第9章 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第9章酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)Enzyme

化學(xué)反應(yīng)的兩個(gè)基本問(wèn)題：反應(yīng)進(jìn)行的方向、可能性和限度反應(yīng)進(jìn)行的速率和反應(yīng)機(jī)制一、化學(xué)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)熱力學(xué)化學(xué)動(dòng)力學(xué)（一）反應(yīng)速率及其測(cè)定——以單位時(shí)間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變來(lái)表示。（二）反應(yīng)分子數(shù)和反應(yīng)級(jí)數(shù)1.反應(yīng)分子數(shù)：——反應(yīng)中真正相互作用的分子的數(shù)目單分子反應(yīng)：AP雙分子反應(yīng)：A+BP+Q單分子反應(yīng)v=kc雙分子反應(yīng)v=kc1c2c、c1、c2：反應(yīng)物濃度（mol/l）

k：比例常數(shù)/反應(yīng)速率常數(shù)2.反應(yīng)級(jí)數(shù)能以v=kc表示，為一級(jí)反應(yīng)；能以v=kc1c2表示，則為二級(jí)反應(yīng)；v與反應(yīng)物濃度無(wú)關(guān)，則為零級(jí)反應(yīng)。雙分子反應(yīng)、一級(jí)反應(yīng)（三）各級(jí)反應(yīng)的特征

1.一級(jí)反應(yīng)：

反應(yīng)速率與反應(yīng)物濃度的一次方成正比。v=kcC0C0/20t?[P]Ct反應(yīng)物的消耗產(chǎn)物的增加半衰期t1/2：有一半反應(yīng)物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的時(shí)間lnC0lnC0/20t?Ctk當(dāng)t=t?時(shí)，c=1/2c0,則t?＝0.693／k,即半衰期與反應(yīng)物的初濃度無(wú)關(guān)。2.二級(jí)反應(yīng)：v=k（a-x）（b–x）a、b：反應(yīng)物A、B的初濃度

x：t時(shí)已發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)濃度

（a-x）、（b–x）：t時(shí)后A、B的濃度3.零級(jí)反應(yīng)：v=k一級(jí)反應(yīng)：半衰期與反應(yīng)物的初濃度無(wú)關(guān)二級(jí)反應(yīng)：半衰期與反應(yīng)物的初濃度成反比零級(jí)反應(yīng)：半衰期與反應(yīng)物的初濃度成正比單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)；酶促反應(yīng)速度一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下，用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來(lái)表示；反應(yīng)速度取其初速度，即底物的消耗量很?。ㄒ话阍?﹪以?xún)?nèi)）時(shí)的反應(yīng)速度；底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度。（[S]》[E]）研究前提二、底物濃度對(duì)酶反應(yīng)速率的影響產(chǎn)物0時(shí)間初速度酶促反應(yīng)速度逐漸降低酶促反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)展曲線(xiàn)在其他因素不變的情況下，底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響呈矩形雙曲線(xiàn)關(guān)系。反應(yīng)初速度隨底物濃度變化曲線(xiàn)當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)。[S]VVmax隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級(jí)反應(yīng)。[S]VVmax當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)[S]VVmaxE+SESP+Ek1k2k3（一）中間絡(luò)合物學(xué)說(shuō)

k4三個(gè)假設(shè)：（1）E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速度取決于慢反應(yīng)即

V＝k3[ES]。（2）S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認(rèn)為不變即[S]＝[St]。（3）P→0忽略這步反應(yīng)（二）酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式1、米氏方程的推導(dǎo)1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡(jiǎn)稱(chēng)米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物濃度V：不同[S]時(shí)的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(shù)(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]Km+[S]＝──穩(wěn)態(tài)時(shí)ES濃度不變

反應(yīng)速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的質(zhì)量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3(Ⅲ)(Ⅰ)(Ⅱ)穩(wěn)態(tài)時(shí)ES濃度不變反應(yīng)速度

V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的質(zhì)量平衡方程

[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3V=V[S]Km+[S]米氏方程V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et]Km=

k2+k3k1米氏常數(shù)

a.當(dāng)[S]很小時(shí)V=V[S]/Km一級(jí)反應(yīng)反應(yīng)初速度隨底物濃度變化曲線(xiàn)米氏曲線(xiàn)V=V[S]Km+[S]b.當(dāng)[S]很大時(shí)V=V[S]/[S]=V

0

級(jí)反應(yīng)混合級(jí)Km=?Km=[S]V=V[S]Km+[S]若V＝V/2V2＝V[S]Km+[S]1Km+[S]=2[S]2、動(dòng)力學(xué)參數(shù)的意義（1）米氏常數(shù)Km的意義Km＝[S]∴Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2

①Km是酶的特性常數(shù)：

與pH、溫度、離子強(qiáng)度、酶及底物種類(lèi)有關(guān)，與酶濃度無(wú)關(guān)，可以鑒定酶。酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脫氫酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0②可以判斷酶的專(zhuān)一性和天然底物Km值最小的底物——最適底物/天然底物1/Km近似表示酶對(duì)底物的親和力：1/Km越大、親和力越大Km=

k2+k3k1Km≈k2（分離能力）/k1（親合能力）E+SESP+Ek1k2k3Km越小，親和力越強(qiáng)。[S]很小時(shí)，反應(yīng)速度就能達(dá)到很大。性能優(yōu)，代謝中這類(lèi)酶更為重要k2>>k3時(shí)④Km可幫助判斷某代謝反應(yīng)的方向和途徑催化可逆反應(yīng)的酶對(duì)正/逆兩向底物Km不同——Km較小者為主要底物③根據(jù)Km：判斷某[s]時(shí)v與Vmax的關(guān)系判斷抑制劑的類(lèi)型乳酸脫氫酶（1.7×10-5）丙酮酸脫氫酶（1.3×10-3）丙酮酸脫羧酶（1.0×10-3）丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛丙酮酸濃度較低時(shí)：代謝哪條途徑?jīng)Q定于Km最小的酶一底物多酶反應(yīng)（2）Vmax和k3（kcat)的意義一定酶濃度下，酶對(duì)特定底物的Vmax也是一個(gè)常數(shù)。[S]很大時(shí)，Vmax＝k3[E]。k3表示當(dāng)酶被底物飽和時(shí)，每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，——又稱(chēng)為轉(zhuǎn)換數(shù)、催化常數(shù)kcatkcat越大，酶的催化效率越高（3）kcat/km的意義：V=Vmax[S]Km+[S]∵Vmax=kcat[Et]∴V=kcat[Et][S]Km+[S]當(dāng)[S]<<Km時(shí)，[E]＝[Et]是E和S反應(yīng)形成產(chǎn)物的表觀(guān)二級(jí)速率常數(shù)。其大小可用于比較酶的催化效率。kcat/km＝

kcat/km的上限為k1,即生成ES的速率，即酶的催化效率不超過(guò)E和S形成ES的結(jié)合速率kcat/km的大小可以比較不同酶或同一種酶催化不同底物的催化效率。（1）Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法3、Km與V的求取蔗糖酶米氏常數(shù)（Km）的測(cè)定1.配12支蔗糖底物溶液，濃度分別為0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保溫；2.加入3U/ml已在35℃水浴保溫的酶溶液，準(zhǔn)確作用5分鐘，終止反應(yīng)；3.各吸取0.5ml反應(yīng)液與3，5-二硝基水楊酸，沸水浴5分鐘，冷卻后在540nm測(cè)定吸光度OD值；4.作圖

（2）Eadie-Hofstee作圖法vV[S]Vmax斜率－Km

（3）Hanes-Woolf作圖法

斜率=1/VmKm/Vm-Km[S]/V[S]vVmax[S]－3Km－2Km－Km（4）Eisenthal和Cornish-Bowden線(xiàn)性作圖法（三）多底物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分為單底物、雙底物和三底物反應(yīng)1.酶促反應(yīng)按底物分子數(shù)分類(lèi)：①有序反應(yīng)（orderedreactions）領(lǐng)先底物釋放釋放A和Q競(jìng)爭(zhēng)地與自由酶結(jié)合（1）序列反應(yīng)或單－置換反應(yīng)2.多底物反應(yīng)按動(dòng)力學(xué)機(jī)制分類(lèi)：②隨機(jī)反應(yīng)（randomreactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反應(yīng)AAEPE’PEE’QEQEBB

A和Q競(jìng)爭(zhēng)自由酶E形式B和P競(jìng)爭(zhēng)修飾酶形式E’A和Q不同E’結(jié)合B和P也不與E結(jié)合。(2)乒乓反應(yīng)或雙－置換反應(yīng)3.雙底物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程（1）序列機(jī)制的底物動(dòng)力學(xué)方程及動(dòng)力學(xué)圖——在B的濃度達(dá)到飽和時(shí)A的米氏常數(shù)——在A(yíng)的濃度達(dá)到飽和時(shí)B的米氏常數(shù)——底物A與酶結(jié)合的解離常數(shù)——底物A、B都達(dá)到飽和時(shí)最大反應(yīng)速率（2）乒乓機(jī)制的底物動(dòng)力學(xué)方程及動(dòng)力學(xué)圖——在B的濃度達(dá)到飽和時(shí)A的米氏常數(shù)——在A(yíng)的濃度達(dá)到飽和時(shí)B的米氏常數(shù)——底物A、B都達(dá)到飽和時(shí)最大反應(yīng)速率

三、酶的抑制作用失活作用：使酶Pr變性而引起酶活力喪失。抑制作用：使酶活力下降但不引起變性。抑制劑：能引起抑制作用的物質(zhì)。（一）抑制程度的表示方法V0：Vi：不加入抑制劑時(shí)的反應(yīng)速率加入抑制劑后的反應(yīng)速率以反應(yīng)速率的變化表示1.相對(duì)活力分?jǐn)?shù)（殘余活力分?jǐn)?shù)）2.相對(duì)活力百分?jǐn)?shù)（殘余活力百分?jǐn)?shù)）V0ViViV03.抑制分?jǐn)?shù)——指被抑制而失去活力的分?jǐn)?shù)V0Vi4.抑制百分?jǐn)?shù)ViV0

抑制率依據(jù)：

能否用透析、超濾等物理方法

除去抑制劑，使酶復(fù)活。不可逆抑制與可逆抑制（二）抑制作用的分類(lèi)1、不可逆抑制作用：抑制劑與酶必需基團(tuán)以牢固的共價(jià)鍵相連很多為劇毒物質(zhì)重金屬、有機(jī)磷、有機(jī)汞、有機(jī)砷、氰化物、青霉素、毒鼠強(qiáng)等。不可逆抑制不可逆抑制劑非專(zhuān)一性不可逆抑制劑（作用于一/幾類(lèi)基團(tuán)）專(zhuān)一性不可逆抑制劑（作用于某一種酶的活性部位基團(tuán)）2、不可逆抑制劑不可逆抑制

（1）非專(zhuān)一性不可逆抑制劑①重金屬離子

Ag+、

Cu2+、

Hg2+、

Pb2+、

Fe3+高濃度時(shí)可使酶蛋白變性失活；低濃度時(shí)對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制。

——通過(guò)加入EDTA解除

H2N-CH-COOH

CH2

SH

H2N-CH-COOH

CH2

S-CH2COOHICH2COOHHI②烷化劑（多為鹵素化合物）++碘乙酸③有機(jī)磷化合物（敵百蟲(chóng)、沙林）膽堿酯酶OHPOC2H5OC2H5S有機(jī)磷農(nóng)藥部分膽堿乙?；改憠A酯酶膽堿乙酰膽堿積累導(dǎo)致神經(jīng)中毒癥狀如何緊急救治？排毒洗胃、喝雞蛋清牛奶導(dǎo)泄、利尿血液透析（清除游離狀態(tài)毒物）解毒藥：解磷定ROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有機(jī)磷化合物羥基酶磷?；?失活)酸ROOROO—EP+-CHNOH磷酰化酶(失活)N+CH3-CHNN+CH3OOROOR+E—OH

P解磷定解毒------解磷定(PAM)：④有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物——與酶分子中-SH作用；

可通過(guò)加入過(guò)量巰基化合物解除。⑤氰化物、硫化物和CO

——與酶中金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物如氰化物與含鐵卟啉細(xì)胞色素氧化酶結(jié)合⑥青霉素（penicillin）與細(xì)菌糖肽轉(zhuǎn)肽酶Ser-OH活性，影響細(xì)胞壁合成。（2）專(zhuān)一性不可逆抑制劑

①Ks型具有底物類(lèi)似的結(jié)構(gòu)——（設(shè)計(jì)）帶有一活潑基團(tuán)：與必需基團(tuán)反應(yīng)（抑制）

∵利用對(duì)酶親合性進(jìn)行修飾∴親合標(biāo)記試劑（affinitylabelingreagent）②Kcat型具有底物類(lèi)似的結(jié)構(gòu)本身是酶的底物還有一潛伏的反應(yīng)基團(tuán)“自殺性底物”

抑制作用可通過(guò)透析等方法除去。原因：非共價(jià)鍵結(jié)合可