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柴胡疏肝散對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證大鼠海馬區(qū)雌激素受體er,er,gpr
更年期綜合征是指更年期前后的卵巢功能萎縮,雌激素水平波動(dòng)或降低,女性以獨(dú)立神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為主,伴有神經(jīng)心理癥狀的癥狀群。中醫(yī)學(xué)稱之為“絕經(jīng)前后諸證”。近年來(lái),許多研究發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證女性的雌激素水平、雌激素受體以及肽類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的活性和含量都有明顯改變,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)郁證動(dòng)物海馬和下丘腦肽類(lèi)和單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化與其相類(lèi)似。傳統(tǒng)經(jīng)方柴胡疏肝散能改善圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證的癥狀,本研究旨在以“以方測(cè)證”的方法研究圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制,探討雌激素受體表達(dá)變化與大鼠海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的關(guān)系。材料和方法1.實(shí)驗(yàn)大鼠的分組及飼養(yǎng)條件選取雌性SD大鼠,SPF級(jí)[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2006-2009],13月齡,48只,體質(zhì)量370-380g;3月齡12只,體質(zhì)量250-280g。13月齡組大鼠持續(xù)30d作陰道涂片,用95%酒精固定,5%堿性美藍(lán)溶液染色5min,吹干,鏡檢,呈現(xiàn)無(wú)持續(xù)動(dòng)情5d以上大鼠作為圍絕經(jīng)期模型鼠,將其隨機(jī)分為對(duì)照組(B組)、對(duì)照加中藥組(C組),圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證加中藥組(D組)、圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證組(E組),每組12只。另選3月齡、有規(guī)則的動(dòng)情周期、平均體質(zhì)量達(dá)250-280g的雌性SD大鼠,共12只,作為育齡期空白對(duì)照組(A組),與其余各組相同條件飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:分籠,每籠2只,于晝夜顛倒環(huán)境(每日21∶00開(kāi)燈,9∶00關(guān)燈),除實(shí)驗(yàn)期外自由飲食、飲水。所有實(shí)驗(yàn)操作均在夜間、暗淡紅燈下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例的規(guī)定。2.模型準(zhǔn)備和評(píng)估2.1動(dòng)情周期觀察、藥物干預(yù)和等體積、鈉圍絕經(jīng)期綜合征大鼠造模方法用自然衰老方法;肝郁證大鼠造模方法采用慢性束縛應(yīng)激方法,采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠情緒、行為變化以判定造模是否成功,造模時(shí)間為3周。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,每日6h,束縛時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)。同時(shí)進(jìn)行動(dòng)情周期觀察,選取連續(xù)5d不出現(xiàn)動(dòng)情期的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn),中藥干預(yù)組大鼠給予研究團(tuán)隊(duì)前期研制的柴胡疏肝散(《景岳全書(shū)》原方原劑量組方:柴胡6g,白芍4.5g,枳殼4.5g,川芎4.5g,醋炒陳皮6g,香附4.5g,炙甘草1.5g)水溶液每日灌胃1次(每毫升藥液含原生藥1g,劑量1mL/100g體質(zhì)量)。劑量均按臨床成人劑量的8倍計(jì)算,其余大鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。藥物干預(yù)3周后處死。2.2靜置-離心制備第22天時(shí),所有大鼠空腹戊巴比妥(1mL/100g)麻醉,腹主動(dòng)脈采血,將獲取的新鮮血液于4℃冰箱靜置6h后,以3000r/min室溫離心10min,取血清,標(biāo)記后置-70℃低溫冰箱中備存;所有大鼠在冰上剝離大腦,迅速分離海馬,置冷凍管標(biāo)記后,立即投入液氮中備用,以防止海馬組織內(nèi)部RNA降解。3.試劑和設(shè)備3.1分離、n-n酶聯(lián)免疫試驗(yàn)劑及檢測(cè)儀器海馬組織勻漿后3000r/min,4℃離心15min,取上清液,參照大鼠5-HT、β-END、NE酶聯(lián)免疫分析試劑盒(購(gòu)自武漢華美公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,檢測(cè)儀器:EIX808U型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTekGC-2010型)。GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems),引物設(shè)計(jì)軟件:Primer5.0]。3.2實(shí)際pcr反應(yīng)用TRIZOL法抽提海馬組織總RNA,海馬組織總RNA的質(zhì)量判斷使用紫外吸收測(cè)定法和變性瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定RNA濃度和純度。合成cDNA,將所有cDNA樣品分別配置Real-timePCR反應(yīng)體系。體系:(1)2×MasterMix5μL、10μmol/L的PCR特異引物0.5μL加水至總體積為8μL,輕彈管底將溶液混合,5000rmin短暫離心。(2)加樣。a.將8μL混合液加到384-PCR板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中;b.再加入對(duì)應(yīng)的2μLcDNA;c.小心粘上SealingFilm封口膜,并短暫離心混合;d.在設(shè)置PCR程序前將準(zhǔn)備好的PCR板放在冰上。(3)將上述384-PCR板置于Real-timePCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃,10min;40個(gè)PCR循環(huán)[95℃,10s;60℃,60s(收集熒光)]。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線,擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,按(95℃,10s;60℃,60s;95℃,15s);并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動(dòng)進(jìn)行,RampRate為2%)。各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RealtimequantitativePCR反應(yīng),見(jiàn)表1。mRNA相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct表示,△Ct=(CtER-CtGAPDH);以A組作為基線,采用以下公式計(jì)算各組ERmRNA表達(dá)差異倍數(shù)(foldschange)=2-△△Ct,其中△△Ct=(CtER-CGAPDH)實(shí)驗(yàn)組-(CtER-CtGAPDH)對(duì)照組。4.數(shù)據(jù)處理組間差異所有數(shù)據(jù)以表示,利用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理組間差異采用方差分析,兩兩比較用最小顯著差異t檢驗(yàn)(LSD-t檢驗(yàn)),以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.馬馬區(qū)雌激素受體的形成2.比較塞爾堡區(qū)的mrna和mrna的比較3.5-ht、i-末年和ne含量的比較圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證相關(guān)因素既往研究表明,無(wú)論是圍絕經(jīng)期綜合征患者還是圍絕經(jīng)期綜合征動(dòng)物模型,不僅體內(nèi)的雌激素水平降低,而且雌激素受體的數(shù)量也有減少。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,在卵巢切除的小鼠中發(fā)現(xiàn)循環(huán)雌激素水平的降低是一個(gè)不可逆的過(guò)程,而雌激素受體的表達(dá)卻呈現(xiàn)一個(gè)可逆的過(guò)程,即隨著循環(huán)雌激素的下降,雌激素受體的表達(dá)首先也會(huì)下降,但是經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后最終又會(huì)上升到正常水平。RomanoTorres等的研究結(jié)果表明,雌激素對(duì)于中年卵巢切除(人類(lèi)絕經(jīng)期的動(dòng)物模型)慢性抑郁模型大鼠具有抗抑郁的作用,雌激素水平下降和孕酮調(diào)節(jié)功能的喪失可能會(huì)導(dǎo)致圍絕經(jīng)期婦女產(chǎn)生心境障礙。此外圍絕經(jīng)期女性的低雌激素血癥及體內(nèi)性腺甾體激素衰退,使中樞和周?chē)膯伟奉?lèi)和鴉片肽類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度發(fā)生變化是導(dǎo)致植物性自主神經(jīng)系統(tǒng)和精神癥狀發(fā)生的基礎(chǔ),是發(fā)生圍絕經(jīng)期綜合征癥狀的基礎(chǔ)。雌激素受體(estrogenreceptor,ER)是雌激素發(fā)揮作用的重要節(jié)點(diǎn)。AliciaA.Walf等的研究結(jié)果提示,雌二醇(estradiol,E2)可能通過(guò)卵巢切除大鼠的海馬區(qū)ERβmRNA發(fā)揮抗焦慮和抗抑郁的作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)ERβ多態(tài)性(rs3020444)與圍絕經(jīng)期綜合征肝氣郁結(jié)證(氣郁證)相關(guān),ERβ-TT基因型可能是圍絕經(jīng)期綜合征氣郁證發(fā)病的易感因素之一。由于雌激素的生物效應(yīng)是由雌激素受體介導(dǎo)完成的,因此有可能雌激素受體的變化影響了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。本研究證實(shí)大鼠海馬區(qū)有雌激素受體的分布,13月齡各組ERαmRNA較育齡空白對(duì)照組表達(dá)減少,而郁證組與對(duì)照組表達(dá)有所減少,郁證組ERβmRNA與對(duì)照組、中藥干預(yù)組相比表達(dá)增多,但沒(méi)有顯著性差異;各組GPR30mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著性差異。雖然ERα、ERβmRNA單個(gè)表達(dá)組間差異不顯著,但是本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了圍絕經(jīng)期綜合征郁證大鼠ERαmRNA/ERβmRNA比值較空白對(duì)照組、對(duì)照組、圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證加中藥組均有顯著性下降,予以中藥干預(yù)后ERαmRNA/ERβmRNA上升,提示圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證的產(chǎn)生有可能并不是單個(gè)ERα、ERβmRNA的表達(dá)變化,而是與其比值有關(guān),因此ERα/ERβ的比例下降可能是圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證的生物學(xué)基礎(chǔ),這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于明確圍絕經(jīng)期肝郁證治療藥物靶點(diǎn)研究有重要意義,即雌激素受體比例ERαmRNA/ERβmRNA變化可以作為肝郁證治療的研究指標(biāo)。本課題組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)膜受體GPR30mRNA變化,是否是因?yàn)槟な荏w參與快速應(yīng)答為主,而郁證變化是一個(gè)慢性改變過(guò)程,其有待進(jìn)一步研究。圍絕經(jīng)期的雌激素改變導(dǎo)致血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量明顯改變。β-END參與垂體促性腺激素的釋放、體溫調(diào)節(jié)以及情緒反應(yīng),它的改變與圍絕經(jīng)期癥狀及其程度密切相關(guān)。研究顯示女性5-HT合成速率較正常男性低52%,間接提示雌激素可以減少5-HT合成。郁證患者普遍存在5-HT、NE、多巴胺(DA)等低下,且在臨床上抗抑郁治療有效的藥物幾乎都能夠增加細(xì)胞突觸間隙5-HT和NE的水平。雌激素受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基底前腦、間腦、中腦、海馬、杏仁體、大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)等位置。但是雌激素通過(guò)哪些核團(tuán)起到抗抑郁作用目前還不明確,海馬是目前研究較深入且與抑郁癥發(fā)病關(guān)系最密切的核團(tuán),抑郁癥患者與正常人相比海馬體積減小。許多研究表明在受到應(yīng)激刺激后海馬介導(dǎo)的行為在不同性別動(dòng)物中的反應(yīng)不同,這些都說(shuō)明海馬可能是雌激素對(duì)抗抑郁癥狀的一個(gè)靶點(diǎn)。本研究證實(shí)海馬區(qū)的5-HT和NE含量在圍絕經(jīng)期肝郁證組顯著下降,經(jīng)治療后5-HT、NE表達(dá)均升高,此結(jié)果與既往研究類(lèi)似,但是β-END的含量各組卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯改變。圍絕經(jīng)期綜合征中醫(yī)稱之為“絕經(jīng)前后諸證”,歷代古籍將其歸于“百合病”、“郁證”、“臟躁”、“崩漏”、“心悸”等范疇。絕經(jīng)本是女子正常的生理現(xiàn)象,正如《黃帝內(nèi)經(jīng)》所云:“七七任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無(wú)子也”。部分婦女不能適應(yīng)這個(gè)階段的生理過(guò)渡,發(fā)生氣機(jī)郁滯,肝失調(diào)達(dá)的圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證候,本課題組的前期研究亦認(rèn)為肝郁是這一時(shí)期的主要矛盾,因此本研究用自然衰老和慢性束縛大鼠模型較好地模擬了這特定時(shí)期的郁證表現(xiàn),且經(jīng)柴胡疏肝散“以方測(cè)證”的方法證實(shí)了這一理論。以方測(cè)證法廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)方證認(rèn)識(shí)和現(xiàn)代證候研究,其邏輯基礎(chǔ)源于《傷寒論》的“方證相應(yīng)”。本研究中筆者以“以方測(cè)證”方法證明圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證系列的神經(jīng)心理變化的生物學(xué)基礎(chǔ)有可能在于雌激素波動(dòng)影響海馬區(qū)ERαmRNA/ERβmRNA表達(dá),引起神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE變化,卻沒(méi)有出現(xiàn)肽類(lèi)遞質(zhì)β-END的改變,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往研究不同。既往研究圍絕經(jīng)期綜合征多數(shù)選用去勢(shì)大鼠造模,而本研究選用的是自然衰老的大鼠,較前者更能模擬女性自然的生理變化過(guò)程,這也許是結(jié)果異于以往研究的原因之一。見(jiàn)圖1-圖3。用Real-timePCR檢測(cè)圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證大鼠海馬雌激素受體的mRNA表達(dá)。ERαmRNA表達(dá)B、D、E組較A組減少,有顯著性差異(P<0.01),E組與D組比較,表達(dá)有所減少,但沒(méi)有顯著性差異;ERβmRNA表達(dá)E組與B、C、D組相比增多,但沒(méi)有顯著性差異;各
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