第十三 十八章食品中有害物質的檢測

第十三章食品中有害物質的檢測第一節(jié)概述第二節(jié)食品中藥物殘留及其檢測（食品中農(nóng)藥殘留及其檢測）第三節(jié)食品中生物毒素及其檢測（食品中霉菌毒素及其檢測）第四節(jié)食品中污染物的檢測（食品中其他有害物質及其檢測）重點農(nóng)藥測定預處理方法。有機氯、有機磷農(nóng)殘測定的主要方法。有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)殘的快速檢測法。黃曲霉毒素B1的測定方法。第一節(jié)概述一、有害物質與有毒物質的概念在自然界所有的物質中,當某物質或含有該物質的物料被按其原來的用途正常使用時,若因該物質而導致人體生理機能、自然環(huán)境或生態(tài)平衡遭受破壞時,則稱該物質為有害物質。WHO定義有毒物質:一般的定義為凡是以小劑量進入機體,通過化學或物理化學作用能夠導致健康受損的物質。有毒物質是相對的。

劑量決定食品中有害物質：在正常食用含有該物質的食品時會對人體的組織器官或生理機能或精神造成任何急性、亞急性、慢性或者致畸、致癌危害的物質。二、食品中有害物質的種類與來源食品中有害物質按性質分三大類：①是生物性有害物質,如黃曲霉、口蹄疫致病菌等；②是化學性有害物質,如DDT、氯丙醇、河豚毒素、重金屬等；③是物理性有害物質,如金屬屑、石子、動物排泄物、放射性元素等。

①內(nèi)源性危害：食品中天然存在的有毒有害成分，如河豚毒素、苦杏仁苷等；存在于食品中的生理作用成分，如蛋白酶抑制劑；食物中的營養(yǎng)不平衡。②外源性危害：食品中的微生物污染，如經(jīng)口傳染的病菌、細菌毒素、霉菌毒素；人為摻假，有意加入的食品添加劑，如亞硝酸鹽；意外或偶然進入食品的化學物質，如殘留農(nóng)藥、重金屬、多氯聯(lián)苯。

③誘發(fā)性危害：在食品加工、儲藏過程中誘發(fā)食品內(nèi)或生物體內(nèi)生成有害物質，如油脂氧化產(chǎn)生過氧化物、亞硝酸鹽與胺反應生成亞硝基化合物。食品危害的來源：三、加強食品中有害物質檢測的必要性我國目前最常見的食品質量問題？為什么要加強食品中有害物質的檢測？衛(wèi)生指標超標非法添加濫用食品添加劑包裝、標簽不規(guī)范虛假標簽、以次充好保證消費者健康企業(yè)改進工藝、控制質量進出口貿(mào)易、國家地位與信譽四、食品中有害物質常用的檢測方法薄層色譜法氣相色譜法高效液相色譜法色-質聯(lián)用酶聯(lián)免疫法第二節(jié)食品中農(nóng)藥殘留及其檢測殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、殺螨劑、植物生長調節(jié)劑、殺鼠藥…農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥施用后，殘存在生物體、農(nóng)副產(chǎn)品和環(huán)境中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝產(chǎn)物、降解物和雜質的總稱。殘留的數(shù)量叫殘留量。農(nóng)藥殘留是目前影響我國食品和農(nóng)產(chǎn)品安全的主要因素，已經(jīng)給我國農(nóng)產(chǎn)品銷售、出口和消費者的身體健康帶來了嚴重影響。對人體危害：通過食物和水的攝入、空氣吸入和皮膚接觸等途徑對人體造成多方面的危害，如急、慢性中毒和致癌、致畸、致突變作用等；對環(huán)境危害：污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡。污染食品：使一些食品殘留少量農(nóng)藥。食品中農(nóng)藥殘留的來源：1.施用農(nóng)藥對農(nóng)作物的直接污染2.農(nóng)作物從污染的環(huán)境中吸收農(nóng)藥3.通過食物鏈、生物富集污染食品4.其他來源的污染：事故性污染農(nóng)藥進入人體的方式土壤、水、空氣家禽、畜植物、飼料水生動、植物肉、蛋、乳人主要農(nóng)藥有機氯殺蟲劑有機磷殺蟲劑擬除蟲菊殺蟲劑氨基甲酸酯殺蟲劑1.有機氯農(nóng)藥（Organochlorinepesticides,OCPs）主要有六六六粉(六氯環(huán)己烷)、DDT(二氯二苯三氯乙烷)毒性特點：難分解、半衰期10年以上，高殘留；污染食品嚴重，脂溶性強，蓄積于脂肪和脂肪高的組織；中等毒性，致癌、致畸作用。性質：不溶于水，易溶于脂肪、丙酮、乙醇、石油醚、環(huán)己烷，對光、熱、酸穩(wěn)定，對堿不穩(wěn)定。有多種異構體較強殺蟲作用2.有機磷農(nóng)藥（OPPs）是含有C—P鍵或C—O—P、C—S—P、C—N—P鍵的有機化合物。應用廣。（1）分類：高毒有機磷（早期發(fā)展，現(xiàn)已被禁止使用）

如對硫磷（1605）、內(nèi)吸磷（1059）、甲胺磷（3911）等；中等毒有機磷

如樂果、殺螟松、倍硫磷等；低毒有機磷

如敵百蟲、馬拉硫磷、雙硫磷等。一六0五樂果甲胺磷（2）特點化學性質不穩(wěn)定，易分解，污染食品后殘留時間短，在生物體不易蓄積。在加工處理過程（碾磨、洗滌、去皮、烹調）中可減少。以急性毒性為主，表現(xiàn)出神經(jīng)中毒癥狀。長時間接觸對肝臟功能有損。過量或施用時期不當或使用高毒農(nóng)藥是造成有機磷農(nóng)藥污染食品的主要原因3.氨基甲酸酯類是一種高效、低毒、低殘留的農(nóng)藥。通式：常見的有：甲萘威、呋喃丹、速滅威等。甲萘威4.擬除蟲菊酯類是模擬天然除蟲菊酯化學結構而合成的農(nóng)藥。常用的有氯菊酯、溴菊酯、氯氰菊酯、甲醚菊酯。

特點：高效、低毒、低殘留，在環(huán)境中的降解以光解為主；對膽堿酯酶無抑制作用；親脂性強，可溶于多種有機溶劑，在水中的溶解度小,在酸性條件下穩(wěn)定，在堿性條件下易分解。食品中農(nóng)藥殘留分析檢測技術1.薄層色譜法（TLC）2.氣相色譜法（GC）占70%3.氣相色譜-質譜法（GC-MS）4.液相色譜法（HPLC）5.液相色譜-質譜法（LC-MS）6.超臨界流體色譜（SFC）7.毛細管電泳（CE）8.免疫分析（IA）化學法、比色、分光光度法缺少特異性，靈敏度低紙色譜、薄層色譜法GC、HPLCGC-MS、LC-MS定性定量、多殘留檢測食品中有機氯農(nóng)藥殘留量測定GB/T5009.19①GC-ECD法配標準混合使用液樣品提?。ㄓ帽⒓和?、乙醚、石油醚等）與凈化（用H2SO4磺化）、濃縮（旋轉蒸發(fā)或K-D減壓濃縮）、GC分離檢測（ECD檢測器）。色譜柱用硬質玻璃柱，若用不銹鋼柱，易引起農(nóng)藥分解。液體樣品采樣，應用玻璃瓶，不能用塑料瓶。②TLC法（2008年版本的取消了該法，均為GC，①毛細管柱-②填充柱-）K-D濃縮器

固定相：1.5％OV-17和2％QF-1混合固定液的80-100目硅藻土食品中有機磷農(nóng)藥殘留量的測定

GB/T5009.20-2003原理：果蔬中有機磷殘留提取有機溶劑凈化氣化注入GC

濃縮色譜柱中分離FPD檢測記錄色譜峰比較樣品和標準品的色譜峰外標定量（多用峰高）果蔬攪碎足量的無水硫酸鈉30~100g取樣10g振搖0.5h脫色70ml二氯甲烷脫水定容至2ml過濾35ml濾液室溫通風揮至近干移入5ml具塞刻度試管0.2~0.8g活性炭二氯甲烷多次研洗殘渣樣品處理不同種類樣品，處理方法有所不同。色譜條件1．色譜柱：玻璃柱，內(nèi)徑3mm，長1.5m～2.0m。擔體：60目～80目美國ChromosorbWAWDMCS（酸洗二甲基二氯硅烷化白色擔體）（1）分離測定敵敵畏、樂果、馬拉硫磷和對硫磷的色譜柱①2.5％SE－30（甲基硅橡膠，極弱極性）和3％QF－1（三氟丙基甲基聚硅氧烷，中等極性）混合固定液②1.5％OV－17（50%苯基-50%甲基聚硅氧烷，中等極性）和2％QF－1混合固定液（2）分離測定甲拌磷、稻瘟凈、倍硫磷、殺螟硫磷及蟲螨磷的色譜柱①3％PEGA（聚乙二醇己二酸酯，較強極性）和5％QF－1混合固定液②2％NPGA（己二酸新戊二醇聚酯，中等極性

）和3％QF－1混合固定液2．氣流速度：載氣為氮氣80mL/min；空氣50mL/min；氫氣180mL/min（根據(jù)儀器選擇各自的最佳比例條件）。3．溫度：進樣口220℃；檢測器240℃；柱溫180℃，但測定敵敵畏（其穩(wěn)定性差）為130℃。測定進農(nóng)藥標液→測峰高→繪制標準曲線→進等量試液→測峰高→計算二氯甲烷作提取劑毒性較小較便宜說明：國際上多用乙腈作為有機磷農(nóng)藥的提取劑及分配凈化試劑，但其毒性較大，且較貴。蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測GB/T5009.199-2003方法一速測卡法（紙片法）實驗原理：膽堿脂酶可催化靛酚乙酸脂（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍色），有機磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對膽堿脂酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥的存在。實驗試劑：1、固化有膽堿脂酶和靛酚乙酸脂試紙卡片（速測卡）；2、pH7.5磷酸鹽緩沖液：分別稱取15.0g磷酸氫二鈉[Na2HPO4?12H2O]與1.59g無水磷酸二氫鉀[KH2PO4]，用500mL蒸餾水溶解。實驗步驟：1、整體測定法（1）選取具有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右方形碎片,取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液，振搖50次，靜置2min以上.(2)取一片速測卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進行預反應，有條件時在37℃恒溫裝置中放置10min。預反應后的藥片表面必須保持濕潤。（3）將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應。注意：每批測定應設一個緩沖液的空白對照卡。2、表面測定法（1）擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴緩沖液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。（2）取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。（3）放置10min以上進行預反應，有條件時在37℃恒溫裝置中放置10min。預反應后的藥片表面必須保持濕潤。（4）將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應。注意：每批測定應設一個緩沖液的空白對照卡。結果判斷：結果以酶被有機磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥抑制（為陽性）、未抑制（陰性）表示。與空白對照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍色均為陽性結果。白色藥片變?yōu)樘焖{色或與空白對照卡相同，為陰性結果。對陽性結果的樣品，可用其他方法進一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。注意事項及說明：1、速測卡靈敏度指標如下表所示。部分農(nóng)藥檢出限參考表2、速測卡符合率：在檢出的30份以上陽性樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗證，陽性結果的符合率應在80%以上。3、蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提法，減少色素的干擾。4、當溫度條件低于37℃，酶反應速度隨之放慢，藥片加液后放置反應的時間也應相對延長，延長時間的確定，應以空白對照卡用手指（體溫）捏3min時可以變藍，即可往下操作。注意樣品放置的時間應與空白對照卡放置的時間一致才有可比性?？瞻讓φ湛ú蛔兩脑颍阂皇撬幤砻婢彌_溶液加得少、預反應后的藥片表面不夠濕潤；二是溫度太低。5、紅色藥片與白色藥片疊合反應的時間以3min為準，3min后的藍色會逐漸加深，24h后顏色會逐漸退去。方法二酶抑制率法（分光光度法）實驗原理：根據(jù)有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制乙酰膽堿酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反應底物碘化硫代乙酰膽堿和乙酰膽堿酯酶，如果蔬菜不含有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留或殘留量低，酶的活性就不被抑制，加入的底物就能被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應產(chǎn)生黃色物質。如果蔬菜的提取液含有農(nóng)藥并殘留量較高時，酶的活性被抑制，底物就不被水解，當加入顯色劑時就不顯色或顏色變化很小。用分光光度計在412nm處或農(nóng)藥殘毒快速檢測儀測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，就可以判斷。試劑：1、pH8.0緩沖液11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，溶解于1000mL蒸餾水中。2、乙酰膽堿酯酶根據(jù)酶活力用緩沖溶液溶解，3min的吸光值變化ΔA0值應控制在0.3以上。搖勻后在4℃冰箱中保存，保存期不超過4天。3、底物25.0mg碘化硫代乙酰膽堿，用3.0mL緩沖溶液溶解，4℃冰箱保存。保存期不超過2周。4、顯色劑160mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4℃冰箱保存。分析步驟：1、樣品處理選取有代表性的蔬菜樣品，去掉不可食部分，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片。取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖液，振蕩1～2min，倒出提取液，靜置3～5min，待用。2、對照溶液測試先于試管中加入2.5mL緩沖液，再加入0.1mL酶液、0.1mL顯色劑。搖勻后于37℃放置15min以上（每批樣品的控制時間應一致）。加入0.1mL底物搖勻，此時檢液開始顯色反應，應立即放入比色皿中，記錄反應3min的吸光度的變化值ΔA0。3、樣品溶液測試先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其他操作與對照測定相同，記錄反應3min的吸光度的變化值ΔAt。結果計算與判斷：

表示樣品中有高劑量的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留對檢驗結果陽性的樣品需重復檢驗兩次以上。注意事項及說明1、對檢驗結果陽性的樣品，需用其他方法進一步確定殘留農(nóng)藥的種類和進行定量測定。2、酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限為：3、蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質，容易產(chǎn)生假陽性，處理樣品時，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提法，減少色素的干擾。4、當溫度條件低于37℃，酶反應速度隨之放慢，藥片加液后放置反應的時間也應相對延長，延長時間的確定，應以膽堿酯酶空白對照測試的吸光度變化ΔA0在0.3以上為準。注意樣品放置時間應與空白對照溶液放置時間一致才有可比性。酶的活性不夠和溫度太低都可能造成膽堿酯酶空白對照液3min的吸光度ΔA0變化值＜0.3。5、該法適用于大量蔬菜樣本的篩檢，不適用于最后的仲裁檢測。第三節(jié)食品中霉菌毒素及其檢測食品中黃曲霉毒素B1的測定GB/T5009.22—2003

黃曲霉毒素（AFT）是一組化學結構類似的化合物，根據(jù)其在365nm紫外光下呈現(xiàn)的熒光顏色可分為B、G兩大類。根據(jù)Rf值不同，又分為B1、B2、G1、G2、M1、M2等，其中以AFTB1毒性、致癌性最強，且含量多。

常以B1為主要指標。

黃曲霉毒素的基本結構為二呋喃環(huán)和香豆素。

AFT主要污染：花生、花生油、玉米、大米、乳制品、腌制魚肉等，M1和M2主要存在于牛奶中。性質：難溶于水，不溶于乙醚、石油醚及己烷。易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿、苯及乙腈等有機溶劑。對光、熱、酸較穩(wěn)定，對堿和氧化劑則不穩(wěn)定。其純品為無色結晶，紫外線對低濃度AFT有破壞性。食品中AFTB1的允許量標準玉米、花生、花生油為≤20μg/Kg玉米及花生制品（按原料折算）為≤20μg/Kg大米、其他食用油為≤10μg/Kg其他糧食、豆類、發(fā)酵食品、發(fā)酵酒、糕點、餅干、面包等為≤5μg/Kg嬰兒食品不得檢出。薄層層析法原理

樣品中黃曲霉毒素B1，經(jīng)有機溶劑提取、濃縮、薄層分離后，在波長365nm紫外光下產(chǎn)生藍紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測定黃曲霉毒素B1的含量。

該法最低檢出量為0.0004μg，檢出限為5μg／Kg。儀器和試劑

(1)儀器小型粉碎機、樣篩、電動振蕩器、玻璃濃縮器、玻璃板5cm×20cm、薄層板涂布器、展開槽(內(nèi)25cm×6cm×4cm)、紫外光燈100一125w帶波長365nm濾光片、微量注射器(2)試劑①三氯甲烷、正己烷或石油醚(沸程30～60℃或

60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、無水乙醚或乙醚經(jīng)無水硫酸鈉脫水、丙酮。以上試劑在試驗前需先進行空白試驗，如不干擾測定即可使用，否則需逐一進行重蒸。

②硅膠G(薄層色譜用)、三氟乙酸、無水硫酸鈉、氯化鈉、苯一乙腈(98+2)混合液、甲醇水溶液(55+45)。

③黃曲霉毒素B1標準液：準確稱取1～1.2mgAFTB1標準品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此標準液濃度約為10ug／mL。先用紫外分光光度計測定其濃度，再用苯一乙腈混合液調整其濃度恰為10.0ug／mL。在350nm，AFTB1在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩爾消光系數(shù)為19800。

④黃曲霉毒素B1標準使用液：I液(1.0ug／mL)：取1mLAFTB1標準液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀釋、定容。Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI，按上法定容5mI。⑤次氯酸鈉溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，攪拌均勻。另將80g工業(yè)用碳酸鈉(Na2CO3·10H2O)溶于500mL溫水中。將兩液合并、攪拌、澄清、過濾。此液含次氯酸約25g／L。污染的玻璃器皿用次氯酸鈉溶液浸泡可達到去毒的效果。

分析步驟一、樣品處理

取大樣，經(jīng)粗碎及連續(xù)多次用四分法縮減至0.5～lkg后全部粉碎。糧食樣品全部通過20目篩，花生樣品全部通過10目篩，混勻。二、提取

20.00g樣品置于具塞錐形瓶中→加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液→振蕩30min，靜置，過濾于分液漏斗中→分層后，放出下層甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶內(nèi)→取20.00mL甲醇水溶液(相當于4.0g樣品)置于另一分液漏斗中→加20mL三氯甲烷，振搖、靜置分層→放出三氯甲烷層，經(jīng)無水硫酸鈉脫水，過濾于蒸發(fā)皿中→5mL三氯甲烷重復提取，合并濾液→于65℃水浴上揮干→冰盒上冷卻2～3min→1.00mL苯-乙腈溶解殘渣→轉入小具塞試管中。三、測定

①單向展開法

a．薄板制備：稱取3g硅膠G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊狀后，倒入涂布器推成5cm×20cm，厚度約0.25mm的薄層板3塊。在空氣中干燥15min，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。

b．點樣：在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個點，點距邊緣和點間距為lcm，點直徑約3mm，在同一板上滴加點的大小應一致，滴加時可用吹風機用冷風邊吹邊加。滴加樣式如下：

第一點：10μLAFTB1標準使用液(0.04μg／mL)。

第二點：20μL樣液。

第三點：20μL樣液+10μL0.04μg／mLAFTBl標液。

第四點：20μL樣液+10μL0.2μg／mLAFTB1標液。

c．展開與觀察：在展開槽內(nèi)加10mL無水乙醚，預展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10mL丙酮-三氯甲烷(8+92)，展開10～12cm，取出，在紫外光下觀察結果，方法如下：1標液2樣液4樣液+標液3樣液+標液第一點應有熒光，第一點滴加了AFTB10.4ng，作為最低檢出量。如無熒光，則可能是薄層板未制好或色譜條件有問題。第一點有熒光，而其余三點無熒光，說明樣液中有熒光猝滅劑，樣液需重新制備。第一點有熒光，第二點無熒光，三、四點有熒光。說明樣液不含AFTB1或含量小于最低檢出量（<5μg／kg）。四個點都有熒光。需做確證實驗后再進行定量。由于樣液上加滴了AFTB1標準，可使AFTB1標準點與樣液中AFTB1熒光點重疊。若樣液為陰性，薄板上第三點AFTB1為0.4ng

，可用作檢查樣液中AFTB1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；若樣液為陽性，則起定性作用。薄層板上第四點AFTB1標準為2ng，主要起定位作用，在上述色譜條件下，AFTB1的Rf值約在0.6左右。d．確證試驗:

第一點：10μL0.04μg／mLAFTBl標準使用液。第二點：20μL樣液于以上兩點各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應5min后，用吹風機吹熱風2min(板上溫度不高于40℃)，再于薄層板上滴加以下兩點。第三點：10μL0.04μg／mLAFTBl標準使用液。第四點：20μL樣液。按上法展開并觀察，樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標準點相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四兩點，可依次作為樣液與標準的衍生物空白對照。e．稀釋定量：

若樣液中熒光強度比最低檢出量強，則根據(jù)其強度估計，減少滴加微升數(shù)，或將樣液稀釋后再滴加不同微升數(shù)，直至樣液點的熒光強度與最低檢出量的熒光強度一致為止。滴加式樣如下：第一點：l0μLAFTB1標準使用液(0.04μg／mL)。第二點：根據(jù)情況滴加10μL樣液。第三點：根據(jù)情況滴加15μL樣液。第四點：根據(jù)情況滴加20μL樣液。f．結果計算：

式中：X一樣品中AFTBl的含量，μg／kg；V1一加入苯-乙腈混合液的體積，mL；V2—出現(xiàn)最低熒光時滴加樣液的體積，mL；D一樣液的總稀釋倍數(shù)；m—加入苯一乙腈混合液溶解時相當樣品的質量，g；0.0004—AFTBl的最低檢出限量，μg。②雙向展開法（滴加兩點法）

(1)點樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上滴加AFTB1標液與樣液。即在距左邊緣0.8～1cm處各滴加10uLAFTB1(0.04ug／mL)標準液，在距左邊緣2.8～3cm處各滴加20uL樣液。然后在第二塊板的樣液點上加滴l0uLAFTBl(0.04ug／mL)標準液，在第三塊板的樣液點上加滴10uLAFTB1(0.2ug／mL)標準液。先無水乙醚后丙酮三氯甲烷標準樣液樣液+標準樣液+標準(2)展開：

a．橫向展開：10mL無水乙醚，展至板端后，取出揮干。根據(jù)情況，可再重復l～2次。b．縱向展開：以丙酮-三氯甲烷(8+92)展開至10～12cm為止。

(3)觀察與評定結果：

a．在紫外燈下觀察第一、二塊板，若第二塊板的第二點在AFTB1標準點的相應處出現(xiàn)最低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光，則樣品中AFTBl含量<5ug／kg.

b．若第一塊板在與第二塊板的相同位置上出現(xiàn)熒光點，則將第一塊板與第三塊板比較，看第三塊板上第二點與第一塊板上第二點的相同位置上的熒光點是否與AFTB1標準點重疊，如果重疊，再進行確證試驗。在具體測定中，三塊板可以同時做，也可按順序做。當?shù)谝粔K板出現(xiàn)陰性時，第三塊板可以省略，如第一塊板為陽性，則第二塊板可省略，直接做第三塊。

(4)確認試驗：另取薄層板二塊，于第四、五兩板距左邊緣0.8～1cm處，各滴加10uLATTB1(0.04ug／mL)標準液及一小滴三氟乙酸；在距左邊緣2.8～3cm處，于第四板滴加20uL樣液及一小滴三氟乙酸；于第五板滴加20uL樣液、10uLAFTBl(0.04ug／mL)標準液及一小滴三氟乙酸，反應5min后，用熱風吹2min(板上溫度不高于40℃)。再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標準點重疊的衍生物。觀察時，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。若樣液AFTB1含量較高時，則將樣液稀釋后，按單向展開法中d做確認試驗。(5)稀釋定量：(6)結果計算：

同單向展開法。

注意事項

用過后受污染的玻璃器皿，應經(jīng)次氯酸溶液(25g／L)，浸泡消毒數(shù)小時后再清洗之！

酶聯(lián)免疫(ELISA)法

enzyme-linkedimmunosorbentassay

實驗原理：

采用間接競爭ELISA方法，樣品中的黃曲霉毒素B1經(jīng)提取、脫脂、濃縮后與定量特異性抗體反應，多余的游離抗體則與酶標板內(nèi)的包被抗原結合，加入酶標記物和底物后顯色，與標準比較測定含量。儀器與試劑：（一）試劑盒組成1、AFTB1抗原包被96孔酶標板；2、抗體；3、酶標二抗；4、空白對照液；5、底物（1mg×4）；6、底物液A；7、底物液B；8、終止液(2mol/LH2SO4)；9、PBS一T洗液；10、一次性手套（2副）。（二）儀器1、酶標儀；2、離心機。實驗步驟：（一）樣品中AFTB1的提取1．大米和小麥（脂肪含量＜3.0％）樣品粉碎后過20目篩，稱取20.0g，加入250mL具塞錐形瓶中。準確加入60mL三氯甲烷，蓋塞后滴水封嚴，150rpm振蕩30min。靜置后，用快速定性濾紙過濾于50mL燒杯中，立即取12mL濾液（相當4.0g樣品）于75mL蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風揮干。用2.0mL甲醇一PBS(20+80)分三次（0.8mL、0.7mL、0.5mL）溶解并徹底沖洗蒸發(fā)皿中凝結物，移至小試管加蓋振蕩后靜置待測。此液每毫升相當2.0g樣品。

2.玉米（脂肪含量3.0～5.0％）樣品粉碎后過20目篩，稱取20.0g，加入250mL具塞錐形瓶中。準確加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，蓋塞后滴水封嚴，150rpm振蕩30min。用快速定性濾紙過濾于125mL分液漏斗中,待分層后，放出下層甲醇水溶液于50mL燒杯內(nèi)，從中取10.0mL（相當于4.0