迎紅杜鵑花色素組成及含量的測(cè)定

迎紅杜鵑花色素組成及含量的測(cè)定

紅景天開(kāi)花的玫瑰。在早春之前，葉片開(kāi)放，耐寒性強(qiáng)，可以在北方裸露地種植。但花色單一,限制了其在園林中的應(yīng)用。花色測(cè)定和花色素組成分析有助于闡明其花色形成機(jī)理,也是進(jìn)行杜鵑新花色育種的依據(jù)之一,而目前未見(jiàn)對(duì)迎紅杜鵑的花色和花色素組成的研究報(bào)道。根據(jù)對(duì)杜鵑屬其它植物花色的研究,少數(shù)野生種和栽培品種的花中檢測(cè)到的花青苷元有:矢車(chē)菊素(Cyanidin,簡(jiǎn)稱(chēng)Cy)、飛燕草素(Delphinidin,簡(jiǎn)稱(chēng)Dp)、芍藥花素(Peonidin,簡(jiǎn)稱(chēng)Pn)、錦葵素(Malvidin,簡(jiǎn)稱(chēng)Mv)、矮牽牛素(Petunidin)。它們通常以3-葡萄糖苷、3-半乳糖苷、3-阿拉伯糖苷、3,5-二葡萄糖苷和3-半乳糖苷-5-葡萄糖苷等形式存在,有時(shí)被咖啡酸等?；?Harborne,1962;deLoose,1970;Hayashi,1988)。主要的類(lèi)黃酮成分是黃酮醇:楊梅黃素(Myricetin,簡(jiǎn)稱(chēng)My)、槲皮素(Quercetin,簡(jiǎn)稱(chēng)Qu)和山奈酚(Kaempferol,簡(jiǎn)稱(chēng)Km)及這3種黃酮醇的5-O-甲基化衍生物。黃酮醇通常以3-半乳糖苷、3-鼠李糖苷和3-蕓香糖苷等形式存在(Harborne,1962;deLoose,1970;Swaroopetal.,2005)。6-OH-槲皮素3-半乳糖苷則是杜鵑屬花的主要黃色色素(Harborne,1965),β-胡蘿卜素又是深黃色花R.japonicumf.flavum的主要色素(Miyajimaetal.,2000)。作者利用高效液相色譜—光電二極管陣列檢測(cè)技術(shù)(HPLC-PAD)及高效液相色譜—電噴霧離子化—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-MS),分析了迎紅杜鵑的花色素成分,調(diào)查了其在開(kāi)花過(guò)程中的變化,并在此基礎(chǔ)上探討了杜鵑新花色育種的目標(biāo)及策略。1材料和方法1.1物研究院北京植物園迎紅杜鵑新鮮花瓣于2007年3月下旬至4月上旬采自中國(guó)科學(xué)院植物研究所北京植物園。選取5株生長(zhǎng)環(huán)境相同、長(zhǎng)勢(shì)一致、花蕾數(shù)多的植株,依次采集小蕾期、大蕾期、初開(kāi)期、半開(kāi)期、全開(kāi)期和末花期6個(gè)開(kāi)花階段的花瓣,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)色,然后用液氮磨碎,直接提取色素。1.2與新鮮花的制備采用英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡(RoyalHorticulturalSocietyColourChart,簡(jiǎn)稱(chēng)RHSCC)與新鮮花瓣中間部分花色進(jìn)行對(duì)比。參照Z(yǔ)hang等(2007)的方法用NF333型分光色差計(jì)(日本電色工業(yè)株式會(huì)社),測(cè)定花色的明度L*值、色相a*、b*值,并計(jì)算彩度C*和色相角h,重復(fù)測(cè)定5次。1.3花卉提取與hplc-pi和hplc-esi-ms的分析1.3.1提取方法的改進(jìn)新鮮花瓣用液氮磨碎,參照Z(yǔ)hang等(2007)的提取方法并稍有改進(jìn):每隔12h振蕩1次。色素抽提液保存在-20℃冰箱中,用于花色素的HPLC-PAD分析及黃酮醇的HPLC-ESI-MS分析。1.3.2花青苷的提取參照Pomar等(2005)的方法稍做改進(jìn):4℃冰箱中浸提過(guò)夜,30℃旋轉(zhuǎn)蒸干,2%甲酸水溶液溶解殘留物,乙酸乙酯萃取除去黃酮醇。溶于水相的花青苷濃縮后用Envi-18C18SPE萃取小柱吸附(上海安譜科學(xué)儀器有限公司,規(guī)格:500mg/3mL),2%甲酸水溶液洗脫除雜。純化后的花青苷混合物樣品,保存在-20℃冰箱中用于HPLC-ESI-MS分析。1.3.3高效液相色譜法經(jīng)1.3.1準(zhǔn)備的色素抽提液樣品用DionexHPLC-PAD系統(tǒng)分析。分析條件:色譜柱:TSKgelODS-80TsQA,4.6mm(內(nèi)徑)×150mm(長(zhǎng))(日本Tosoh株式會(huì)社)。流速0.8mL·min-1,柱溫40℃,進(jìn)樣體積10μL。檢測(cè)波長(zhǎng):520nm(花青苷)和350nm(黃酮醇),200～800nm范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描吸收光譜。流動(dòng)相參考Fossen和Andersen(1998)的文獻(xiàn)。洗脫程序:0min,16%B;30min,35%B;38min,43%B;45min,57%B。采用Agilent1100LC/MSDTrapVL液—質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行HPLC-ESI-MS分析。液相色譜分析條件:色譜柱、流速、進(jìn)樣體積和檢測(cè)波長(zhǎng)同上,柱溫35℃。流動(dòng)相參考Macz-Pop等(2006)的文獻(xiàn),并稍有改進(jìn),B液:甲醇?；ㄇ嘬障疵摮绦?0min,22%B;25min,36%B;35min,55%B;黃酮醇洗脫程序:0min,22%B;40min,47%B。質(zhì)譜分析條件:電噴霧離子化(ESI),離子阱分析器,正離子檢測(cè)模式,全離子掃描范圍(m/z):100～1000;CID裂解能量30%,選擇離子檢測(cè)(SIM)方式監(jiān)測(cè)選定離子的MS2碎片。1.4總黃酮醇含量用HPLC法測(cè)定,分析條件同1.3.3。分別以520nm和350nm同時(shí)檢測(cè)總花青苷含量(totalanthocyanins,TA)和總黃酮醇含量(totalflavonols,TF)。采用標(biāo)準(zhǔn)品半定量法分別計(jì)算每100mg新鮮花瓣中含有的,相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品錦葵素3,5-二葡萄糖苷(Mv3G5G,法國(guó)Extrasynthese公司)和蘆丁(槲皮素3-蕓香糖苷,中國(guó)藥品生物制品檢定所)的TA和TF(%),重復(fù)5次。并據(jù)公式CI=TF/TA計(jì)算輔助色素效應(yīng)指數(shù)(CI)(Zhangetal.,2007)。1.5數(shù)據(jù)處理與分析應(yīng)用MicrosoftOfficeExcel2003及Origin7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及作圖,用SPSS11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1花鏡花鏡結(jié)果根據(jù)花色測(cè)定結(jié)果(表1),迎紅杜鵑開(kāi)花過(guò)程中花色的RHSCC值從小蕾期的70B(red-purple組)變到末花期的84B(violet組)?；ㄉ珡睦倨诘匠蹰_(kāi)期變化較明顯,之后未見(jiàn)明顯變化,總體上在開(kāi)花過(guò)程中由紅紫逐漸變?yōu)榈霞t色?；ㄉ贑IEL*a*b*表色系統(tǒng)坐標(biāo)系上的分布:a*值由28.43變?yōu)?7.27,b*值從-6.96變到-10.66,L*值從31.87變到51.94,h由-13.70°變?yōu)?31.81°,表明在開(kāi)花過(guò)程中,花色的紅色調(diào)減退,藍(lán)色調(diào)增強(qiáng),明度增加,彩度變小,與肉眼觀(guān)察結(jié)果一致。經(jīng)ANOVA分析,不同開(kāi)花階段的花色參數(shù)(L*、a*、b*、C*、h)差異極顯著。2.2質(zhì)譜及質(zhì)譜特征共檢測(cè)到了5種花青苷(圖1,A)、8種黃酮醇和2種芳香酸成分(圖1,B)。各個(gè)組分的推定結(jié)果根據(jù)與相應(yīng)引用的參考文獻(xiàn)的紫外—可見(jiàn)吸收光譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較得出(表2)。由于某些成分的含量極其微量,故未進(jìn)行結(jié)構(gòu)推定。在520nm下檢測(cè)到5個(gè)花青苷色譜峰,即a1～a5。與牡丹的6種花青苷的可信對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)品Mv3G5G相比較,在迎紅杜鵑花中未檢測(cè)到Pg型色素,可能含有Cy和(或)Pn型以及Mv型花青苷,但沒(méi)有與牡丹相同的花青苷(Wangetal.,2001)。各組分在440nm與λvis-max兩處的吸光值之比A440/Avis-max分別為19.0%(a1)、15.9%(a2)、29.8%(a3)、17.2%(a4)和14.7%(a5),a1和a3的花青苷元3位上,以及a2、a4和a5的花青苷元5位上可能發(fā)生了糖苷化(Harborne,1958)。且a1～a5在紫外290～340nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)特征吸收峰,表明無(wú)芳香酸?；?Fossen&Andersen,1998)。色譜圖中的主峰a5經(jīng)一級(jí)質(zhì)譜分析得到分子離子m/z625.2([M]+),二級(jí)質(zhì)譜中釋放出的碎片離子m/z331.1([Y0]+),為Mv苷元的特征質(zhì)荷比;m/z493.2與錦葵素己糖苷一致,m/z463.2與錦葵素戊糖苷一致。依據(jù)文獻(xiàn)(deLoose,1969,1970),杜鵑屬花中含有錦葵素3,5-二葡萄糖苷及其咖啡酸酰化產(chǎn)物,且映山紅(R.simssi)雜交品種‘RedWing’含有矢車(chē)菊素3-阿拉伯糖苷-5-葡萄糖苷(Asen&Budin,1966),結(jié)合對(duì)照Mv3G5G的紫外吸收數(shù)據(jù),推測(cè)a5Mv的3位、5位上均有單糖取代,推定a5為錦葵素3-阿拉伯糖苷-5-葡萄糖苷。在350nm下檢測(cè)到8個(gè)黃酮醇色譜峰,即f1～f8。組分f1和f2的二級(jí)質(zhì)譜碎片均有m/z319.1([Y0+H]+),與苷元My一致,為My的衍生物。糖苷鍵斷裂得到的糖基離子分別為m/z162和m/z146。根據(jù)Harborne和Williams(1971)以及Chosson等(1998)文獻(xiàn),推定f1為楊梅黃素3-半乳糖苷,f2為楊梅黃素3-鼠李糖苷。組分f3～f6的二級(jí)質(zhì)譜碎片均有m/z303.1([Y0+H]+),與苷元Qu一致,為Qu的衍生物。f3～f5的紫外吸收特征與蘆丁極為相似,為槲皮素的3-糖苷。f3和f4質(zhì)譜中釋放的糖基離子均為m/z162,依據(jù)Cuyckens和Claeys(2004)的文獻(xiàn),推定f3為槲皮素3-半乳糖苷(Harborne,1962),f4為槲皮素3-葡萄糖苷(Harborne,1986)。f5和f6的糖基離子均為m/z146,推定為槲皮素的鼠李糖苷,其中f5為槲皮素3-鼠李糖苷(Harborne,1962;Swiderskietal.,2004)。組分f7質(zhì)譜碎片m/z287.1([Y0+H]+)與黃酮醇Km和黃酮木犀草素(Luteolin,簡(jiǎn)稱(chēng)Lu)一致。根據(jù)紫外吸收帶Ⅱ的λmax,Km及其糖苷大多在265nm左右,Lu及其糖苷大多在255nm左右(中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所,1981),并參考文獻(xiàn)(Harborne,1986),推定f7為山奈酚3-鼠李糖苷。以可信的金銀花提取液為對(duì)照樣品,組分1的HPLC保留時(shí)間和紫外吸收數(shù)據(jù)與金銀花中的綠原酸成分一致。根據(jù)Jin等(2005)的文獻(xiàn),推定1為綠原酸,2為其異構(gòu)體。組分1和2在計(jì)算TF時(shí)未予以考慮。2.3開(kāi)放后ta、tf的變化在開(kāi)花過(guò)程中,花色素的總量TA、TF以及輔助色素效應(yīng)指數(shù)CI從小蕾期到初開(kāi)期下降幅度較大,花朵開(kāi)放后變化幅度較小(圖2)。各開(kāi)花階段的TA、TF差異極顯著(P<0.01),并呈極顯著相關(guān)(r=0.914,P<0.01),黃酮醇可能作為輔助色素與TA共同形成迎紅杜鵑的淡紫紅色。因此,在開(kāi)花過(guò)程中,迎紅杜鵑花色明度增加,彩度變淡的變化,與花色素總量減少、輔助色素效應(yīng)指數(shù)降低有關(guān)。3討論3.1迎紅松茸黃酮醇類(lèi)植物種及分類(lèi)標(biāo)識(shí)迎紅杜鵑的花青苷主要為錦葵素3-阿拉伯糖苷-5-葡萄糖苷(相對(duì)含量在70%以上),是形成淡紫紅花色的主要色素。杜鵑屬其它植物中,紫色花中也以Mv型色素為主(Harnorne,1962;deLoose,1969,1978)。迎紅杜鵑黃酮醇類(lèi)成分與同屬其它植物也很相似,主要為My、Qu、Km型糖苷。其中Qu糖苷是杜鵑花中廣泛存在的黃酮醇(Harborne,1971),其次是My糖苷,為Mv糖苷的輔助色素(Heursel,1981);Km糖苷僅存于少數(shù)紫色花中(deLoose,1969)。在杜鵑屬花中存在5-O-甲基化黃酮醇類(lèi)物質(zhì),已從白花杜鵑(R.mucronatum)、腋花杜鵑(R.racemosum)等幾十個(gè)種中分離到(Harborne,1971)。此類(lèi)化合物作為化學(xué)分類(lèi)標(biāo)識(shí),可反映杜鵑花科和亞科水平上的差異(Harborne,1969)。迎紅杜鵑花中未檢測(cè)到此類(lèi)化合物,推測(cè)其遺傳背景與含有5-O-甲基化黃酮醇的種間差異較大。3.2草原龍膽花粉eidom迎紅杜鵑的花色素合成在花朵開(kāi)放之前就已達(dá)到最高峰,其后花色素的降解或濃度降低都可能導(dǎo)致花色變淡。本研究中小蕾期的TA和TF在整個(gè)開(kāi)花過(guò)程中均是最大的。草原龍膽(Eustomagrandiflorum)也有類(lèi)似現(xiàn)象,為了避免紫外輻射對(duì)細(xì)胞的毒害,其TF合成量在花朵滿(mǎn)開(kāi)之前即達(dá)到最大,隨后成熟和老化的花瓣中發(fā)生色素合成量減少和/或降解增加(Uddinetal.,2002)。要了解迎紅杜鵑花色素在花瓣中的積累過(guò)程,需要對(duì)從花芽形成開(kāi)始到小蕾期之間的色素量的變化進(jìn)行深入研究。3.3花青苷和黃酮醇配比對(duì)第二花品質(zhì)的影響為了豐富北京早春的杜鵑花色,需要選育既耐寒又具有其它花色的新品種。目前迎紅杜鵑的花色育種目標(biāo)應(yīng)該是努力擴(kuò)大其花色變異。如果能保持迎紅杜鵑本身耐寒性強(qiáng)、適中性稍耐弱堿性(pH7.3～8.2)的優(yōu)勢(shì)(陳有民等,1992),再引入具有其它花色的同屬植物的種質(zhì),將有望擴(kuò)大以迎紅杜鵑為基礎(chǔ)的北方耐寒杜鵑的花色變異。根據(jù)花色素組成,迎紅杜鵑花色育種可向兩個(gè)方向進(jìn)行:紅色調(diào)和藍(lán)色調(diào)花色的育種。雜交育種雖不能產(chǎn)生色調(diào)迥異的新花色,但可以產(chǎn)生較大的花色變異(Heursel,1981)。且杜鵑屬植物具有豐富的紅色花種質(zhì)資源,通過(guò)種間雜交有希望獲得理想的新品種。紅色杜鵑花中以Cy型色素為主(Harborne,1962;Asen&Budin,1966;deLoose,1969,1970),若育紅色花品種,需要使花瓣中富集Cy和(或)Pg型色素,同時(shí)減少M(fèi)v的含量?？蛇x擇富含Cy型色素的種,如映山紅(R.simsii)、半圓葉杜鵑(R.thomsonii)、皋月杜鵑(R.indicum)等,或品種如R.simsiicv.‘RedWing’等作為親本與迎紅杜鵑雜交,并借助生物技術(shù)克服屬內(nèi)雜交不親和性障礙(Heursel,1981;deSchepperetal.,2001)。值得注意的是,迎紅杜鵑含有黃酮醇My和花青素