術后制動早期大鼠比目魚肌纖維形態(tài)改變的實驗研究

術后制動早期大鼠比目魚肌纖維形態(tài)改變的實驗研究

根據(jù)臨床數(shù)據(jù)和動物實驗，運動減少和剎車會導致明顯的骨關節(jié)痛變窄。肌梭是骨骼肌內的本體感受器。我們以往的研究發(fā)現(xiàn),在后肢脫負荷條件下肌梭的傳入放電活動減少,肌梭功能活動的改變可能是廢用性肌萎縮發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。肌梭放電活動是由高位中樞調控下的γ神經元的傳出活動引起的梭內肌纖維的收縮活動,牽拉赤道部感覺末梢引起的。因此,梭內肌纖維的結構功能狀態(tài)直接決定了肌梭功能活動的改變。本研究擬通過電子顯微鏡技術觀察后肢脫負荷早期梭內肌纖維超微結構的變化,旨在揭示模擬失重引起肌梭功能活動改變的可能機制。材料和方法1.實驗動物及動物本實驗全部采用健康活潑、無呼吸道感染、無運動障礙及無皮膚病的Sprague-Dawley品系的雌性大鼠(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供),體重240~250g,共24只。按隨機配對原則分為3組:正常對照組(CON)、后肢制動3d組和后肢制動7d組,每組8只動物。2.動物術后固定采用改良后的Booth和Kelso方法,將動物用水和氯醛(0.4g/kg,腹腔注射)麻醉,在其左側后肢的踝關節(jié)、膝關節(jié)及腹股溝等血管容易受壓處襯一層薄厚適宜的棉墊,然后用石膏繃帶由踝關節(jié)向上纏繞至大腿與腹股溝處,將動物后肢固定在靜息位。單籠喂養(yǎng),能夠自由活動與進食、進水。室溫保持在20℃~25℃,人工控制動物室內照明,每晝夜均保持12h光明與黑暗交替循環(huán)。3.肌梭的分離、純化及固定各實驗動物用烏拉坦腹腔麻醉后,先后以生理鹽水、1%多聚甲醛-戊二醛固定液灌流大鼠,取出比目魚肌,置于2.5%多聚甲醛-戊二醛固定液中,4℃過夜。取出固定好的比目魚肌,在雙目解剖顯微鏡下通過折光性及梭囊辨認肌梭,用分離針完整地分離出單一肌梭。每塊比目魚肌可分離出4~10個肌梭。分離出的單一肌梭浸入2.5%戊二醛固定液4℃冰箱貯存。所有標本經2.5%戊二醛固定后,0.1M磷酸緩沖液浸洗;1%鋨酸(OsO4)后固定,乙醇梯度脫水;Epon812環(huán)氧樹脂浸泡、包埋、聚合;LKB-NOVA超薄切片機切取超薄切片;醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色;透射電鏡下觀察肌梭的超微結構并拍照。高倍鏡下梭內肌纖維超微結構的改變1.正常對照組大鼠比目魚肌肌梭的形態(tài)結構圖1A為解剖顯微鏡下分離出的一個完整肌梭。如圖1A所示,肌梭中央膨大區(qū)稱為赤道部(Equatorialu3000region);赤道部兩側為肌梭的極部(Ploaru3000region)。典型的大鼠比目魚肌肌梭由3~4條梭內肌纖維組成(圖1A,1B),包含1條核袋1纖維、1條核袋2纖維和1-2條核鏈纖維。在橫切面,上核袋2纖維直徑最粗,其次是核袋1纖維,核鏈纖維較細小(圖1B)。在高倍鏡下,細胞核集中分布于梭內肌纖維的赤道部位(圖1C),在兩極部有類似于梭外肌的橫紋樣結構(圖1D)。2.后肢制動3天后梭內肌纖維超微結構的改變制動3天后,肌梭梭囊連續(xù)、完整、較光滑,神經末梢結構無明顯改變,核袋、核鏈纖維結構基本完整,部分肌纖維出現(xiàn)水腫(圖2A)。高倍鏡下,最明顯的改變是胞漿尤其是核周線粒體明顯增生腫脹(圖2B,2C)?？v斷面Z線基本完整,無明顯排列紊亂及波浪樣改變(圖2C)。部分梭內肌纖維核膜局部出現(xiàn)膨出(圖2D)。3.后肢制動7天后梭內肌纖維超微結構的改變制動7天后,肌梭梭囊明顯迂曲,間質增生,梭內肌纖維直徑明顯減小,整個肌梭呈固縮狀(圖3A)。高倍鏡下,最明顯的改變是細胞核的退行性改變(圖3B,3C):核膜迂曲內陷,細胞核變形,核周出現(xiàn)大量的溶酶體樣致密物(圖3B);部分核袋纖維核區(qū)細胞核消失(圖3C)。感覺神經末梢也可見溶酶體樣物質(圖3D)。結構功能狀態(tài)對肌梭功能的影響如所周知,梭外肌的張力維持是由γ神經元和肌梭形成的γ環(huán)路來控制的。在后肢脫負荷的條件下,由于重力作用的消失,梭外肌纖維處于縮短位,肌梭的生理性刺激減少甚至消失。此時肌梭的傳入活動則可能主要依賴于高位中樞調控下的γ運動神經元的傳出活動引起的梭內肌的收縮。研究資料表明,后肢脫負荷的條件下,大腦皮層運動區(qū)、小腦蚓部等部位神經元的活性減弱。這些中樞部位神經元活性的減弱,必將減弱對γ-傳出活動的抑制。而后肢脫負荷的條件下,γ-運動神經元的形態(tài)結構無明顯改變。因此,梭內肌纖維的結構功能狀態(tài)直接決定了肌梭功能活動的改變,進而影響梭外肌的功能活動。本研究結果表明,后肢脫負荷3天,梭內肌纖維的線粒體結構就發(fā)生改變。線粒體是細胞進行有氧氧化的關鍵部位,線粒體發(fā)生代償性乃至破壞性的改變,必然會影響到細胞的代謝活動。肌梭是一種慢適應牽張感受器,即使在松弛狀態(tài)下肌梭也有自發(fā)的放電活動,這必然需要大量的鈉泵活動泵出不斷內流入感覺神經末梢內的Na+,以維持細胞的靜息膜電位,恢復肌梭的興奮性。線粒體結構的改變,必然會使Na+-K+-ATP酶的活動受到影響,進而影響肌梭感覺神經末梢的靜息膜電位,影響肌梭對外界刺激反應的敏感性。以往的研究資料表明,凋亡機制可能參與了廢用條件下梭外肌萎縮的發(fā)生和發(fā)展。由于肌梭結構的特殊性,至今未看到有關梭內肌纖維凋亡的相關研究。本研究發(fā)現(xiàn),梭內肌纖維在脫負荷早期,梭內肌纖維的細胞核的結構也發(fā)生明顯的退行性改變,這種改變明顯早于、且重于梭外肌纖維的改變。本研究組以往的研究結果發(fā)現(xiàn),后肢脫負荷3天后,大鼠比目魚肌肌梭內Ca2+熒光強度明顯增加,提示游離Ca2+濃度增加。關于這種細胞核的改變、鈣超負荷及線粒體改變的關系及其機制還不清楚,還有待于進一步的研究。無論是線粒體結構的改變、