分子熒光的機理和熒光探針原理

1.3熒光分子探針識別機理1.3.1光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移[4,12](PhotoinducedElectronTransfer,PET)典型的PET體系是由包含電子給體的識別基團部分 R(reseptor),通過一間隔基S(space)和熒光團F(fluorophore)相連而構(gòu)建。其中熒光團部分是光能吸收和熒光發(fā)射的場所，識別基團部分則用于結(jié)合客體， 這兩部分被間隔基隔開， 又靠間隔基相連而成一個分子，構(gòu)成了一個在選擇性識別客體的同時又給出光信號變化的超分子體系。 PET熒光探針中，熒光團與識別基團之間存在著光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移， 對熒光有非常強的淬滅作用， 因此在未結(jié)合客體之前，探針分子不發(fā)射熒光，或熒光很弱，一旦識別基團與客體相結(jié)合，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用受到抑制，甚至被完全阻斷，熒光團就會發(fā)射出強烈熒光(圖 1-1)。PET熒光探針作用機制可由前線軌道理論來說明(圖1-2)。由于與客體結(jié)合前后，熒光強度差別非常大，呈明顯的“關(guān)”、“開”狀態(tài)，因此這類探針又被稱做熒光分子開關(guān)。tin.圖1-1PET熒光探針的一般原理圖LUMO〕.LTMOLIIMOX卜111/HOMO一HOMOirFluoruphure Freerecepter FLuorophoiTboundreceptor圖1-2PET熒光探針的前線軌道原理圖已報道的PET熒光分子探針中，多數(shù)都是以脂肪氨基或氮雜冠醚作為識別基團。 deSilva研究小組利用多種熒光團設(shè)計了大量該類 PET探針用于氫質(zhì)子、堿金屬陽離子識別?；衔?是一個簡單的PET熒光分子探針，在甲醇中和 K+絡(luò)合后，熒光量子產(chǎn)率從 0.003增加至0.14。錢旭紅等設(shè)計的 PET熒光探針(化合物 2)，對氫質(zhì)子有很好的識別作用，已被MolecularProbe公司推廣為細(xì)胞內(nèi)酸性內(nèi)酯質(zhì)探針。 deSilva研究小組利用類似于EDTA

結(jié)構(gòu)的氨羧酸基團設(shè)計的化合物3是螯合型PET熒光分子探針，識別基羧酸基團形成一個小的空穴，可以有效螯合堿土金屬 Ca2+和Mg2+。22大多數(shù)PET熒光分子探針的設(shè)計是基于受體與客體結(jié)合，使光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用受到抑制，熒光團發(fā)射出強烈熒光的原理，但是當(dāng)與過渡金屬作用時，結(jié)果有時會發(fā)生變化。由于過渡金屬3d電子的氧化還原行為，可以發(fā)生從熒光團到鍵合過渡金屬的電子轉(zhuǎn)移，或者從過渡金屬到熒光團的電子轉(zhuǎn)移，因此可以通過無輻射能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光淬滅。化合物4受體冠醚為硫雜冠醚，眾所周知，硫雜冠醚與 Cu2+有強的親和能力，該分子設(shè)計也是基于PET過程，但不同的是，與Cu2+鍵合后產(chǎn)生了從熒光團到金屬離子的 PET過程，導(dǎo)致熒光淬滅。1.3.2分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecularChargeTransfer,ICT)典型的ICT熒光分子探針是熒光團上分別連接強推電子基和吸電子基，是一個強推 -拉電子體系，推電子基和吸電子基、熒光團共軛相連，在光激發(fā)下會產(chǎn)生從電子給體向電子受體的電荷轉(zhuǎn)移。ICT熒光探針的識別基團往往是推-拉電子體系整體中的一部分， 當(dāng)識別基團與客體結(jié)合時，會對熒光團的推-拉電子作用產(chǎn)生影響，減弱或是強化分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移，從1-3)。而導(dǎo)致熒光光譜的變化，如光譜發(fā)生藍(lán)移，或是紅移(圖1-3)。????OfiA\blueditft| redsiiifiPHI3分子內(nèi)共勉電曲轉(zhuǎn)移厲理、』NI7fl、』NI7fl化合物5為典型的ICT熒光探針，氮雜冠醚既是識別基團，同時也是推 -拉電子體系的電子給體。當(dāng)冠醚與堿土金屬離子如 Ca2+絡(luò)合時，由于金屬離子的拉電子效應(yīng)，降低了冠醚氮原子的供電子能力，因此發(fā)生熒光藍(lán)移，且熒光增強。識別基團6為電子受體的典型ICT熒光探針化合物6,二甲氨基為推電子基，當(dāng)識別基團與堿土金屬 Ca2+結(jié)合后，拉電子能力增強，發(fā)生熒光紅移。化合物 7為螯合型的ICT熒光分子探針，可以選擇性地與 Mg2+絡(luò)合。多數(shù)ICT熒光探針在結(jié)合客體后，光譜都有明顯移動，但熒光強度變化不明顯。然而化合物8是一個例外，與Li+絡(luò)合后熒光增強90倍，與Mg2+絡(luò)合增加2250倍。1.3.3激發(fā)單體-激基締合物（Monomer-Excimer）當(dāng)兩個相同的熒光團，如多環(huán)芳烴萘、蒽和芘等連接到一個受體分子的合適位置時， 其中一個被激發(fā)的熒光團（單體）會和另一個處于基態(tài)的熒光團形成分子內(nèi)激基締合物。 它的發(fā)射光譜不同于單體的發(fā)射光譜，表現(xiàn)為一個新的、強而寬、長波、無精細(xì)結(jié)構(gòu)的發(fā)射峰。由于形成這種激基締合物需要激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子達到“碰撞”距離（約 35納米），因此熒光團間的距離是激基締合物形成和破壞的關(guān)鍵。所以用各種分子間作用力改變兩個熒光此熒光團間的距離是激基締合物形成和破壞的關(guān)鍵。所以用各種分子間作用力改變兩個熒光萘、團間的距離，用結(jié)合客體前后單體/激基締合物的熒光光譜變化表達客體被識別的信息。萘、蔥、芘等熒光團由于具有較長的激發(fā)單線態(tài)壽命， 易形成激基締合物，常常被用于此類探針中?；衔?通過乙二胺連結(jié)兩個萘分子， Hg2+的加入導(dǎo)致激基締合物熒光增強；化合物10具有雙芘熒光發(fā)色團，能以不同的方式選擇性響應(yīng) Cu2+和Hg2+；化合物11是兩個萘熒光團通過聚醚鏈連接的熒光化合物，堿土金屬離子 Ca2+、Ba2+可以與氧乙烯鏈上的多個氧原子以及酯鍵上的氧原子絡(luò)合， 造成鏈的收縮，使兩個萘環(huán)得以靠近，促進激基締合物的形成，使萘單體發(fā)射熒光強度減弱。他 1他 1■1.3.4熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FluoresceneeResonanceEnergyTransfer,FRET)當(dāng)能量給體熒光團（D）與能量受體熒光團（A）相隔的距離遠(yuǎn)大于D-A的碰撞直徑時，只要D與A的基態(tài)和第一激發(fā)態(tài)兩者的能級間能量差相當(dāng)， 或者說D的發(fā)射光譜與A的吸收光譜能有效重疊，就可能發(fā)生從D到A的非輻射能量轉(zhuǎn)移。實際上D-A發(fā)生能量轉(zhuǎn)移兩者除了光譜重疊外，還必須以適當(dāng)?shù)呐帕蟹绞剑?A可以是熒光團，也可以是熒光淬滅團。前一種情形，激發(fā)D時，由于能量轉(zhuǎn)移，將觀察到 A的熒光發(fā)射；而后一種情形，則只能觀察到D的熒光變化，多用于核酸的檢測。ETETPETPET淬滅蔥的熒光，在化合物12中有兩個不同的熒光團，分子中12脂肪叔胺能夠通過酸性條件下，該PET過程被禁阻，但蔥被激發(fā)后并不發(fā)射熒光，而是將能量轉(zhuǎn)移給查耳酮使其發(fā)射熒光。1.3.5基于其他原理的熒光分子探針大多數(shù)陽離子熒光分子探針是基于上述原理設(shè)計的， 還有少量探針是按照其它原理設(shè)計的，也許有些是意外所得，但常常有出奇制勝的效果。13 14MH13 14MH化合物13的乙腈溶液中加入汞離子后熒光顯著增強（34倍）并紅移，進一步用質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)生成了脫硫產(chǎn)物14。化合物13是對汞離子有選擇性的化學(xué)反應(yīng)熒光探針，這類不可逆的化學(xué)計量性識別分子也被稱為化學(xué)計量劑。15 16 17化合物15在pH=4.75的緩