH依賴性等。第四章酶的穩(wěn)定性和固定化第一節(jié)酶的穩(wěn)定性的分子因素酶的穩(wěn)定性是指酶抵抗多個因素的影響，保持其活性的能力。酶的催化活性是由其特殊的空間構(gòu)造決定的。穩(wěn)定的酶的空間構(gòu)造是由穩(wěn)定酶空間構(gòu)造的力決定的。穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的力：◆鹽鍵、氫鍵和范德華力蛋白質(zhì)中鹽鍵的數(shù)目較少，但由于它能維持二級構(gòu)造，對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性作用明顯?！舳蜴I、酯鍵蛋白質(zhì)分子內(nèi)形成二硫鍵，使伸展蛋白質(zhì)的熵急劇減少，因而天然蛋白質(zhì)和變性蛋白質(zhì)的自由能間的差別增加。◆疏水作用帶有非極性側(cè)鏈的氨基酸大概占蛋白質(zhì)分子總體積的二分之一，蛋白質(zhì)的非極性部分總是趨向于使其不與水接觸，并盡量地隱藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部。這種疏水作用使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加。酶穩(wěn)定的分子因素：◆穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的力(鹽鍵、氫鍵、二硫鍵、酯鍵、范德華力和疏水作用)。金屬離子、底物、輔助因子和其它低相對分子量配體和酶互相作用使酶蛋白構(gòu)象穩(wěn)定。金屬離子由于結(jié)合到多肽鏈的不穩(wěn)定部分（特別是拐彎處），能夠明顯增加酶的穩(wěn)定性。酶蛋白質(zhì)與其它的生物大分子特別是蛋白質(zhì)與脂的作用。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)常與脂類或多糖互相作用形成復(fù)合物，屏蔽了蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域，從而明顯增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。氨基酸殘基的堅實裝配蛋白質(zhì)分子中存在約25%的體積的空隙，這些空隙普通為水分子所充滿。由布朗運動調(diào)節(jié)的極性水分子與蛋白質(zhì)疏水核的接觸會造成蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。對氧化修飾敏感的氨基酸含量較低活性部位的氨基酸殘基的氧化作用是酶失活的最常見機理之一。如半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚環(huán)，對氧化特別敏感。第二節(jié)酶不可逆失活的因素和機理蛋白質(zhì)水解酶作用微生物和外源蛋白水解酶作用催化肽鍵水解。由基因工程菌純化真核細(xì)胞多肽時收率低，是由于體外蛋白水解造成的。聚合作用聚合作用首先使包埋的疏水性氨基酸殘基暴露于水溶劑，造成蛋白質(zhì)可逆變性；另首先，蛋白質(zhì)分子彼此締合，以減少疏水氨基酸的不利裸露；最后，如果蛋白質(zhì)分子含有半胱氨酸和胱氨酸殘基，則會發(fā)生分子間二硫鍵交換反映。聚合作用有時可通過還原和再氧化再生天然二硫鍵，使蛋白質(zhì)再活化。聚合和簡樸沉淀是有區(qū)別的，后者并未使蛋白質(zhì)發(fā)生明顯的構(gòu)象變化。極端pH極端pH條件下，一旦遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)的等電點，蛋白質(zhì)分子內(nèi)相似相似電荷間的靜電斥力會造成蛋白質(zhì)伸展，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的非電離殘基會電離，這些構(gòu)象變化能造成不可逆失活。另外，強酸條件下或中檔pH和高溫相結(jié)合的條件下，肽鍵容易發(fā)生水解。如:堿催化的β-消除反映可破壞蛋白質(zhì)的二硫鍵。氧化作用多個氧化劑能氧化帶芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基。常見的蛋白質(zhì)氧化劑：分子氧、過氧水和氧自由基。表面活性劑(去污劑)陰離子去污劑如十二烷基硫酸鈉（SDS）與蛋白質(zhì)結(jié)合時造成蛋白質(zhì)伸展，使原先埋藏的疏水氨基酸暴露，有助于SDS的進一步結(jié)合，直至達(dá)成飽和為止，SDS聚集在蛋白質(zhì)暴露的疏水區(qū)域周邊。對于全部蛋白質(zhì)來說，每克蛋白質(zhì)結(jié)合SDS的最大量類似，大概1.4g/g。陽離子去污劑也能結(jié)合蛋白質(zhì)，而它的臨界膠束濃度（CMC）是SDS的10倍，因而，蛋白質(zhì)更能抵抗陽離子去污劑的變性作用。非離子去污劑如TritonX-100普通不能使蛋白質(zhì)變性。變性劑（脲和鹽酸胍、高濃度鹽、螯合劑、有機溶劑）重金屬離子和巰基試劑重金屬陽離子如Hg2+、Cd2+、Pb2+能與蛋白質(zhì)的巰基反映（將其轉(zhuǎn)化為硫醇鹽），也能與組氨酸和色氨酸殘基反映。另外銀或汞能催化水解二硫鍵。巰基試劑通過還原二硫鍵也能使酶失活，但普通是可逆的。熱熱失活是最常見的蛋白質(zhì)失活方式。酶可逆伸展使它的反映基團和疏水區(qū)域暴露，隨即互相作用造成不可逆失活。機械力機械力（壓力、剪切力、振動）和超聲波能使蛋白質(zhì)變性。冷凍和脫水低溫削弱了疏水互相作用，引發(fā)蛋白質(zhì)的解離和變性。冷凍過程中，蛋白質(zhì)隨著水分子結(jié)晶而被濃縮，引發(fā)酶微環(huán)境中的pH和離子強度的激烈變化，從而引發(fā)寡聚蛋白質(zhì)的解離。尚有一因素是二硫鍵交換和巰基氧化。酶的失水和冷凍是相似的。輻射作用電離輻射（如X射線、γ射線、電子、α粒子）由于形成自由基引發(fā)蛋白質(zhì)一級構(gòu)造的變化，造成天然構(gòu)象喪失或聚合。非電離輻射，如可見光或紫外線輻射也能使蛋白質(zhì)失活。它能吸取光，然后氧化蛋白質(zhì)分子中的敏感基團（半胱氨酸、色氨酸、組氨酸）。第三節(jié)酶的穩(wěn)定化一、固定化酶固定到載體上后產(chǎn)生空間障礙，其它大分子難以與酶作用。固定化后，載體阻擋酶不能與失活劑結(jié)合，因而能克制化學(xué)失活。在固定化系統(tǒng)中，氧向酶的擴散可被多價電解質(zhì)支持物的鹽析效應(yīng)所遏止，因此可穩(wěn)定對氧不穩(wěn)定的酶蛋白。酶包埋在多孔顆粒內(nèi)部，首先使酶的構(gòu)象更加結(jié)實，從而制止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過渡,克制酶的自降解；另首先，對底物的擴散克制可明顯使固定化酶穩(wěn)定化。固定化酶由于微環(huán)境的變化，其最適pH、底物專一性和動力學(xué)常數(shù)會發(fā)生變化。二、非共價修飾反相膠束是由兩性化合物在占優(yōu)勢的有機相中形成的，它能夠包埋酶或使酶微囊化，使酶在不利的環(huán)境下起作用。許多化合物可增加溶液酶或凍干過程中酶的穩(wěn)定性。這類添加劑分為3類：專一性的底物和配體；非專一性的中性鹽和多羥基化合物；與酶失活劑競爭的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、螯合劑、還原劑。蛋白質(zhì)間非共價相連,由于從蛋白質(zhì)表面互相作用區(qū)域排除水，因而減少自由能，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。酶的聚合體的活力和穩(wěn)定性也常比其單體高。三、化學(xué)修飾可溶性大分子修飾酶。如聚乙二醇、右旋糖酐、肝素等多糖以及白蛋白、多聚氨基酸等，可通過共價鍵連結(jié)于酶表面，形成一種覆蓋層，這種可溶性的固定化酶有諸多有用的新性質(zhì)?？扇苄孕》肿有揎椕?。由于修飾“核心功效基團”也會達(dá)成穩(wěn)定化，會獲得不同于天然蛋白質(zhì)構(gòu)象的更穩(wěn)定構(gòu)象；用非極性試劑修飾會加強蛋白質(zhì)中的疏水作用，蛋白質(zhì)的表面基團親水化。四、蛋白質(zhì)工程用基因操作技術(shù)高度專一性地變化目的蛋白質(zhì)。第四節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞固定化酶（immobilizedenzyme）是指在一定空間范疇內(nèi)起催化作用,并能重復(fù)和持續(xù)使用的酶。固定化酶的優(yōu)點:極易將酶與底物、產(chǎn)物分開；能夠在較長時間內(nèi)進行重復(fù)分批反映和裝柱持續(xù)反映；在大多數(shù)狀況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；酶反映過程能夠加以嚴(yán)格控制；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；較游離酶更適合于多酶反映；能夠增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；酶的使用效率提高，成本減少。固定化酶的缺點:固定化時，酶活力有損失；增加了生產(chǎn)的成本，初始投資大；只能用于可溶性底物，并且較合用于小分子底物，對大分子底物不合用；與完整菌體相比不適宜于多酶反映，特別是需要輔助因子的反映；胞內(nèi)酶進行固定化時必須通過酶的分離純化操作。固定化酶的制備原則:必須注意維持酶的催化活性及專一性。固定化應(yīng)有助于生產(chǎn)自動化、持續(xù)化。。固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。盡量不妨礙酶與底物的靠近，以提高產(chǎn)物的量。酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。即不影響酶的原有構(gòu)象,又使固定化酶能回收貯藏，利于重復(fù)使用。固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反映液發(fā)生化學(xué)反映。固定化酶成本要低。以利于工業(yè)使用。一、吸附法物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化辦法。無機載體有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高嶺石、氧化鋁、硅膠、膨潤土、羥基磷灰石、磷酸鈣、金屬氧化物等；有機載體有淀粉、纖維素、膠原等；近來，大孔型合成樹脂、陶瓷等載體也十分引人注目；另外尚有疏水基的載體（丁基或己基-葡聚糖凝膠），以及以單寧作為配體的纖維素衍生物等載體。物理吸附法酶活力損失少，但容易脫落。離子吸附法(ionbinding)：酶通過離子鍵結(jié)合與含有離子交換基的水不溶性載體的固定化辦法。用于此法的載體有陰離子交換劑如DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠；陽離子交換劑如CM-纖維素，Dowex-50等。二、共價結(jié)正當(dāng)(covalentbinding)酶與載體以共價鍵結(jié)合的固定化辦法，是載體結(jié)正當(dāng)中報道最多的辦法。歸納起來有兩類，一是將載體有關(guān)基團活化，然后與酶有關(guān)基團發(fā)生偶聯(lián)反映；另一種是在載體上接上一種雙功效試劑，然后將酶偶聯(lián)上去?？膳c載體結(jié)合的酶的功效團有氨基、羧基、巰基、羥基、咪唑基、酚基等，參加共價結(jié)合的氨基酸殘基不應(yīng)是酶催化活性所必需的，否則會造成固定后酶活力喪失。所用載體分三類：天然有機載體（如纖維素、葡聚糖凝膠等）、無機物（玻璃、陶瓷等）和合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍等），其活化辦法依載體性質(zhì)各不相似。三、交聯(lián)法(crosslinking)用雙功效或多功效試劑使酶與酶或微生物與微生物細(xì)胞之間交聯(lián)的固定化辦法。最常見的交聯(lián)劑是戊二醛。交聯(lián)法反映條件比較激烈，固定化酶活回收率普通較低。包埋法(entrapment)將酶或微生物包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為凝膠包埋(gel/latticentrapment)。載體材料有海藻酸納、角叉菜膠、明膠和卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光膠聯(lián)樹脂等合成凝膠或樹脂。天然凝膠采用溶膠狀天然高分子化合物在酶或微生物存在下凝膠化的辦法。合成高分子則采用合成高分子單體或預(yù)聚物在酶或微生物存在下聚合的辦法，但會引發(fā)酶的部分失活。網(wǎng)格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的辦法。將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型包埋(microentrapsulation)。微囊型固定化酶普通直徑為幾微米的球狀體，顆粒比網(wǎng)格型的要小得多，適合小分子底物和產(chǎn)物的酶的固定化，如脲酶、過氧化氫酶等。其制造的辦法有：界面沉淀法、界面聚正當(dāng)、二級乳化法和液膜法等。固定化后酶活力的變化及其因素:固定化酶的活力在多數(shù)狀況下比天然酶小，其專一性也能發(fā)生變化。因素可能是：酶分子在固定化過程中，空間構(gòu)象會有所變化，甚至?xí)绊懟钚灾行牡陌被釟埢还潭ɑ?，酶分子空間自由度受到限制，直接影響到活性中心對底物的定位作用；內(nèi)擴散阻力使底物分子與活性中心的靠近受阻；包埋時酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能透過膜與酶靠近。固定化對酶穩(wěn)定性的影響大多數(shù)狀況下，酶固定化后穩(wěn)定性有所提高：固定化酶熱穩(wěn)定性提高；對多個有機試劑及酶克制劑的穩(wěn)定性提高；固定化酶對pH穩(wěn)定性、對蛋白酶穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性都有提高。固定化后酶穩(wěn)定性提高的因素：酶分子與載體多點連接，可避免酶分子變形；酶活力的緩慢釋放；克制酶的自降解。輔酶物質(zhì)的固定化舉例：酪氨酸脫羧酶的固定化需要磷酸吡哆醛為輔酶。這類酶能夠直接偶聯(lián)固定，也能夠通過輔酶物質(zhì)對酶蛋白進行親和吸附固定?？刹捎孟旅嫒N辦法：CNBr活化結(jié)正當(dāng)、重氮反映或烴化反映加臂偶聯(lián)法；通過磷酸吡哆醛親和結(jié)正當(dāng)。親和固定法的優(yōu)點是它對酶蛋白的高級構(gòu)造影響較小；缺點是由于在親和結(jié)合中要用去酶的一種活性中心，酶將因此失去部分催化能力。酶蛋白和輔酶結(jié)合弱，固定化后需要補充另外對應(yīng)的輔酶物質(zhì)，酶才干發(fā)揮其正常的催化功效。為了避免輔酶物質(zhì)的流失，普通的措施是先將它們結(jié)合于水溶性載體如葡聚糖等上，然后再和固定化的酶蛋白混合一并放于半透膜內(nèi)。偶聯(lián)酶系的固定化某些生化反映需要多個酶協(xié)同完畢，固定化的偶聯(lián)多酶系統(tǒng)是符合這種規(guī)定的高效而簡便的應(yīng)用形式。偶聯(lián)的多酶系統(tǒng)能夠通過多個方式進行固定化：用膠或微囊進行混合包埋；以共價偶聯(lián)方式共固定于同一載體上或分別固定于不同顆?；蚰?gòu)造上。固定化細(xì)胞優(yōu)越性：1)無需進行酶的分離、純化，減少酶活力的損失，減少成本；2）能夠進行多酶反映，且不需添加輔助因子；3）保持酶的原始狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性更高，對污染的抵抗力更強；4）細(xì)胞生長停滯時間短，細(xì)胞多，反映快。固定化細(xì)胞的缺點：1)菌體自溶，影響產(chǎn)物純度；2）細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對目的酶的分解；3）胞內(nèi)多酶的存在會形成副產(chǎn)物；4）載體、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁會造成底物滲入與擴散障礙。固定化細(xì)胞物理吸附法重要運用細(xì)胞與載體之間的靜電引力和專一的親和作用，使細(xì)胞規(guī)定在不同的載體（如硅藻土、陶瓷、玻璃和塑料）上。如酵母細(xì)胞帶負(fù)電荷，在固定化時可用帶正電荷的載體使其固定化。包埋法將細(xì)胞包埋在多孔在體內(nèi)而制成固定化細(xì)胞的辦法。這是固定細(xì)胞最慣用的辦法。包埋法分為凝膠包埋法和半透膜包埋法等。慣用的包埋材料為聚丙烯酰胺、瓊脂、明膠、海藻酸鈣和角叉（菜）膠等，其中聚丙烯酰胺應(yīng)用最多最早。直接固定化法不用載體，借助物理或化學(xué)辦法將細(xì)胞直接固定的辦法。這種固定化既可發(fā)生在細(xì)胞構(gòu)造上，也可通過細(xì)胞聚集來完畢。對于微生物，能夠借助加熱、冰凍或β-射線等物理手段進行固定化，也可應(yīng)用檸檬酸、多個絮凝劑、交聯(lián)劑和變性劑等解決達(dá)成固定化。固定化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用：固定化酶在淀粉和糖工業(yè)中的應(yīng)用固定化葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)高果糖漿固定化蔗糖酶有蔗糖生產(chǎn)轉(zhuǎn)化糖固定化α-半乳糖苷酶水解棉子糖固定化酶在乳制品中的應(yīng)用固定化β-半乳糖苷酶（乳糖酶）水解乳糖固定化過氧化氫酶用于牛乳的滅菌固定化酶在飲料和果汁生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化酶在啤酒生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化酶在果汁生產(chǎn)中的應(yīng)用在速溶茶生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化酶在油脂改性中的應(yīng)用固定化1,3-特異性脂肪酶催化酯交換，將棕櫚油改性為代可可脂。固定化酶在食品添加劑和調(diào)味劑中的應(yīng)用固定化富馬酸酶生產(chǎn)L-蘋果酸等酸味劑。固定化酶生產(chǎn)L-谷氨酸、賴氨酸等。固定化酶生產(chǎn)阿斯巴甜等甜味劑。固定化酶直接作為食品的防腐劑使用。固定化酶在食品分析與檢測中的應(yīng)用葡萄糖酶傳感器：葡萄糖氧化酶+氧電極脲酶電極法測定食品賴氨酸的含量固定化蔗糖轉(zhuǎn)化酶,葡萄糖變旋酶及葡萄糖氧化酶的復(fù)合酶膜構(gòu)成的過氧化氫雙電極系統(tǒng),可同時測定樣品中蔗糖和葡萄糖的含量在釀酒過程中,將乙醇酶和葡萄糖氧化酶固定成酶膜,與電極連接,制成的生物傳感器可監(jiān)控葡萄糖和乙醇的濃度;運用嘌呤氧化酶電極,檢測酶催化反映中過氧化氫的產(chǎn)生量,可對魚新鮮度進行測定;淀粉雙酶傳感器能夠測定食品中淀粉的含量。第五節(jié)酶反映器(Reactorsforenzymaticcatalysis)什么是酶反映器？用于酶進行催化反映的容器及其附屬設(shè)備稱為酶反映器。酶反映器是用于完畢酶促反映的核心裝置。它為酶催化反映提供適宜的場合和最佳的反映條件，方便在酶的催化下，使底物（原料）最大程度地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。它處在酶催化應(yīng)過程的中心地位，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。酶反映器類型(1)批量式酶反映器又稱為間歇式反映器（BatchStirredTankReactor，BSTR）、間歇式攪拌罐、攪拌式反映罐。其特點是：底物與酶一次性投入反映器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出；反映完畢之后，固定化酶（細(xì)胞）用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批反映。優(yōu)點是：裝置較簡樸，造價較低，傳質(zhì)阻力很小，反映能很快速達(dá)成穩(wěn)態(tài)。缺點是：操作麻煩，固定化酶經(jīng)重復(fù)回收使用時，易失去活性，故在工業(yè)生產(chǎn)中，間歇式酶反映器極少用于固定化酶，但慣用于游離酶。(2)持續(xù)式酶反映器又稱為持續(xù)攪拌釜式反映器（ContinuousStirredTankReactor,CSTR）、持續(xù)式攪拌罐。向反映器投入固定化酶和底物溶液，不停攪拌，反映達(dá)成平衡之后，再以恒定的流速持續(xù)流入底物溶液，同時，以相似流速輸出反映液（含產(chǎn)物）。優(yōu)點是：在抱負(fù)狀況下，混合良好，各部分構(gòu)成相似，并與輸出成分一致。缺點是：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒(3)填充床反映器填充床反映器（PackedBedReactor,PBR）,又稱固定床反映器。將固定化酶填充于反映器內(nèi)，制成穩(wěn)定的柱床，然后，通入底物溶液，在一定的反映條件下實現(xiàn)酶催化反映，以一定的流速，收集輸出的轉(zhuǎn)化液（含產(chǎn)物）。優(yōu)點是：高效率、易操作、構(gòu)造簡樸等，因而，PBR是現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)及研究中應(yīng)用最為普遍的反映器。它合用于多個形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及有產(chǎn)物克制的轉(zhuǎn)化反映。缺點是：傳質(zhì)系數(shù)和傳熱系數(shù)相對較低。當(dāng)?shù)孜锶芤汉腆w顆粒或黏度很大時，不適宜采用PBR。(4)流化床反映器流化床反映器（FluidizedBedReactor,FBR）。特點是：底物溶液以足夠大的流速，從反映器底部向上通過固定化酶柱床時，便能使固定化酶顆粒始終處在流化狀態(tài)。其流動方式使反映液的混合程度介于CSTR的全混型和PBR的平推流型之間。FBR可用于解決黏度較大和含有固體顆粒的底物溶度，同時，亦可用于需要供氣體或排放氣體的酶反映（即固、液、氣三相反映）。但因FBR混合均勻，故不合用于有產(chǎn)物克制的酶反映。(5)持續(xù)攪拌桶-超濾反映器(CSTR/UF)CSTR/UF構(gòu)造是CSTR與UF超濾裝置聯(lián)用的酶膜反映器。在CSTR的出口處設(shè)立一種超濾裝置，通過超濾裝置，酶能夠循環(huán)使用。其構(gòu)造以下圖所示。該超濾裝置的半透膜只允許小分子產(chǎn)物通過，不允許大分子酶和底物通過。該反映器合用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。(6)循環(huán)反映器(RecycleReactor,RCR)循環(huán)反映器是將部分流出物與加料流混合，然后再將其送入反映器。循環(huán)反映器可分為：外循環(huán)反映器和內(nèi)循環(huán)反映器。(7)膜反映器膜反映器（membranereactor,MR）是將酶催化反映與半透膜的分離作用組合在一起而成的反映器。能夠用于游離酶的催化反映，也能夠用于固定化酶的催化反映。用于固定化酶催化反映的膜反映器是將酶固定在含有一定孔徑的多孔薄膜中，而制成的一種生物反映器。膜反映器能夠制成平板型、螺旋型、管型、中空纖維型、轉(zhuǎn)盤型等多個形狀。慣用的是中空纖維反映器。第五章酶修飾與模擬第一節(jié)、酶的修飾什么是酶分子修飾？通過多個辦法使酶分子的構(gòu)造發(fā)生某些變化，從而變化酶的某些特性和功效的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的辦法與某些化學(xué)基團（物質(zhì)），特別是含有生物相容性的物質(zhì)，進行共價連接，從而變化酶的構(gòu)造和性質(zhì)。酶分子修飾的辦法：(1)酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功效發(fā)生變化的修飾辦法稱為金屬離子置換修飾。若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性能夠恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的能夠使酶的活性減少甚至喪失，有的卻能夠使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。(2)酶的大分子結(jié)合修飾運用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間構(gòu)造發(fā)生某些細(xì)微的變化，從而變化酶的特性和功效的辦法，稱為酶的大分子結(jié)合修飾法。通過大分子結(jié)合修飾的酶可明顯提高酶活力、增強穩(wěn)定性和減少抗原性。慣用的水溶性大分子修飾劑有右旋糖苷、聚乙二醇、聚蔗糖、淀粉、白蛋白、明膠等。酶活力減少到原來活力的二分之一所通過的時間，稱為酶的半衰期。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶(SOD),不僅能夠減少或消除酶的抗原性，并且提高了抗蛋白酶的活力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。(3)酶分子的側(cè)鏈基團修飾采用一定的辦法（普通為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團發(fā)生變化，從而變化酶分子的特性和功效的修飾辦法。用于研究多個基團在酶分子中的作用及其對酶的構(gòu)造、特性和功效的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團時經(jīng)常采用。酶蛋白的側(cè)鏈基團是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功效團。重要涉及氨基、羧基、巰基、酚基等。這些基團能夠形成多個副鍵，對酶蛋白空間構(gòu)造的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團一旦變化將引發(fā)酶蛋白空間構(gòu)象的變化，從而變化酶的特性和功效(4)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)運用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)構(gòu)造及其空間構(gòu)造發(fā)生某些變化，從而變化酶的特性和功效的辦法。酶蛋白主鏈修飾重要是靠酶切/酶原激活法。5)氨基酸置換修飾將酶分子肽鏈上某個氨基酸換成另一種氨基酸的修飾辦法，稱為氨基酸置換修飾。氨基酸的置換修飾能夠采用化學(xué)修飾辦法?，F(xiàn)在慣用的氨基酸置換修飾的辦法是定點突變技術(shù)。(6)酶分子的親和標(biāo)記修飾親和標(biāo)記是一種特殊的化學(xué)修飾辦法。它運用酶和底物的親和性,使用與酶底物類似的修飾劑,對酶活性部位上的氨基酸殘疾進行共價標(biāo)記。這類專一性的化學(xué)修飾也稱為親和標(biāo)記或?qū)Ｒ恍缘牟豢赡婵酥菩揎?。即試劑作用于被作用部位的某一基團?？捎脕碜鳛橹委熌承┘膊〉挠行幤?。(7)酶分子的物理修飾通過物理修飾，能夠理解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的變化而引發(fā)酶的特性和功效的變化狀況。特點在于不變化酶的構(gòu)成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生變化，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：普通來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高?？乖裕罕容^公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、克制劑都有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：普通在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強對熱、蛋白酶、克制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時含有重要意義。修飾酶最適pH更靠近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。第二