淺談宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在遺傳調(diào)控中的應(yīng)用

淺談宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)在遺傳調(diào)控中的應(yīng)用

自然界中的微生物多樣性非常復(fù)雜。大多數(shù)微生物無法通過傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)和分離。研究顯示,只有1%～5%的微生物可以在實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)。因此,在過去的300多年中,大多數(shù)微生物不能通過傳統(tǒng)的、已經(jīng)設(shè)計(jì)好的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行研究。隨著分子生態(tài)學(xué)方法的建立,科學(xué)家們對環(huán)境微生物的整體情況有了較深刻的了解。最初,研究人員采用基于16S/18SrRNA/rDNA的變性梯度凝膠電泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)和克隆文庫的方法對反芻動物腸道微生物群落的變化情況進(jìn)行監(jiān)控,隨后熒光原位雜交(Fluorescentinsituhybridization,FISH)和限制性片段長度多態(tài)性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)等技術(shù)的建立和應(yīng)用,使人們對微生物群落有了更加深入的了解。20世紀(jì)興起的宏基因組學(xué)(metagenomics)通過大規(guī)模的測序技術(shù),能夠直接得到某一環(huán)境條件下微生物群落的整體結(jié)構(gòu)信息,這在很大程度上解決了大部分微生物因不能分離培養(yǎng)而難于研究的問題,避免了其他固有技術(shù)(如PCR)應(yīng)用中易出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)偏差,同時也免去了一些費(fèi)時耗力的實(shí)驗(yàn)步驟比如文庫構(gòu)建。但是,該技術(shù)仍無法對微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝、功能間的關(guān)系進(jìn)行剖析和監(jiān)測,特別是無法明確微生物適應(yīng)環(huán)境變化而做出的響應(yīng)。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)(meta-transcriptomics)是在宏基因組學(xué)之后興起的一門新學(xué)科,研究特定環(huán)境、特定時期群體細(xì)胞在某功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄的所有RNA(包括mRNA和非編碼RNA)的類型及拷貝數(shù)。這種技術(shù)不但具有宏基因組技術(shù)的的全部優(yōu)點(diǎn),而且能將特定條件下的生物群落及其功能聯(lián)系到一起,對群體整體進(jìn)行各種相關(guān)功能的研究。新一代測序方法的產(chǎn)生直接擴(kuò)大了宏基因組研究的數(shù)量和范圍,并且推動了宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的建立和發(fā)展。454焦磷酸測序法是新一代的測序技術(shù),它能夠?qū)NA或者cDNA直接進(jìn)行測序,省去了克隆的步驟,增加了測序產(chǎn)量,而且降低了每個測序堿基的成本。Leininger等第一個使用454測序技術(shù)對一個復(fù)雜微生物群落的宏轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)與土壤中的其他細(xì)菌相比較,古菌胺氧化關(guān)鍵酶(amoA)的轉(zhuǎn)錄本能夠保持相當(dāng)高的豐度,這體現(xiàn)了古菌在土壤胺氧化微生物中的數(shù)量優(yōu)勢。該轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究所獲得的25Mbp的序列由Urich等做了進(jìn)一步的分析。2008年,Friaz-Lopez等通過該測序法獲得了>50Mbp的測序長度。第二代GS-FLX測序技術(shù)具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、快速、高靈敏度和高自動化的特點(diǎn),在技術(shù)的成熟性和性能方面也均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了第一代,用此技術(shù)Gilbert獲得了300Mb的序列數(shù)據(jù)。最近報(bào)道的454FLXTitanium平臺,其測序的平均長度大約為400bp,并且可以預(yù)測,未來其讀取長度可以和那些傳統(tǒng)測序技術(shù)相媲美。隨著大規(guī)模測序工作的迅速開展,出現(xiàn)了各種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫,應(yīng)用于大規(guī)模微生物的基因組序列分析。這些數(shù)據(jù)庫之間聯(lián)系密切,并借助于網(wǎng)絡(luò)形成了復(fù)合的、開放型的多功能數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)。這些新型數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)還整合了多種數(shù)據(jù)分析軟件,為使用者提供了方便。另外,大量基因注釋工作的完成極大豐富了數(shù)據(jù)的信息量?？梢灶A(yù)見,當(dāng)基因組測序及注釋工作基本完成以后,積累的大量數(shù)據(jù)將使生物信息學(xué)在人類基因組研究中的重要性更加突出,為宏轉(zhuǎn)錄組和宏基因組技術(shù)的發(fā)展,提供有利的新途徑。1提取納米na宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法通常含有五個步驟(圖1),其中群體RNA的處理及數(shù)據(jù)的比較分析是較為關(guān)鍵的兩步。由于RNA的穩(wěn)定性要比DNA差的多,有些轉(zhuǎn)錄組樣品的放置時間不能超過一分鐘,因此必須采取一些有效的措施以防止RNA的降解,比如立即速凍或者放置于RNA儲存液當(dāng)中,并盡快完成反轉(zhuǎn)錄。另外,在一個細(xì)菌細(xì)胞的總RNA中,mRNA僅僅占1%～5%,這就需要在提取之后進(jìn)行mRNA的富集。雖然不經(jīng)過富集的mRNA樣品也能夠通過焦磷酸測序進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的分析,但如果主要的目的是研究群落的轉(zhuǎn)錄譜,如此的測序量便是一種浪費(fèi)?，F(xiàn)在已有可用于mRNA富集的商業(yè)化試劑盒。比如,使用Ambion的MICROBExpress試劑盒,其去除rRNA后的樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA中rRNA的數(shù)據(jù)比例<20%,或低于0.08%。另一個重要的步驟是數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)庫的發(fā)展是宏轉(zhuǎn)錄組分析的重要影響因素,常用的宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白質(zhì)組研究的數(shù)據(jù)庫和軟件列于表1。2資源和優(yōu)勢2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較在過去幾十年中,大量的轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)完成,它們回答了藥物學(xué)與生物學(xué)中許多關(guān)鍵性的問題,并且為解釋某些抗沖擊表型,比如抗紫外線、抗熱擊等相關(guān)基因的表達(dá)提供了有價值的依據(jù)。這些轉(zhuǎn)錄組序列信息的獲得大多數(shù)是應(yīng)用DNA芯片技術(shù)來完成的。起初,這些研究僅限于單個純培養(yǎng)的生物體,后來擴(kuò)大到包含幾種生物的小群落。以DNA芯片為基礎(chǔ)構(gòu)建的表達(dá)譜能夠包含一定量的信息,但是芯片的制作需要基因或全基因組序列有相應(yīng)的注釋。這就降低了從環(huán)境中獲得新的功能的蛋白的可能性。相比較之下,宏轉(zhuǎn)錄組研究的樣品可以包括許多種類的生物,而且得到的mRNA序列大多數(shù)是未知的,結(jié)果分析也不需要已知基因注釋,因此宏轉(zhuǎn)錄組對于發(fā)現(xiàn)新種類的蛋白質(zhì)具有非常大的潛力。與宏基因組相比,轉(zhuǎn)錄組需要的測序容量較小。在檢測的靈敏度和定量的可靠性方面也比較好,這些特點(diǎn)尤其適合于研究低編碼密度真核生物基因組。2.2群落分類的影響宏轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)包括rRNA和mRNA,這樣就可以對樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)和原位功能進(jìn)行解釋。將其微生物群體復(fù)雜的群落分類與它們的功能相關(guān)聯(lián),可以利用這一特點(diǎn)有效地監(jiān)控由環(huán)境引起的群落結(jié)構(gòu)和功能的變化。比如,Urich等使用該方法首次得到了自然狀態(tài)下群落活動的整體數(shù)據(jù),實(shí)現(xiàn)了三個域的生物成員豐度的同步定量評估,同時,他們也檢測到了豐富的mRNA,從mRNA中得到群落生理代謝的情況,并進(jìn)一步分析了樣品中各個群落組成成分的功能。3在微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用3.1土壤微生物物種多樣性與基因序列及生物活性關(guān)系采用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法研究環(huán)境微生物的多樣性及相關(guān)功能,可以發(fā)現(xiàn)大量的微生物資源,研究種群結(jié)構(gòu)多樣性及各種因素對其代謝的影響,解密復(fù)雜的微生物環(huán)境,如土壤、海洋等樣品中信號分子的傳遞和基因調(diào)控機(jī)制,從而為探索微生物群落的生態(tài)功能奠定基礎(chǔ),表2歸納了部分微生物宏轉(zhuǎn)錄組的研究概況。續(xù)表Urich等在研究沙質(zhì)土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落時,采用宏轉(zhuǎn)錄組的方法獲得了2.1MbpmRNA-tags,并用SEED數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了全面的功能分析。將分別來自于相同土壤和不同農(nóng)場的土壤的宏轉(zhuǎn)錄組與宏基因組數(shù)據(jù)相比較。由系統(tǒng)相對分布得知,兩種土壤樣品的宏基因組功能分析結(jié)果非常相似。宏基因組分析經(jīng)常通過將編碼蛋白質(zhì)的基因與已測序的相關(guān)基因組比對進(jìn)行群體分類,得到群落分類的概況。這說明,土壤微生物群落的功能具有普遍相似性,因此以DNA為基礎(chǔ)的土壤群落功能分析可能總是得到相似的結(jié)果。而宏轉(zhuǎn)錄組得到的rRNA和mRNA數(shù)據(jù)卻能夠檢測群落變化的過程。當(dāng)把rRNA概況與包含mRNA-tags的分類學(xué)庫用MEGAN比較,發(fā)現(xiàn)有5種主要細(xì)菌的種類發(fā)生了變化,并且蛋白質(zhì)代謝(轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和降解)能全部展示出來,作為預(yù)測生物體活動的指標(biāo)。宏轉(zhuǎn)錄組和宏基因組之間更多的不同是:與宏基因組相比,宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示涉及單糖、寡糖、多糖和氨基糖有氧降解的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄水平降低,而與發(fā)酵、糖醇類和CO2固定相關(guān)的轉(zhuǎn)錄水平基本相同。以RíoTinto(西班牙)地區(qū)極端酸性水域的特點(diǎn)是營養(yǎng)貧瘠并且金屬含量極高,以該水域中水氣界面的微生物種群為研究對象進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)屬于革蘭氏陰性菌的鉤端螺旋菌屬、硫桿菌屬和氧化亞鐵硫桿菌屬非常豐富,這些微生物組成了嗜酸的纖維生物膜,該纖維生物膜生物中的上調(diào)基因與生物膜的形成和穩(wěn)定有關(guān),如涉及運(yùn)動型和群體感應(yīng)(mqsR,cheAY,fliA,motAB),細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)合成(lnt,murA,murB),特殊蛋白酶(clpX/clpP),應(yīng)激反應(yīng)分子伴侶(clpB,clpC,grpE-dnaKJ,groESL)等的基因。另外,涉及混合酸發(fā)酵的基因(poxB,ackA)在生物膜中也有上調(diào)。在這種pH1.8的水域當(dāng)中,同時也有小分子有機(jī)酸——醋酸鹽和甲酸鹽的存在(分別為1.36mmol/L和0.06mmol/L)?？茖W(xué)家們推測,醋酸在組成生物膜的變形菌綱,酸桿菌屬(Acidobacteriumspp.)和硫化桿菌屬(Sulfobacillusspp.)菌中向Fe3+提供電子,發(fā)揮其相關(guān)的生態(tài)學(xué)作用。另外,醋酸可能對于化能無機(jī)營養(yǎng)細(xì)菌的生長有抑制作用,從而對生物浸礦產(chǎn)生消極影響。該研究結(jié)果通過比較纖維生物膜中生物在極酸環(huán)境下的生理差異,使這些極端微生物在工業(yè)生物浸出和環(huán)境應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。在2008年的一項(xiàng)關(guān)于土壤群落的宏轉(zhuǎn)錄組研究中,第一次提到了未能培養(yǎng)的泉古菌(Crenarchaeota)的原位活動。mRNA數(shù)據(jù)中古菌占1.7%,與rRNA數(shù)據(jù)中的比例是一致的。將超過80個mRNA-tags同源的序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能注釋發(fā)現(xiàn),除了典型古菌持家基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之外,還涉及到豐富的氨氧化序列。有13個mRNA來自于代謝關(guān)鍵酶氨單氧化酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(amoA和amoC)和來自于氨氧化還原酶(nirk)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這說明,作為氨氧化細(xì)菌,無論是在好氧條件還是厭氧條件下,都參與了氨的氧化過程。這些發(fā)現(xiàn)再一次證明了氨氧化是土壤泉古菌的主要能量代謝方式。另外,還檢測到與CO2代謝相關(guān)的乙酰輔酶A/丙酰輔酶A羧化酶mRNA存在。來自于甲基丙二酰輔酶A變位酶(MCM)的同源蛋白的mRNA,和來自于4-羥基丁酰輔酶A同源蛋白的mRNA,連同乙酰輔酶A/丙酰輔酶A羧化酶一起,組成嗜熱古菌和海洋古菌中特定的CO2固定途徑。這證明了土壤和海洋中古菌CO2的固定途徑是相似的。這兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)很好的解釋了這個很少被研究的群體的化能無機(jī)自養(yǎng)生活方式。Poretsky對貧瘠的北太平洋水域表面的浮游細(xì)菌種群進(jìn)行了研究,mRNA數(shù)據(jù)表明,該群體的微生物白天進(jìn)行光合作用、氧化磷酸化和C1化合物的合成代謝活動,而夜間則進(jìn)行細(xì)胞膜,氨基酸和維生素等生物合成活動。Holmes等在2009年對鈾污染環(huán)境中沉積物的宏轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測,并與沒有污染的樣品進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)有1084個基因的轉(zhuǎn)錄水平提高,同時在G.uraniireducens細(xì)胞中有34個涉及鈾降解的基因上調(diào)。對該結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析,將來可以應(yīng)用于對污染的環(huán)境的檢測。Shi等用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對海洋樣品中smallRNA的研究中發(fā)現(xiàn),psRNA(putativesRNAs)分布于基因組中基因之間的區(qū)域,其二級結(jié)構(gòu)非常保守。由于位于基因的兩側(cè),推測這些psRNA可能與基因的功能調(diào)節(jié)有關(guān)。隨深度而變化的psRNA能夠反映分布廣泛的群落分類情況;而聯(lián)系緊密的群體的生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性,可以通過更精確的psRNA差異來證明。3.2海洋細(xì)菌和海膽上phna基因同源物的來源2009年,Gilbert應(yīng)用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)從海洋中獲得總mRNA,并分析了其中復(fù)雜的環(huán)境轉(zhuǎn)錄組信息,對沿海生態(tài)系統(tǒng)中28個phnA基因的同源物質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果顯示>3%的海洋細(xì)菌攜帶有phnA基因。同時在fosmid文庫中,發(fā)現(xiàn)了phnA同源物的存在。含有該同源物的微生物包括不能培養(yǎng)的用于氨氧化和碳固定的Crenarcheota,以及海洋中有固氮功能的CyanobacteriumCrocosphaerawatsonii。3.3amoc轉(zhuǎn)錄本的制備宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)還可以用于特定復(fù)合基因的拼接,Leininger等采用非目標(biāo)的隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄的方法,用mRNA-tags拼接出一個接近全長的amoC轉(zhuǎn)錄本。推導(dǎo)出的氨基酸序列包括了古菌海綿共生體的海綿共生體amoC同源體189個氨基酸中的146個(77%),并且與海綿共生體amoC同源體有88%的一致性,與amoA有84%的一致性。4浮游生物群落如前所述,宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠廣泛用于復(fù)雜群落的研究,像海洋浮游植物、地表水和土壤微生物群落等。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展以及基因注釋的進(jìn)一步豐富,宏轉(zhuǎn)錄組應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究的前景將更加廣闊。4.1宏轉(zhuǎn)錄組對高豐度的轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因的鑒定是現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)的重點(diǎn)之一在生態(tài)系統(tǒng)研究中使用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),能夠?qū)?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件下基因表達(dá)的變化情況直接進(jìn)行分析。尤其對于那些活性未知的生物群落的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),從中能夠獲得一些知之甚少的微生物生態(tài)學(xué)信息。有的生態(tài)或者生物化學(xué)范圍內(nèi)的重要基因可能不存在于高豐度的轉(zhuǎn)錄群體中,例如,與中心代謝和蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄情況相比,環(huán)境中高含量化合物對于細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄影響并不明顯。因此,研究細(xì)胞的大量代謝——核糖體蛋白、DNA復(fù)制相關(guān)酶的生態(tài)信號的鑒定可以采用宏轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深入測序。另外,隨著測序技術(shù)的進(jìn)步,mRNA序列的覆蓋信息會進(jìn)一步擴(kuò)大,同時借助于基因芯片進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)比較,通過基因的線性表達(dá)情況鑒定和研究復(fù)雜微生物群落的基因調(diào)節(jié)活動。4.2宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究環(huán)境微生物在地球化學(xué)循環(huán)及一些特殊環(huán)境的形成中起著重要的作用,利用宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù),對那些仍然未知但是可能起著關(guān)鍵作用的基因進(jìn)行研究,與特殊功能微生物群落結(jié)構(gòu)聯(lián)系到一起,便能深入理解其生物學(xué)本質(zhì)。已知的宏基因組學(xué)研究公布了含有