毒理學(xué)基礎(chǔ)第6章(2)蓄積毒作用

第三節(jié)短期、亞慢性和慢性毒性作用急性毒性試驗(yàn)的局限性：

1.外源性化學(xué)物在長(zhǎng)期重復(fù)染毒時(shí)可產(chǎn)生與急性毒性試驗(yàn)完全不同的毒作用。如：苯2.動(dòng)物的衰老可影響毒作用的性質(zhì)和程度3.許多重要疾病均與年齡增長(zhǎng)有關(guān)一、概述分類(lèi)

1.重復(fù)劑量毒性作用（短期）2.亞慢性毒性作用3.慢性毒性作用（一）蓄積作用1、蓄積作用(accumulation)：當(dāng)化學(xué)物與機(jī)體發(fā)生亞慢性接觸,將反復(fù)進(jìn)入機(jī)體,而且當(dāng)進(jìn)入的速度或總量超過(guò)代謝轉(zhuǎn)化排出的速度或總量時(shí),化學(xué)物質(zhì)就有可能在體內(nèi)逐漸增加并貯留,這種現(xiàn)象稱(chēng)為化學(xué)物質(zhì)的蓄積作用。

2.儲(chǔ)存庫(kù)（depot）：

化學(xué)毒物容易蓄積的組織和器官稱(chēng)為儲(chǔ)存庫(kù)。機(jī)體常見(jiàn)的儲(chǔ)存庫(kù)有血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼等。如骨骼為鉛的儲(chǔ)存庫(kù)。

蓄積形式:原形代謝產(chǎn)物與機(jī)體某些物質(zhì)結(jié)合的形式3.蓄積的分類(lèi)：物質(zhì)蓄積功能蓄積(損傷蓄積）3.1物質(zhì)蓄積（materialaccumulation）：

化學(xué)毒物反復(fù)多次染毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，用化學(xué)分析方法能測(cè)得機(jī)體內(nèi)或某些器官組織內(nèi)存在該化合物的原型或其代謝產(chǎn)物。3.2功能蓄積（functionalaccumulation）：

化學(xué)毒物反復(fù)多次染毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，機(jī)體內(nèi)雖不能檢出化學(xué)毒物，然而機(jī)體可以出現(xiàn)慢性中毒現(xiàn)象。注：功能蓄積是損害效應(yīng)累計(jì)的結(jié)果。也可能是由于存留的化學(xué)毒物或代謝物數(shù)量極微，目前技術(shù)方法尚不能檢出的一種物質(zhì)蓄積，或者物質(zhì)蓄積與功能蓄積兼而有之（二）蓄積作用的毒理學(xué)意義1.蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)2.一種外源化學(xué)物有無(wú)蓄積作用是評(píng)定該化學(xué)物是否可能引起潛在慢性中毒的論據(jù)之一3.是制定衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)安全系數(shù)的一種依據(jù)。蓄積毒性試驗(yàn)?zāi)康?、求出外源化學(xué)物的蓄積系數(shù)，了解蓄積毒性大?。?、為慢性毒性試驗(yàn)及其他有關(guān)毒性試驗(yàn)的劑量選擇提供參考。(三)、蓄積作用的研究方法蓄積作用的檢測(cè)有兩類(lèi)方法理化方法：應(yīng)用化學(xué)分析或其他技術(shù)測(cè)定化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體以后，在體內(nèi)含量變化的過(guò)程。該方法可確定化學(xué)物的半減期，故可作為檢測(cè)物質(zhì)蓄積的方法。生物學(xué)方法：即將多次染毒與一次染毒所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行比較，故所測(cè)出的蓄積性不能區(qū)分功能蓄積和物質(zhì)蓄積。1、蓄積系數(shù)法原理：在一定期限內(nèi)以低于致死劑量（小于LD50劑量），每日給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，直至出現(xiàn)預(yù)計(jì)的毒性效應(yīng)（或死亡）為止，計(jì)算達(dá)到預(yù)計(jì)效應(yīng)的總累積劑量，求出此累積劑量與一次接觸該化學(xué)物產(chǎn)生相同效應(yīng)的劑量的比值，此比值即為蓄積系數(shù)（K值）：在衛(wèi)生毒理學(xué)實(shí)際工作中，蓄積作用試驗(yàn)多用小鼠或大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一般以死亡為指標(biāo)，其K值計(jì)算公式如下：LD50（n）表示引起一半動(dòng)物死亡的累積總劑量LD50（1）表示引起一半動(dòng)物死亡的一次劑量意義：K值越小，表示化學(xué)物的蓄積毒性越大。K>1;K=1;K<1;K≥5——？雖然蓄積系數(shù)法具有一定使用價(jià)值，但是某些外源化學(xué)物的慢性中毒效應(yīng)，無(wú)法用K值表示。例如多數(shù)有機(jī)磷化合物是屬于輕度蓄積（K>5），但當(dāng)小劑量反復(fù)與機(jī)體接觸后，紅細(xì)胞與腦組織的乙酰膽堿酯酶可以持續(xù)降低，而且伴有一定程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥候。蓄積系數(shù)法由于分次染毒的設(shè)計(jì)不同，分為：（1）固定劑量法：先測(cè)出1次染毒的LD50(1)，然后每天給予1/10（1/20）LD50直到半數(shù)動(dòng)物死亡為止，此時(shí)總劑量即為L(zhǎng)D50（n）（2）劑量遞增法：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，按0.1LD50×4天，0.15LD50×4天，0.22LD50×4天，0.34LD50×4天,依次類(lèi)推，最長(zhǎng)28天，試驗(yàn)期間，當(dāng)化學(xué)物引起動(dòng)物累計(jì)死亡一半時(shí)間即可終止，計(jì)算K值。（3）劑量固定的20天蓄積法：實(shí)驗(yàn)分為5組，包括陰性對(duì)照組和1/20LD50，1/10LD50，1/5LD50，1/2LD50，每組動(dòng)物數(shù)10只，雌雄各半，每日染毒1次，連續(xù)20天，觀察每組動(dòng)物死亡數(shù)。劑量固定20天蓄積試驗(yàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)?各劑量組均無(wú)死亡，蓄積性不明顯?1/2LD50劑量組死亡，其他組無(wú)死亡，則弱蓄積性?1/20LD50劑量組無(wú)死亡，其他各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為中等蓄積性?1/20LD50劑量組有死亡，各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為強(qiáng)蓄積性2、生物半減期法

?生物半減期法是用毒物動(dòng)力學(xué)原理,闡明外源化學(xué)物在機(jī)體內(nèi)的蓄積作用特征

(二)短期重復(fù)劑量毒性、亞慢性和慢性毒性作用基本概念

1.短期重復(fù)劑量毒性

指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人連續(xù)接觸外源化學(xué)物14-30天所產(chǎn)生的中毒效應(yīng)。

2.亞慢性毒性（subchronictoxicity）：

是指人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物連續(xù)較長(zhǎng)期接觸某一外源化學(xué)毒物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。一般在相當(dāng)于1/10左右生命時(shí)間（壽命）內(nèi)

亞慢性毒性試驗(yàn)：指在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的1/10左右（如大鼠3個(gè)月）的生命時(shí)間內(nèi)，反復(fù)多次給予低劑量化學(xué)毒物，觀察試驗(yàn)動(dòng)物有無(wú)引起有害作用的試驗(yàn)過(guò)程。

3.慢性毒性（chronictoxicity）：

是指人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期（甚至終生）反復(fù)接觸低劑量的化學(xué)毒物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。一般2年

慢性毒性試驗(yàn)：在受試動(dòng)物生命的大部分或終生，連續(xù)長(zhǎng)期給予低劑量的受試物，觀察有無(wú)引起有害作用的試驗(yàn)過(guò)程。試驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.觀察長(zhǎng)期接觸受試物的毒性效應(yīng)譜、毒作用特點(diǎn)和靶器官；了解其毒性機(jī)制。

2.觀察受試物亞慢性毒性作用的可逆性

3.研究重復(fù)接觸受試物毒性作用的劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系，從初步了解到確定未觀察到有害作用的劑量（NOAEL）和觀察到有害作用的最小劑量（LOAEL），為制定人類(lèi)接觸的安全限量提供參考值4.確定不同動(dòng)物對(duì)受試物的毒效應(yīng)的差異，將研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。二、研究方法（一）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（亞慢性毒性試驗(yàn)）

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

（1）物種和品系

急性原則：

*盡量選擇急性毒性反應(yīng)與人近似的動(dòng)物；*易于飼養(yǎng)管理、試驗(yàn)操作方便的動(dòng)物；*繁殖生育能力較強(qiáng)，數(shù)量較大能夠保障供應(yīng)；*價(jià)格較低，易與獲得的動(dòng)物。亞慢性原則：*理論上，選取對(duì)化學(xué)毒物代謝過(guò)程、生理反應(yīng)和生化特性基本上與人接近，且在急性試驗(yàn)中證明是對(duì)化學(xué)毒物敏感的物種和品系常用大鼠犬豚鼠

（2）性別、年齡和數(shù)量

雌雄各半；剛斷乳的動(dòng)物：大鼠6－8周齡（80-100g），同組動(dòng)物體重不超過(guò)10%、組間平均體重不超過(guò)5%大鼠、小鼠每組不少于20只，犬、猴不少于6只，要求試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，活的動(dòng)物數(shù)能保證統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

亞慢性毒性試驗(yàn)

年齡：大鼠80~100g狗8~12月小鼠10~15g數(shù)量：小動(dòng)物≥20大動(dòng)物≥6性別：雌雄各半

慢性毒性試驗(yàn)?zāi)挲g：大鼠50~70g狗<8月小鼠初斷乳數(shù)量：小動(dòng)物≥40大動(dòng)物≥8性別：雌雄各半（3）微生物學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)等級(jí)和飼養(yǎng)環(huán)境應(yīng)選擇清潔級(jí)及以上等級(jí)動(dòng)物動(dòng)物室：清潔、溫度22oC±3，濕度30-70%，人工控制晝夜交替籠具：大小適中、動(dòng)物能自由活動(dòng)飼料：營(yíng)養(yǎng)合理飲用水：清潔、充足2染毒方式與期限

亞慢性染毒方式原則：1）盡量選用與人群實(shí)際接觸相同的途徑和方式食品、藥品、環(huán)境污染物2）并與預(yù)期進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)的接觸途徑一致。一般以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮膚三種途徑染毒，每日一次，連續(xù)給予染毒期限

取決于實(shí)驗(yàn)具體要求和所選擇的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

工業(yè)毒理學(xué)——3－6個(gè)月食品毒理學(xué)——6個(gè)月－1年環(huán)境毒理學(xué)——6個(gè)月－1年致癌試驗(yàn)——接近或等于動(dòng)物的預(yù)期壽命染毒注意的問(wèn)題：（1）小動(dòng)物：灌胃或喂飼法大動(dòng)物：膠囊法或灌胃法喂飼法注意：混合均勻受試物穩(wěn)定保證營(yíng)養(yǎng)受試物摻入量嚴(yán)格規(guī)定（2）呼吸道染毒

染毒時(shí)間：2-6h/d亞慢性：4小時(shí)慢性試驗(yàn)：間歇性：工業(yè)毒物6-8小時(shí)連續(xù)性：環(huán)境接觸22-24小時(shí)

（3）注射（4）最好結(jié)合毒物動(dòng)力學(xué)血藥濃度的監(jiān)測(cè)，以保持生物學(xué)效應(yīng)的每日相似性3劑量選擇和分組

（1）分組：

原則：一般設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)陰性（溶劑）對(duì)照組。

最高劑量組：要求出現(xiàn)明顯的中毒癥狀或某些觀察指標(biāo)發(fā)生明顯變化，但動(dòng)物不死亡，即使有死亡，不超過(guò)10%

最低劑量組：應(yīng)無(wú)中毒反應(yīng)或極輕微反應(yīng)（NOAEL)。

中劑量組相：相當(dāng)于觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)高、中、低劑量組距以3－10倍為宜，不少于2倍3劑量選擇和分組

（1）分組：

原則：一般設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)陰性（溶劑）對(duì)照組。

最高劑量組：要求出現(xiàn)明顯的中毒癥狀或某些觀察指標(biāo)發(fā)生明顯變化，但動(dòng)物不死亡，即使有死亡，不超過(guò)10%

最低劑量組：應(yīng)無(wú)中毒反應(yīng)或極輕微反應(yīng)（NOAEL)。

中劑量組相：相當(dāng)于觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)高、中、低劑量組距以3－10倍為宜，不少于2倍（2）劑量設(shè)計(jì)：

①以相同物種的短期毒性資料為依據(jù)。

亞慢性毒性試驗(yàn)可依據(jù)急性毒性的閾劑量或以1/20～1/5LD50確定；慢性毒性試驗(yàn)以亞慢性毒性試驗(yàn)效應(yīng)的最大耐受量（MTD）為最高劑量。

劑量選擇步驟：急性亞急性亞慢性慢性

②對(duì)于人群主動(dòng)攝入的食品和藥品，可采用人體可能接觸的最高劑量為劑量設(shè)計(jì)依據(jù)人臨床劑量的倍數(shù)大鼠：3個(gè)劑量組：1030100倍非嚙齒類(lèi)：3個(gè)劑量組：51550倍根據(jù)專(zhuān)業(yè)特殊性和管理部門(mén)有所區(qū)別亞慢性毒性的劑量選擇陰性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組（急性毒性的閾劑量1/20~1/5LD50）組距：3~10倍，最低不小于2倍慢性毒性的劑量選擇陰性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組亞慢性閾劑量或其1/5~1/2

1/10

LD50組距：2~5倍，最低不小于2倍（1）一般觀察1）進(jìn)食量、外觀體征、行為活動(dòng)綜合性指標(biāo)初步判斷作用部位、損害程度（1）一般觀察1）進(jìn)食量、外觀體征、行為活動(dòng)綜合性指標(biāo)初步判斷作用部位、損害程度2）動(dòng)物體重：

體重的增長(zhǎng)情況是綜合反映動(dòng)物健康狀況最基本的靈敏指標(biāo)之一，受食欲、消化功能、代謝和能量消化變化的影響。如發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體重增長(zhǎng)減慢，停止或減輕，在排除由于異味引起食欲不佳的前提下，可說(shuō)明化學(xué)毒物的毒性效應(yīng)。表示方法：（1）體重絕對(duì)增長(zhǎng)量