二次膠原酶消化法培養(yǎng)大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞的研究

二次膠原酶消化法培養(yǎng)大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞的研究

在過去10年中，特別是在接下來的幾年里，隨著細(xì)胞繁殖技術(shù)的發(fā)展，骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的外部培養(yǎng)開始流行起來。本實(shí)驗(yàn)采用二次膠原酶消化法分離新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞,通過形態(tài)學(xué)觀察、ALP染色、骨鈣素測定進(jìn)行鑒定,得到比較純化的成骨細(xì)胞,為進(jìn)一步在細(xì)胞及分子水平研究骨代謝性疾病打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1骨、組織的提取參照文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法,將新生1～2d的SD大鼠(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)每次4只,放入75%酒精中浸泡消毒10min,無菌操作取出顱蓋骨。將顱骨置于含PBS液的培養(yǎng)皿中,清除骨膜、血管和結(jié)締組織,并用PBS液洗滌3次。然后將顱蓋骨移入0.1%膠原酶Ⅰ型消化液的小瓶中(Sigma公司產(chǎn)品)靜置15min,以消化清除掉骨髓和纖維組織。再將骨移入另一含0.1%膠原酶Ⅰ型的消化液小瓶中,用眼科剪在消化液內(nèi)剪碎,37℃振蕩消化20min。用吸管吹打數(shù)次,將含細(xì)胞的消化液移入無菌離心管內(nèi),在1000r/min下離心10min,傾棄上清液,沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊加入5ml含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基,吹打使細(xì)胞懸浮,再靜置1～2min,用10ml注射器將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液吸盡,剩下的即為顱骨碎塊棄掉不要?？色@得(8～9)×105個(gè)細(xì)胞。1.2培養(yǎng)基和傳代培養(yǎng)將制備的細(xì)胞懸液按2×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)種于25ml培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)基的量為2.5ml。置培養(yǎng)瓶于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。2～3d換藥一次。一般于原代培養(yǎng)的10d左右細(xì)胞融合進(jìn)行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。1.3細(xì)胞生物學(xué)檢測A形態(tài)觀察,在倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目變化,至細(xì)胞出現(xiàn)融合,聚集重疊成結(jié)節(jié)狀。B透射電鏡觀察第二代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心成細(xì)胞團(tuán)塊,用2.5%戊二醛固定2h,1%四氧化鋨再固定1.5h,經(jīng)梯度丙酮脫水,環(huán)氧樹脂浸透包埋,超薄切片機(jī)切片,常規(guī)處理后,用日產(chǎn)EMIOC/CR型透射電鏡觀察。C堿性磷酸酶(ALP)染色。鈣鈷法,第二代培養(yǎng)的細(xì)胞,從培養(yǎng)瓶內(nèi)取長有細(xì)胞的蓋玻片條,丙酮固定片刻,空氣干燥,置于β甘油磷酸鈉孵育液中2h,蒸餾水漂洗,加入2%硝酸鈷5min置換鈣,蒸餾水漂洗,再加入0.5%的硫化銨1min,自來水漂洗,鏡檢觀察。D細(xì)胞內(nèi)骨鈣素測定:合成及分泌骨鈣素是成骨細(xì)胞的特征之一。第二代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,取106個(gè)細(xì)胞,離心后加入1mlPBS與0.2%trito-x-100(含4mMEDTA)按1∶1混合,靜置10min后,用放免法測定細(xì)胞內(nèi)骨鈣素的含量(北方生物技術(shù)研究所提供放免藥盒)2結(jié)果2.1胞漿形態(tài)數(shù)量的變化原代培養(yǎng)的新生大鼠顱骨成骨細(xì)胞懸液經(jīng)24h培養(yǎng),在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞貼壁生長,細(xì)胞呈三角形,紡綞形和多角形等多種形態(tài)。胞漿向外伸展,并伸出突起(圖1)。72h后,數(shù)量增多且細(xì)胞部分相連(圖2)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞呈指數(shù)增長,細(xì)胞體積增大,胞漿豐富。10d左右,細(xì)胞融合,相鄰細(xì)胞彼此貼靠或兩者突起相連,細(xì)胞邊界難以區(qū)分,傳代培養(yǎng)20d出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣物,呈鋪石狀排列,大多呈立方形。2.2基綜合體形態(tài)電鏡下成骨細(xì)胞核呈卵圓形,較大,偏短,高爾基復(fù)合體較大,線粒體較多,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張,常見溶酶體、有衣小泡,糖原顆粒,細(xì)胞表面有短小的微絨毛,相鄰細(xì)胞以突起相連(圖3)。2.3酸性磷酸酶染色第二代的細(xì)胞經(jīng)堿性磷酸酶染色后,大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)陽性反應(yīng),細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)顆粒均呈陽性反應(yīng),染色呈黑褐色顆粒。2.4內(nèi)骨鈣含量測定培養(yǎng)的第二代成骨細(xì)胞融合后,取106個(gè)細(xì)胞破膜處理測得骨鈣素在25.45±5.81ng。3體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的可行性骨組織在人的一生中不斷更新,是一種代謝很活躍的組織,主要由二種細(xì)胞——成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞發(fā)揮作用。成骨細(xì)胞是骨發(fā)生和骨形成的重要細(xì)胞,具有合成、分泌組成骨基質(zhì)的膠原和糖蛋白的作用,并通過鈣化基質(zhì)形成骨組織。另外,成骨細(xì)胞在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、生理機(jī)制調(diào)節(jié)和骨代謝性疾病中亦發(fā)揮重要作用。近幾年,隨著醫(yī)學(xué)科研水平的高速發(fā)展,分子生物學(xué)已滲透到醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)成功,為其相應(yīng)的研究提供了基礎(chǔ)。我們用新生大鼠的頭蓋骨作培養(yǎng)材料,應(yīng)用Ⅰ型膠原酶進(jìn)行2次消化,第一次消化可將顱骨表面的纖維組織及骨髓組織去掉。第二次消化可收集到約(8～9)×105個(gè)細(xì)胞。在含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),獲得理想的原代和傳代的細(xì)胞。經(jīng)倒置顯微鏡、透射電鏡、堿性磷酸酶染色、細(xì)胞內(nèi)骨鈣素測定,顯示具備成骨細(xì)胞的功能特點(diǎn)。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在其生長分化過程中存在著異質(zhì)性,可能與分離出的細(xì)胞成分復(fù)雜以及培養(yǎng)條件的影響有關(guān)。我們采取分次消化可使細(xì)胞的純度提高。因此,新生大鼠顱骨細(xì)胞培養(yǎng)模型對研究成骨細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)有可靠性和科學(xué)性,為體外進(jìn)行研究單因素對成骨細(xì)胞影響提供了保證,同時(shí)可人為控制物理及化學(xué)因素的影響。體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞相繼開展,所培養(yǎng)的材料大多選用新生1～3d的小鼠、大鼠及19～30d的胎鼠頭蓋骨。日本人由新生小鼠頭蓋骨已建立了克隆成骨細(xì)胞株MC3T3—E1。最近,國