常用細胞培養(yǎng)技術 細胞原代培養(yǎng)

細胞原代培養(yǎng)2023/10/2712023/10/2722023/10/27凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。22023/10/2732023/10/27125一、培養(yǎng)室的無菌操作1、培養(yǎng)前準備制訂實驗計劃、操作程序、實驗數(shù)據(jù)；準備：器材、物品置于超凈臺；（細胞、培養(yǎng)液）各種物品75%酒精擦拭后，再放入超凈臺。2、超凈臺消毒紫外線照射30min,細胞和培養(yǎng)液不能照射；物品排放整齊，不要過多重疊，否則效果降低；實驗前75%酒精擦拭臺面；32023/10/2742023/10/271253、防護戴手套，75%酒精/0.2%新潔爾滅消毒手和手臂；戴口罩，不允許講話（支原體）；有條件，白大褂、帽子.4、無菌操作操作前，過酒精燈火焰消毒，冷卻后使用；瓶口、瓶蓋、移液管、膠塞、鑷子等手不能拿出超凈臺，否則重新擦拭。42023/10/2752023/10/27125臺面物品擺放有序，左手：右手，酒精燈居中；移液管/槍頭不能交叉使用；移液管等不能觸及瓶口、皿口等；瓶口傾斜，瓶蓋豎放，皿蓋半開，防止細菌落入；吸管口向下傾斜，防止液體倒流。不能在開啟容器上方操作。在超凈臺中央無菌區(qū)域操作。槍頭盒用后蓋上?；鹧娓浇僮?。2023/10/2762023/10/27125?取材是原代細胞培養(yǎng)成功的首要條件，直接影響細胞的體外培養(yǎng)。取材基本要求1．取材要注意新鮮，否則1cm3、4℃保存，24hr內使用2．嚴格無菌3．防止機械損傷→鋒利刀片切割4．去除無用組織（血液、脂肪、結締、壞死組織），避免干燥5．記錄：組織類型、分化程度、年齡等，留好樣本二、原代細胞的取材2023/10/2772023/10/276.原代培養(yǎng)，需營養(yǎng)豐富（10%-20%胎牛血清，進口）7.各種組織培養(yǎng)的難易程度胚胎組織較成熟個體組織易培養(yǎng)分化低的較分化高的組織易培養(yǎng)腫瘤組織較正常組織易培養(yǎng)2023/10/2782023/10/27各類組織的取材技術皮膚和粘膜的取材內臟和實體瘤的取材血液細胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材動物組織取材人胚體組織取材雞（鴨）鳥類胚胎組織取材2023/10/2792023/10/27皮膚和粘膜的取材上皮細胞培養(yǎng)來源：來源：主要取自于手術過程中的皮片；消毒：體表微生物多，嚴格消毒，不能用碘酒=〉影響細胞生長；面積一般2-4mm2；不要太厚，盡量去除皮下和粘膜下組織。2023/10/27102023/10/27內臟和實體瘤的取材內臟除消化道外基本是無菌的；明確、熟悉所需組織的類型和部位；實體瘤：取腫瘤細胞豐富區(qū)域；要避開破潰、壞死液化部分，以防污染；盡量去除混雜的血管、神經(jīng)和結締組織。2023/10/27112023/10/27血液細胞的取材血細胞：一般多抽取靜脈血淋巴細胞：從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等）分離細胞；取材時應抗凝（肝素）常用濃度20U/mL針筒用500U/mL肝素潤濕。2023/10/27122023/10/27骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材嚴格無菌；離心PBS洗兩次培養(yǎng)液洗一次，培養(yǎng)。2023/10/27132023/10/27鼠胚組織取材引頸或氣管窒息法處死孕期鼠；75%酒精浸泡5分鐘（時間不能長，否則酒精從口或其他通道進入體內，影響組織活力）；無菌圖釘固定四肢在消毒木板上；切開皮膚，無菌取胚或無菌止血鉗挾起皮膚、沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，取出胚胎。2023/10/27142023/10/27鼠胚腎（或肺）取材幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部/背部朝上固定在木板上；腹部朝上，無菌打開胸腔取肺?；虮巢砍?，無菌取腎。2023/10/27152023/10/27雞（鴨）鳥類胚胎組織取材取孵化9-12天的胚蛋；燈檢有豐富血管、胚體運動的胚蛋，劃出氣室和胚體位置；用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干；無菌打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；無菌取出雞胚。2023/10/27162023/10/27（一）懸浮細胞的分離方法組織材料：血液、羊水、胸水或腹水；方法：采用1000r/min的低速離心10分鐘。離心后各種比重不同的細胞在分層液中分層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。注意：速度不能過高，時間不能過長，以免擠壓細胞，引起損傷和死亡。三、組織材料的分離2023/10/27172023/10/27（二）實體組織材料（組織塊）的分離方法實體組織材料，細胞間結合緊密組織細胞充分分散，形成細胞懸液機械分散法（物理裂解）消化分離法。2023/10/27182023/10/27機械分散法適用對象：纖維成分很少的組織腦組織、胚胎組織及一些腫瘤組織；方法:剪切后，吸管反復吸打組織通過注射器針頭---細胞損傷大。注射器芯擠壓通過不銹鋼網(wǎng)篩---常用。特點:簡便、快速對組織機械損傷大細胞分散效果差。2023/10/27192023/10/27剪切法10mm3小塊休整、沖洗反復剪切至糊狀加入Hank’s液/無血清培養(yǎng)液反復吹打離心去上清組織小塊用于培養(yǎng)2023/10/27202023/10/272023/10/27212023/10/27消化分離法組織剪切成較小團塊（或糊狀）；進一步使細胞間的橋連結構松動使團塊膨松使細胞團塊充分分散；接種培養(yǎng)，細胞容易貼壁生長。

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酶的生化作用

非酶的化學作用少量細胞團和大量單個細胞的懸液2023/10/27222023/10/27方法

1-2mm3小塊，3-5倍體積胰蛋白酶攪拌（慢）消化20-60min（30）若時間長，取2/3上清/15min,離心收細胞加入新胰酶繼續(xù)消化過100目網(wǎng)篩離心、漂洗、計數(shù)、稀釋、接種培養(yǎng)（0.5Χ106～1Χ106）2023/10/27232023/10/27消化分離法的注意事項組織塊漂洗：2-3次除去組織中的鈣、鎂離子和血清。防止抑制胰蛋白酶和EDTA的作用。胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。消化后組織漂洗，避免毒性產(chǎn)生。動作要輕，避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。2023/10/27242023/10/27計數(shù)板的認識兩個計數(shù)室每個：長3mm;寬3mm;高0.1mm=0.9mm3一個大方格=0.1mm31×10-4ml(4大格細胞數(shù)之和/4)x1041ml懸液中細胞數(shù)2023/10/27252023/10/27計數(shù)方法準備：計數(shù)板、蓋玻片：酒精清潔，干燥；制備細胞懸液：單細胞，密度〉104個/mL；加樣：蓋玻片放于計數(shù)板中央吸少量懸液，從蓋玻片一側加入，不要溢出，不要過少，不要有氣泡。計數(shù):四角大方格總數(shù)壓線細胞：計上不計下，計左不計右2023/10/27262023/10/27125計算

細胞數(shù)/毫升原液=（4大格細胞數(shù)和/4）x104x稀釋倍數(shù)注意細胞分散良好出現(xiàn)較多細胞團細胞數(shù)少于20個/1mm2細胞數(shù)多于50個/1mm2重制細胞懸液，重新計數(shù)。

每次吸取前要混勻計數(shù)時，遇細胞團，按單個細胞計算；262023/10/2727細胞密度換算溶液稀釋公式C1xV1=C2xV2C1、V1表示稀釋前的濃度和體積C2、V2表示稀釋后的濃度和體積例：現(xiàn)有108/ml懸液，配制106/ml懸液10mL，如何配制？

108xV1=106x10V1=107/108=0.1毫升即取原液0.1毫升，加9.9毫升培養(yǎng)基，混勻。2023/10/272023/10/27282023/10/27四、接種培養(yǎng)2023/10/27292023/10/27（一）組織塊培養(yǎng)法特點常用、簡便易行、成功率較高；培養(yǎng)時間長不是每一組織塊都能長出細胞。瓶壁可預先涂以膠原薄層，利于組織塊粘著瓶壁，周邊細胞能沿瓶壁向外生長。2023/10/27302023/10/27125具體步驟剪1mm3小塊，剪切時保持濕潤；小塊均勻擺放，間隔0.5cm；輕輕反轉培養(yǎng)瓶，底朝上，加入適量培養(yǎng)液，37度靜置2-4hr；待組織塊貼敷后，翻轉培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)；注意事項翻轉時動作輕，防沖起；觀察：污染及時清除；3~5天換液，去除組織塊、血細胞及細胞碎片。2023/10/27312023/10/27125312-4hr2023/10/27322023/10/27125注意：隨時鏡檢，分散成單個細胞或細胞團停止消化32（二）消化培養(yǎng)法2023/10/27332023/10/27（三）懸浮細胞培養(yǎng)法對于懸浮生長的細胞如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化；低速離心分離，直接培養(yǎng)或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。2023/10/27342023/10/27（四）器官培養(yǎng)

指從供體取得器官或器官組織塊后，直接在體外特定環(huán)境條件下培養(yǎng)；要求:保持器官的相對完整性；目的：觀察細胞間的聯(lián)系、排列情況、相互影響，以及局部環(huán)境的生物調節(jié)作用。2023/10/27352023/10/27注意防止器官中心壞死；所以保證氧的供給；組織塊厚度或直徑不易超過1mm；組織塊不能完全浸入培養(yǎng)液；2023/10/27362023/10/27方法凝固的血漿基質培養(yǎng)法平皿表面有一層凝固的雞血漿/雞胚浸出液缺點：組織周圍的血漿凝塊發(fā)生浸潤，器官陷入培養(yǎng)基。瓊脂基質培養(yǎng)法血漿、雞胚浸出液和滅菌瓊脂混合，形成穩(wěn)定的半固體培養(yǎng)基，進行表面培養(yǎng)。彌補方法1的不足2023/10/27372023/10/27漂浮法擦鏡紙打孔/醋酸纖維素薄膜/微孔濾膜上放置器官培養(yǎng)。格柵培養(yǎng)法

漂浮的薄膜有時會下沉，引入金屬格柵，組織塊放在金屬格柵上，培養(yǎng)液與格柵奇平。交替暴露于培養(yǎng)基和氣相培養(yǎng)法2023/10/27382023/10/27原代培養(yǎng)要求（貼壁細胞）充分漂洗，盡量除去消化液的毒性；接種時濃度要稍大一些；血清濃度高一