第二章 基因工程的操作過程

第二章基因工程的操作過程C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）B重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)、增）ADNA的體外重組（切、接）基因工程的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢ADNA的體外重組（切與連）同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接不同粘性末端的連接粘性末端的更換人工粘性末端的連接重組率同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'

5'

GCTTAA

5'5'

AATTCG5'

退火GCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGGCTTAAAATTCG5'

GCTTAA

5'

AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'

5'GAATTCCTTAAG同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

TACTAG

5'5'

GATCAT5'

退火GCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT5'

TGATCAACTAGT5'

BcfIGCCTAGGATCCG5'

TACTAG

5'

GATCATTGATCCACTAGG5'

5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的連接BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'

5'

CTGCAG5'

GACGTC3'

T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC5'

CTGCAGGACGTC5'

PstI3'

T4-DNApol切平5'

CG5'

GCKlenow補平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGGCGATCCGCTAGG5'

5'GGATCGCCTAGC人工粘性末端的連接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'

5'

GCTTAA5'5'5'

AATTCGT4-DNAligase5'

5'Klenow補平Klenow補平5'GGATCCCTAGGATCC5'

CTAGG5'

GAATTCTTAA5'5'5'

AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'

5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火B(yǎng)amHIBamHIEcoRIBamHI人工粘性末端的連接3‘突出末端CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI人工粘性末端的連接平頭末端C3'

GG5'

G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火C3'

TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA

3'

GG3'

AAAAAAAAAAC5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'

5'

5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加熱GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT粘性末端的更換BamHI5'

5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow補平GATCC5'

G5'GCCTAG5'5'

5'GGATCCCTAG5'

GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'

5'EcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker重組率重組率的定義重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)在常規(guī)實驗條件下，重組率一般為25%-75%重組率是衡量連接反應效率的重要指標，較高的重組率可以大大簡化DNA重組的后續(xù)操作。重組率提高重組率的方法提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團：

5'

5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'

p5'

GCTTAAOH

5'5'

AATTCG5'

HO退火5'

G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO堿性磷酸單酯酶堿性磷酸單酯酶重組率提高重組率的方法加裝同聚尾末端：

CTGCA3'

GG3'

ACGTC5'

GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火C3'

CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG

3'

GG3'

GGGGGGACGTC5'

5'GCATGCCCCCC

GCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'

5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowB重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴增（轉(zhuǎn)與增）4基因工程的操作過程轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化細胞的擴增轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化Ca2+誘導的完整細胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細胞膜出現(xiàn)空隙，細菌細胞此時的狀態(tài)叫做感受態(tài)

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備：挑取單菌落接種LB培養(yǎng)基中，37℃快速振蕩過夜。用1/10體積冰冷的100mM

CaCl2溶液懸浮菌體，離心。用1/100體積冰冷的100mM

CaCl2溶液懸浮菌體。用1/10體積冰冷的100mM

CaCl2溶液懸浮菌體，冰浴放置3-24小時，即為感受態(tài)細胞。離心收集菌體收集菌體。按1%接種量接種新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃快速振蕩培養(yǎng)3h。此時，培養(yǎng)物OD600=0.5。轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)Ca2+誘導的完整細菌細胞的轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取100ml感受態(tài)細胞，加入相當于50ng載體的重組冰浴放置半小時在42℃保溫90秒（熱脈沖）快速將轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置2分鐘DNA連接液，混勻（體積不超過5μL）加入400μL新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)靜止培養(yǎng)15min，振蕩培養(yǎng)45min（擴增）涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進行篩選

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性細菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細胞壁，因而這類細菌通常采用原生質(zhì)體（細胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子

酵母菌、霉菌、植物細胞也可用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化不同細菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細菌需生長在含有溶菌酶的高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細菌細胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應保持無水無去污劑細菌原生質(zhì)體的制備：轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個原生質(zhì)體），加入10-20mlDNA重組連接液，同時加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻細菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：細菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細菌重新長出細胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素

10×Spizizensalts母液：15%K2HPO4.3H2O，6%KH2PO4，2%(NH4)2SO4，0.2%MgSO4，1%檸檬酸鈉，溶于蒸餾水中。GMI：1mL10×Spizizensalts，0.1mL10%酵母粉，0.25mL20%葡萄糖，0.2mL1%水解酪蛋白，0.2mL0.25%所需氨基酸，補充滅菌蒸餾水至總體積10mL。GMII：1mL10×Spizizensalts，0.05mL10%酵母粉，0.25mL20%葡萄糖，0.04mL1%水解酪蛋白，0.2mL0.25%所需氨基酸，0.05mL0.1mol/LCaCl2，1mL25mmol/LMgCl2，補充滅菌蒸餾水至總體積10mL。

枯草芽孢桿菌化學轉(zhuǎn)化挑取一新鮮培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌單菌落接種于2.5mLGMI培養(yǎng)基中，30℃慢搖振蕩培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)物按10%接種量接種于2.5mL新鮮的GMI中，37℃快搖振蕩培養(yǎng)3.5h；再將培養(yǎng)物進行第二次傳代，接種于5mLGMII培養(yǎng)基中，突變型菌株以10%接種量進行第二次傳代，野生型菌株按5%接種量進行第二次傳代，37℃快速振蕩培養(yǎng)90min；取1mL培養(yǎng)物，5000r/min室溫離心5min，用1/10體積上清液重新懸浮細菌沉淀，即為枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞?？莶菅挎邨U菌感受態(tài)制備挑取一新鮮培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌單菌落接種于2.5mLGMI培養(yǎng)基中，30℃慢搖振蕩培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)物按10%接種量接種于2.5mL新鮮的GMI中，37℃快搖振蕩培養(yǎng)3.5h；再將培養(yǎng)物進行第二次傳代，接種于5mLGMII培養(yǎng)基中，突變型菌株以10%接種量進行第二次傳代，野生型菌株按5%接種量進行第二次傳代，37℃快速振蕩培養(yǎng)90min；取1mL培養(yǎng)物，5000r/min室溫離心5min，用1/10體積上清液重新懸浮細菌沉淀，即為枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞?？莶菅挎邨U菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化取質(zhì)粒加至感受態(tài)細胞懸液中，至終濃度1μg/mL，質(zhì)粒體積不超過感受態(tài)細胞懸液體積的1/20，混勻。37℃水浴中靜置30～60min，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)2～4h，涂合適的培養(yǎng)基上進行篩選，每100μL轉(zhuǎn)化體系涂一個平板。在本轉(zhuǎn)化方法中，枯草芽孢桿菌感受態(tài)形成的原理可能是：處于增殖分裂旺盛期的枯草芽孢桿菌突然轉(zhuǎn)入營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中，由于營養(yǎng)限制，饑餓誘導枯草芽孢桿菌細胞內(nèi)發(fā)生一系列生理變化，細胞壁和細胞膜形成缺陷，細胞通透性增加，利于外源DNA的進入，同時在鈣離子和鎂離子充分作用下，提高了其感受態(tài)形成率；在鈣離子作用下，轉(zhuǎn)化體系中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物，黏附于細胞表面，提高了外源DNA的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)l噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細胞的培養(yǎng)：

將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30℃保溫10分鐘轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2小時，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)電穿孔轉(zhuǎn)化將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進入細胞內(nèi)電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻毎诮Y(jié)構(gòu)的受體細胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大

接種B.subtilis于3mlLB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。取2.6ml過夜培養(yǎng)物接入40ml（LB+0.5M山梨醇）中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600=0.85~0.95。將菌液冰水浴10min，然后5000g，5min，4℃離心收集菌體。用50ml預冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹懸菌體，5000g，5min，4℃離心去上清，如此漂洗4次。將洗滌后的菌體吹懸于1ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中，EP管分裝。每60μl感受態(tài)細胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入預冷的電轉(zhuǎn)杯（1mm）中，電擊一次。電轉(zhuǎn)儀設置：脈沖電壓2.0kv,脈沖時間4.5~5.0ms,電擊1次電擊完畢取出杯子并立即加入1mlRM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃，200rpm振蕩復蘇3h后，涂板。37℃，過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進入受體細胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實驗規(guī)模下，每個受體細胞最多只能接受一個載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細胞接納DNA的個數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時，未接納載體或重組子的受體細胞不長）轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的用途利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設計DNA重組實驗規(guī)模例如，某一DNA重組實驗的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體，

經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個重組克隆，需投入多少載體DNA進行重組實驗？若重組率為100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生104個重組克隆需要：

104/107

X10-2=0.1mg載體DNA

考慮到實驗系統(tǒng)的重組率為20%，所以實際投入載體應為：

0.1/20%=0.5

mg載體DNA

載體投入量確定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算出（5mg）。轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素載體及DNA重組分子方面：

載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細胞，其轉(zhuǎn)化率不同載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個數(shù)量級插入片段的大?。簩|(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素受體細胞方面：

受體細胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素轉(zhuǎn)化方法方面：

受體細胞的預處理：影響最大供受體的比例：Ca2+誘導轉(zhuǎn)化0.1ml感受態(tài)細胞50ngDNA

轉(zhuǎn)化方法：Ca2+誘導轉(zhuǎn)化106-107/mgDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化109

個原生質(zhì)體 50ngDNA

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-106/mgDNA

l-DNA轉(zhuǎn)染107-108/mgDNA

電穿孔轉(zhuǎn)化106-109/mgDNA

轉(zhuǎn)化細胞的擴增擴增操作轉(zhuǎn)化細胞的擴增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細胞的短時間培養(yǎng)。在實驗時，擴增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如：

Ca2+誘導轉(zhuǎn)化后的37℃培養(yǎng)一個小時原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后的再生過程

l噬菌體轉(zhuǎn)染后的30℃培養(yǎng)等，均屬擴增操作轉(zhuǎn)化細胞的擴增擴增操作的目的增殖轉(zhuǎn)化細胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細胞用于篩選程序擴增和表達載體分子上的標記基因，便于篩選表達外源基因，便于篩選和鑒定C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）4基因工程的操作過程載體遺傳標記檢測克隆DNA序列檢測外源基因產(chǎn)物檢測C轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）4基因工程的操作過程由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子轉(zhuǎn)化子重組子目的重組子載體遺傳標記檢測抗藥性篩選法ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIApr抗藥性篩選法的基本原理：

pBR3224363bpori抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子將外源DNA片段插在EcoRI位點：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcr將外源DNA片段插在BamHI位點：非重組子呈Apr、Tcr重組子呈Apr、Tcs載體遺傳標記檢測抗藥性篩選法抗藥性篩選法的基本操作：

先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上

在Ap平板上生長、但在Ap和Tc平板上不長的轉(zhuǎn)化子即為

ApAp+Tc影印挑選重組子

載體遺傳標記檢測營養(yǎng)缺陷型篩選法營養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：

營養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營養(yǎng)組份的合成基因，而受體細胞本身不能合成這一營養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細胞涂布在不含此營養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長出的便是轉(zhuǎn)化子

載體遺傳標記檢測營養(yǎng)缺陷型篩選法常見的營養(yǎng)缺陷型篩選標記：

用于大腸桿菌的營養(yǎng)標記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+載體遺傳標記檢測顯色篩選法顯色篩選法的基本原理：

顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應）等載體遺傳標記檢測顯色篩選法顯色篩選法的基本操作：

pUC18AprlacZ'oriAp+X-gal重組子（Apr+lacZ-）

將外源基因克隆在pUC18的lacZ’標記基因內(nèi)部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，白色菌落