第三章細(xì)胞生物學(xué)的研究方法

細(xì)胞生物學(xué)

研究方法學(xué)習(xí)要求熟練掌握觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的基本方法；熟練掌握進行細(xì)胞組分分析的一些基本方法；熟練掌握細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)。CompanyLogo第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法光學(xué)顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。CompanyLogo一、光學(xué)顯微技術(shù)（一）普通光學(xué)顯微鏡技術(shù)

1、構(gòu)成：照明系統(tǒng)：光源、折光鏡和聚光鏡，有時附加濾光片控制光的波長。光學(xué)放大系統(tǒng)：目鏡和物鏡組成。機械裝置

CompanyLogo目鏡物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡載物臺鏡座載物臺轉(zhuǎn)動桿鏡臂電源開關(guān)光強調(diào)節(jié)鈕聚光器粗/微調(diào)螺旋視場光闌CompanyLogo2、原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。CompanyLogo3、分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。D=0.61λ/N．A．其中λ為入射光線波長；N．A為鏡口率（數(shù)值孔徑）＝Nsinα/2。N=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）。思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？CompanyLogo介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66幾種介質(zhì)的折射率CompanyLogo顯微鏡的幾個光學(xué)特點：制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.65-1.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好（1.7）。α最大值可達1400，空氣中N=1，最短的可見光波長λ為450nm，此時D=292nm，約0.3μm。在油鏡下，N可提高到1.5，此時D可達0.2μm。普通光線的波長為400-700nm，分辨力數(shù)值約為0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設(shè)計倍數(shù)為1000X。CompanyLogo在物鏡和聚光器上都標(biāo)有它們的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判斷它們性能的最重要指標(biāo)。數(shù)值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關(guān)系，它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方根成正比。CompanyLogo石蠟切片的一般步驟：1．取材切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透。2．固定中性福爾馬林固定液，固定10小時以上。3.洗滌材料經(jīng)固定后,流水沖洗，數(shù)小時或過夜。4.脫水材料依次經(jīng)50%、70%、80%、90%、95%各級乙醇溶液脫水，各30min，再放入100%2次，每次20min。CompanyLogo5．透明材料依次經(jīng)1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液30-45min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明為止）。6．透蠟放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min,再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50-60分鐘(在60℃恒溫箱中進行)。7.包埋CompanyLogo8.切片9.展片、貼片10．染色CompanyLogo

把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。可用于觀察活細(xì)胞。1、相差顯微鏡

由澤爾尼克（P．Zernike）于1932年發(fā)明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。（二）相差和微分干涉顯微技術(shù)CompanyLogo

在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌：使照明光線從環(huán)狀的透明區(qū)進入聚光器，再斜射到標(biāo)本上。相位板：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。相位板環(huán)狀光闌CompanyLogo用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本

相差顯微鏡下的細(xì)胞有絲分裂CompanyLogo相差顯微鏡下的線蟲

相差顯微鏡下的細(xì)菌芽孢2、微分干涉顯微鏡干涉：兩列頻率相同的光波在空中相遇時發(fā)生疊加，在某些區(qū)域總加強，在另外一些區(qū)域總減弱，出現(xiàn)明暗相間的條紋或者是彩色條紋的現(xiàn)象叫做光的干涉。CompanyLogo1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明了微分干涉顯微鏡（differentialinterferencecontrastmicroscope），是以平面偏振光為光源，光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品的相鄰部位，然后經(jīng)過另一棱鏡將這兩束光匯合，從而樣品中厚度上的微小差別就會轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差，造成了標(biāo)本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。CompanyLogo微分干涉顯微鏡下的硅藻（偽彩色）

微分干涉顯微鏡適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等。如果接上錄像裝置可以記錄活細(xì)胞中的顆粒以及細(xì)胞器的運動。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。CompanyLogo特點：光源為紫外線，波長較短分辨力高于普通顯微鏡；有兩個特殊的濾光片。光源前的用以濾除可見光；目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人眼。照明方式通常為落射式。即光源通過物鏡投射于樣品上。（三）熒光顯微鏡技術(shù)CompanyLogoCompanyLogo用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreenCompanyLogo（四）激光掃描共聚焦顯微境技術(shù)

激光掃描共聚焦顯微鏡是近代最先進的細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)分析儀器之一。是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激光熒光探針，利用計算機進行圖像處理，不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片，還可對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進行實時動態(tài)地觀察和檢測。CompanyLogo特點：

用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。CompanyLogoLCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)CompanyLogo(五)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)

在生命科學(xué)領(lǐng)域，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）技術(shù)是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，可用于檢測某一細(xì)胞中兩個蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。CompanyLogo

供體蛋白CFP的發(fā)射光譜與受體蛋白YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時，用CFP的吸收波長激發(fā)CFP的發(fā)色基團將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團上，所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是YFP的熒光。CompanyLogo當(dāng)細(xì)胞內(nèi)具有高的Ca2+濃度時，鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽結(jié)合，可誘發(fā)FRET，使受體蛋白YFP發(fā)出黃色熒光，因此細(xì)胞呈黃色。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度低時，F(xiàn)RET幾乎不發(fā)生，因此檢測時CFP被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞呈綠色利用FRET檢測細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化，將CFP和YFP分別于鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽融合表達于同一個細(xì)胞內(nèi)CompanyLogo應(yīng)用:

檢測酶活性變化關(guān)于膜蛋白的研究細(xì)胞膜受體之間相互作用細(xì)胞內(nèi)分子之間相互作用CompanyLogo光漂白后熒光恢復(fù)技術(shù)（fluorescencerecoveryafterphotobleaching，F(xiàn)RAP）是使用親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)，用于檢測所標(biāo)記分子在活體細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部運動及其遷移速率。(六)熒光漂白恢復(fù)技術(shù)CompanyLogo

FRAP技術(shù)的原理利用高能激光照射細(xì)胞的某一特定區(qū)域，使該區(qū)域內(nèi)標(biāo)記的熒光分子不可逆的淬滅，這一區(qū)域稱熒光漂白（photobleaching）區(qū)。隨后，由于細(xì)胞質(zhì)中的脂質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子的運動，周圍非漂白區(qū)熒光分子不斷向光漂白區(qū)遷移。結(jié)果使熒光漂白區(qū)的熒光強度逐漸地回復(fù)到原有水平。CompanyLogo應(yīng)用：測量2-維或3-維分子運動的力度。分子運動包括膜或活細(xì)胞內(nèi)用熒光標(biāo)明的分子的擴散、轉(zhuǎn)移或其他類型的運動。

CompanyLogo二、電子顯微鏡細(xì)胞中直徑小于0.2um的結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱為超微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructure）。超微結(jié)構(gòu)需用電子顯微鏡（electronmicroscope）進行觀察。電子顯微鏡分辨率一般為0.2nm，最高達0.08nm。CompanyLogo1、電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別（一）電子顯微鏡的基本知識CompanyLogo電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的根本區(qū)別顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差CompanyLogo２、電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)和有效放大倍數(shù)

分辨本領(lǐng)：是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率電鏡分辨率受制樣技術(shù)的影響。３、電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子束照明系統(tǒng)：電子槍、聚光鏡。成像系統(tǒng)：物鏡、中間鏡和投影鏡等。真空系統(tǒng)：保持電子槍、鏡筒及記錄系統(tǒng)內(nèi)的高真空，以利于電子的運動。記錄系統(tǒng)CompanyLogo（二）主要電鏡制樣技術(shù)介紹1、超薄切片技術(shù)取材：必須要做到快、小、準(zhǔn)、冷等四大要點。固定：通常以鋨酸和戊二醛固定樣品。脫水：乙醇或丙酮梯度脫水，50％→70％→80％→90％→95％(每次5-15min)→100％(2-3次，每次15min)→100％環(huán)氧丙烷。包埋：環(huán)氧樹脂包埋。切片：以熱膨脹或螺旋推進的方式切片。染色：重金屬（鈾、鉛）鹽染色形成明暗的黑白圖象。CompanyLogo用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負(fù)染效果，分辨力可達1.5nm左右。2、負(fù)染技術(shù)負(fù)染色的肌動蛋白CompanyLogo3、冰凍蝕刻

freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復(fù)（replica）。CompanyLogo４、電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

對樣品在不同的傾角拍照，得到圖片經(jīng)處理后而展現(xiàn)的電子密度圖。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（StructuralBiology）（主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系）的主要實驗手段。CompanyLogo透射電子顯微鏡（TransmissionElectronMicroscope，TEM）是利用高能電子束充當(dāng)照明光源而進行放大成像的大型顯微分析設(shè)備。1933年，德國科學(xué)家盧斯卡（Ruska）和克諾爾（Knoll）研制出了世界上第一臺透射電鏡，并在1939年由西門子公司以這臺電鏡為樣機，量產(chǎn)了第一批商品透射電鏡，約40臺，分辨能力比光學(xué)顯微鏡提高了20倍。

5、透射電鏡技術(shù)CompanyLogo總體設(shè)計與光鏡相似，但要大得多，且上下顛倒。電鏡用電子流（電子槍發(fā)射的高速電子束）代替照明的光線；用特殊的電極或磁極（靜電透鏡和磁透鏡）代替聚光鏡、目鏡和物鏡的作用，達到聚焦和放大的作用。CompanyLogo

工作原理當(dāng)電子束透射樣品時，根據(jù)標(biāo)本各部位密度的不同，部分電子發(fā)生散射，只有剩余電子成像，經(jīng)物鏡和投射鏡等放大后投射到照相底片上或熒光屏上。散射的電子不參加成像，故標(biāo)本中密度大的部分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)，相反，標(biāo)本密度小的部位散射的電子少而形成明區(qū)。由于透射電鏡的電子穿透力較弱，所以觀察樣品需特殊制備成超薄切片（其厚度一般為50-100nm）。CompanyLogo特點：以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束波長與加速電壓(通常50-120KV)的平方根成反比。由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。用于觀察超微結(jié)構(gòu)（小于0.2um）。CompanyLogoCompanyLogo掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）是一種利用電子束掃描樣品表面從而獲得樣品信息的電子顯微鏡。它能產(chǎn)生樣品表面的高分辨率圖像，且圖像呈三維。分辨力為6-10nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。6、掃描電鏡技術(shù)CompanyLogoCompanyLogo

通過電子束照射在標(biāo)本后產(chǎn)生的二次電子成像，二次電子產(chǎn)生的多少與電子束在標(biāo)本表面的投射角有關(guān)，即與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。經(jīng)標(biāo)本表面所發(fā)射的二次電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。CompanyLogo為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。CompanyLogoCompanyLogo人類精子紅細(xì)胞CompanyLogo三、掃描隧道顯微鏡

掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）是一種利用量子理論中的隧道效應(yīng)探測物質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的儀器。它于1981年由格爾德·賓寧及海因里?！ち_雷爾在IBM位于瑞士蘇黎世的蘇黎世實驗室發(fā)明，兩位發(fā)明者因此與恩斯特·魯斯卡分享了1986年諾貝爾物理學(xué)獎。CompanyLogo原理：根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV-2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。分辨率：橫向為0.1-0.2nm，縱向可達0.001nm。用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進行觀察。CompanyLogo搬動48個Fe原子到Cu表面上構(gòu)成的量子圍欄一氧化碳分子豎立在鉑表面上形成的“分子人”硅表面7×7重構(gòu)圖硅表面硅原子的排列硅表面硅原子的排列7個鈾原子團CompanyLogo原子力顯微鏡原子力顯微鏡（AtomicForceMicroscope，AFM）是繼掃描隧道顯微鏡之后發(fā)明的一種具有原子級高分辨的新型儀器。1986年第一臺原子力顯微鏡問世。CompanyLogo原理：是一種利用原子、分子間的相互作用力來觀察物體表面微觀形貌的新型實驗技術(shù)。它有一根納米級的探針,被固定在可靈敏操控的微米級彈性懸臂上。當(dāng)探針很靠近樣品時，其頂端的原子與樣品表面原子間的作用力會使懸臂彎曲，偏離原來的位置。根據(jù)掃描樣品時探針的偏離量或振動頻率重建三維圖像，就能間接獲得樣品表面的形貌或原子成分。應(yīng)用:可以在大氣和液體環(huán)境下對各種材料和樣品進行納米區(qū)域的物理性質(zhì)包括形貌進行探測，或者直接進行納米操縱。CompanyLogo

局部蝴蝶翅膀鱗片

紅血細(xì)胞形貌圖多孔氧化鋁范本第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法一、用超速離心技術(shù)分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物轉(zhuǎn)速為10000-25000r/min的離心機稱為高速離心機。轉(zhuǎn)速>25000r/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg。

CompanyLogo1、差速離心技術(shù)：定義：差速離心（differentialcentrifugation）是采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體——核蛋白體。可將細(xì)胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。

CompanyLogo2、密度梯度離心定義：密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）是用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：有足夠大的溶解度；不與分離組分反應(yīng)；而且不會引起分離組分的凝集、變性或失活。CompanyLogo原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、糖與脂質(zhì)等成分的顯示方法CompanyLogo蛋白質(zhì)定性：氨基酸或肽與茚三酮反應(yīng)生成藍紫色化合物；蛋白質(zhì)與米倫試劑反應(yīng)形成紅色沉淀（酪氨酸特有）；氫氧化重氮與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成有色復(fù)合物。金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應(yīng)過程中生成有色沉淀，借以辨認(rèn)所檢查的物質(zhì)或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。CompanyLogoDNA定性：Feulgen反應(yīng)（醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色）。多糖定性：PAS反應(yīng)即過碘酸希夫反應(yīng)（過碘酸可氧化多糖使其暴露出醛基，醛基與品紅反應(yīng)）。脂肪定性：四氧化鋨與不飽和的脂肪酸反應(yīng)呈黑色，證明脂肪滴的存在；蘇丹Ⅲ使脂滴呈深紅。CompanyLogo三、特異蛋白抗原的定位與定性(一)免疫熒光技術(shù)將試劑抗原或試劑抗體用熒光素進行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)稱為免疫熒光素技術(shù)（immunofluorescence

）。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標(biāo)免疫法（enzyme-labeledantibodymethod）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。CompanyLogo(二)免疫電鏡技術(shù)

又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是在免疫組織化學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量抗原的技術(shù)方法。該方法為精確定位各種抗原的存在部位、研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及其在病理情況下所發(fā)生的變化提供了有效的手段。免疫電鏡技術(shù)主要經(jīng)歷了鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、酶標(biāo)記技術(shù)以及膠體金標(biāo)記技術(shù)三個主要發(fā)展階段。

CompanyLogo鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)

適用于細(xì)胞膜表面抗原的定位，由于其分子量較大，不易穿透細(xì)胞膜，定位細(xì)胞內(nèi)抗原較為困難。鐵蛋白對電鏡包埋劑的非特異性吸附很強，不適用于包埋后免疫標(biāo)記，使其應(yīng)用受到一定限制。

CompanyLogo酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)將酶（主要是過氧化物酶）與抗體相交聯(lián)，抗原抗體反應(yīng)后，加底物顯示酶的活性部位，酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)OsO4處理變?yōu)榫哂幸欢娮用芏鹊匿~黑，可在電鏡下觀察。過氧化物酶的相對分子量較小，與其交聯(lián)的抗體較易穿透經(jīng)處理的細(xì)胞膜，可用于細(xì)胞內(nèi)抗原的定