荷瘤小鼠證候及其演變的研究

荷瘤小鼠證候及其演變的研究

辨證論治是幾千年來(lái)中醫(yī)藥管理經(jīng)驗(yàn)和理論的高度概括。“同時(shí)疾病和不同的疾病”和“同時(shí)疾病和不同的疾病”的治療效果在現(xiàn)代臨床上得到了反復(fù)證實(shí)。病證結(jié)合基礎(chǔ)研究主要采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,對(duì)于如何判斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的證候,尤其是疾病動(dòng)物的證候,以及評(píng)價(jià)其療效,以往主要采取三種方式:①以方測(cè)證;②微觀辨證(即引用臨床或?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)的與證候有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo));③疾病、證候疊加造模。在取得積極進(jìn)展的同時(shí),其局限性妨礙了其推廣與應(yīng)用。長(zhǎng)期以來(lái),我們和國(guó)內(nèi)許多學(xué)者一再觀察到,疾病大鼠、小鼠存在證候和證候的演變,正常大鼠、小鼠存在體質(zhì)差異。因此,我們提出基于“四診”的小鼠辨證論治假說(shuō)[1~2],并開展了多年的探索[3~16],創(chuàng)建了實(shí)驗(yàn)小鼠四診與辨證方法學(xué),以及小鼠四診采集項(xiàng)目、小鼠四診工作站及操作、小鼠常見(jiàn)證候辨證等系列標(biāo)準(zhǔn)[17~19]。最近,我們采用以上方法,在腫瘤的中藥復(fù)方療效評(píng)價(jià)中成功地運(yùn)用,并有所發(fā)現(xiàn)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心KM品系小鼠120只,雄性,體重17~24g,購(gòu)自上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):KM,SCXK(滬)2002-0002。清潔級(jí)條件下常規(guī)飼養(yǎng),腹水傳代肝癌H22細(xì)胞右腋下接種0.2ml(含瘤細(xì)胞數(shù)8×106個(gè))。1.2中藥復(fù)方組模擬組接種后第5d選出瘤體大小適中的小鼠90只(其余淘汰),隨機(jī)分為10組:正常對(duì)照組(甲)、模型對(duì)照組(乙)及8個(gè)不同中藥復(fù)方組,每組10只。中藥復(fù)方來(lái)自國(guó)內(nèi)公開報(bào)道的處方,分別標(biāo)記為丙、丁、戊、己、庚、辛、壬、癸,并于當(dāng)天用藥。中藥采用標(biāo)準(zhǔn)水煎醇沉工藝,劑量為正常成人每公斤體重的10倍。每組小鼠每日灌胃0.5ml,正常組及模型組灌等量自來(lái)水。常規(guī)飼養(yǎng)。1.3abb/gca的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)采集體重、腋溫(℃)、爪和尾顯微數(shù)碼拍照(計(jì)算機(jī)圖像處理,提取反映紅色程度的r值)、晚間35s曠場(chǎng)自主活動(dòng)計(jì)數(shù)(跨格數(shù)的水平移動(dòng)、前肢離地?cái)?shù)的垂直移動(dòng))、瘤體積(cm3,計(jì)算公式:abb/2,a代表腫瘤的長(zhǎng)徑,b代表腫瘤的短徑)、估算瘤重(g,瘤重=瘤體積)、生存時(shí)間。具體設(shè)備與方法參照有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[17~19]。1.4擴(kuò)大組見(jiàn)表1基于實(shí)測(cè)值的嘴唇r校正①腋溫校正=初次正常組腋溫均數(shù)/本次正常組腋溫均數(shù)×各樣本實(shí)測(cè)值;②爪r校正=初次正常組爪r均數(shù)/本次正常組爪r均數(shù)×各樣本實(shí)測(cè)值;③尾r校正=初次正常組尾r均數(shù)/本次正常組尾r均數(shù)×各樣本實(shí)測(cè)值。1.5體重、濃度及生化指標(biāo)①痰瘀邪盛=各小鼠瘤重/所有小鼠瘤重均數(shù)。>1.5為邪毒甚,>2為邪毒壅盛;<0.75為邪較弱,<0.5為邪弱。②陰虛程度=各小鼠正?；蛉チ鲶w重/正常組體重均值。<0.9為陰偏虛,<0.8為陰虛。③氣虛程度=各小鼠水平移動(dòng)數(shù)/正常均數(shù)×0.6+各小鼠垂直移動(dòng)數(shù)/正常均數(shù)×0.4。>1.5為氣盛,<0.5為氣虛。④陽(yáng)熱程度=各小鼠校正腋溫/正常組均數(shù)×0.3+各小鼠爪校正r/正常組爪r均數(shù)×0.5+各小鼠尾校正r/正常組尾r均數(shù)×0.2。>1.02為陽(yáng)偏盛,<0.98陽(yáng)偏虛,<0.95陽(yáng)虛。(5)陽(yáng)氣虛程度=氣虛程度×0.2+陽(yáng)虛程度×0.8。>1.1為陽(yáng)氣盛,<0.85為陽(yáng)氣虛。1.6統(tǒng)計(jì)方法2結(jié)果2.1小鼠自主活動(dòng)減少①總體上,荷瘤小鼠腫瘤體積呈持續(xù)增長(zhǎng);去瘤體重呈拋物線狀,中晚期增長(zhǎng)平緩(圖1,圖2)。②荷瘤小鼠好奇和自主活動(dòng)持續(xù)下降,曠場(chǎng)檢測(cè)小鼠水平和垂直運(yùn)動(dòng)減少(圖3)。③荷瘤小鼠腋溫持續(xù)下降,下降幅度大,嚴(yán)重時(shí)降幅達(dá)9%(圖4)。④荷瘤小鼠爪、尾顏色變淡,反映紅色程度的r值下降。其中爪r的變化顯著,嚴(yán)重時(shí)降幅達(dá)9.2%(圖5)。⑤荷瘤小鼠帶瘤生存時(shí)間如圖6,圖中所見(jiàn),代號(hào)為壬、辛、癸等的中藥復(fù)方療效較好。2.2不同階段的紅足虱綜合征2.2.1增長(zhǎng)迅速者早期偏多腫瘤增長(zhǎng)的快慢標(biāo)志著邪毒的盛衰。荷瘤小鼠腫瘤增長(zhǎng)迅速者早期偏多,以后逐漸減少;腫瘤增長(zhǎng)緩慢者所占比例逐漸增加,可能與存活時(shí)間較長(zhǎng)的小鼠腫瘤細(xì)胞增生不活躍和體質(zhì)較好有關(guān)(圖7)。2.2.2中期、晚期、期期7d與人類類似,隨著病情的發(fā)展,荷瘤小鼠虛證出現(xiàn)的頻率增加(為簡(jiǎn)捷明了,合并陰虛含陰偏虛、陽(yáng)虛含陽(yáng)偏虛、陽(yáng)氣虛含陽(yáng)氣偏虛);從不同虛證的程度看,氣虛的程度最嚴(yán)重,其次是陽(yáng)氣虛。陽(yáng)虛恒定,但幅度小,陰虛則不一致,推測(cè)與實(shí)驗(yàn)后期所存活動(dòng)物體質(zhì)相對(duì)較好有關(guān)(圖8、9)。研究發(fā)現(xiàn):①接種后的第7d,證候以邪毒為主,虛證無(wú)證可辨接近半數(shù),虛證以單證居多。②接種后的第14d,總體進(jìn)入中期,邪毒已不是重點(diǎn),腫瘤體積居中的增加,并保持下去。陰虛和偏陰虛占16%,明顯增加;氣虛比例也顯著上升;陽(yáng)偏虛、陽(yáng)虛的比例大幅上升,并均保持下去。對(duì)于陽(yáng)虛如此高發(fā),以往未見(jiàn)報(bào)道,可能是小鼠的特點(diǎn)。該階段死亡以陽(yáng)氣虛為主要原因,因此,扶持陽(yáng)氣十分必要。此時(shí)陰虛多為氣陰兩虛、陰陽(yáng)兩虛,僅1例為單純陰虛。③第18d,邪毒大多不甚;陽(yáng)虛比例下降,可能與剩余動(dòng)物體質(zhì)較好有關(guān);該階段,單純陰虛出現(xiàn)3例,有所增加。④第21d,該階段小鼠出現(xiàn)大量死亡,集中在陽(yáng)氣虛、陰陽(yáng)兩虛。由于陽(yáng)虛普遍發(fā)生,已無(wú)單純的陰虛。⑤第25d,已進(jìn)入晚期,該階段小鼠出現(xiàn)大量死亡,集中在陽(yáng)氣虛、陰陽(yáng)兩虛。⑥第28d,該階段小鼠出現(xiàn)大量死亡,集中在陽(yáng)氣虛。提示,晚期保護(hù)陽(yáng)氣的重要性。⑦第32d,陽(yáng)虛減少,而陽(yáng)氣虛增加,提示氣虛程度的嚴(yán)重。2.2.3趨勢(shì)和憑證組合與人類類似,隨著病情的發(fā)展,荷瘤小鼠虛證兼證的比例增加。趨勢(shì)是無(wú)證可辨的數(shù)量和比例下降,單證的數(shù)量和比例下降;兩證組合變化不大;而3個(gè)兼證組合者顯著增加,四證組合從無(wú)到有,有增加趨勢(shì)(圖10)。2.3般性格狀態(tài)第1次不同組別小鼠的證候改變是不是標(biāo)準(zhǔn)偏差所造成的?同樣標(biāo)準(zhǔn)下,正常小鼠證候表現(xiàn)如何?歷次檢測(cè)后辨證結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可見(jiàn):①小鼠1號(hào),早期出現(xiàn)2次氣盛/陽(yáng)偏盛/陽(yáng)氣盛,中間出現(xiàn)1次氣虛/陽(yáng)氣虛,以后均正常。小鼠3號(hào),早期出現(xiàn)1次偏陰虛,中間出現(xiàn)1次陽(yáng)偏虛,其余正常。這2只小鼠可能存在性格波動(dòng),或興奮,或壓抑。②小鼠4、8號(hào),前3~4輪一致出現(xiàn)氣盛/陽(yáng)盛/陽(yáng)氣盛,以后正常?？赡軐儆谀欠N早期興奮,以后失去新鮮感者。小鼠5、7、9號(hào),中間出現(xiàn)1~2次氣盛/陽(yáng)盛/陽(yáng)氣盛,其余正常?？赡軐儆谀欠N偶爾興奮一次的。小鼠2、6、10號(hào),中間出現(xiàn)1次氣虛/陽(yáng)偏虛/陽(yáng)氣虛,其余正常。這8只小鼠可能存在一定的體質(zhì)差異,尤其是4、8號(hào)小鼠,體質(zhì)偏熱。③最后兩次檢查各小鼠均在正常范圍,提示隨著飼養(yǎng)延長(zhǎng),小鼠逐漸適應(yīng),體質(zhì)和性格趨同。以上結(jié)果與荷瘤小鼠證候持續(xù)發(fā)展形成了鮮明的反差,表明本實(shí)驗(yàn)四診和證候數(shù)據(jù)是客觀的,是可以真實(shí)反映證候及其演變的。2.4痰瘀邪盛證候與預(yù)后的關(guān)系是否能在荷瘤小鼠出瘤的早期,依據(jù)其證候或體質(zhì),判斷其預(yù)后?我們求出同一日死亡小鼠不同證候的權(quán)重平均值,與生存天數(shù)比較。其中痰瘀邪盛程度與預(yù)后的相關(guān)系數(shù)為-0.539,P=0.01,具有統(tǒng)計(jì)意義,提示荷瘤小鼠早期腫瘤增長(zhǎng)迅速者,預(yù)后差(圖11)。陰虛程度與預(yù)后的相關(guān)系數(shù)為-0.316,P=0.15,提示早期陰盛(主要由瘤重疊加所致)預(yù)后不佳(圖12)。氣虛程度與預(yù)后的相關(guān)系數(shù)為0.275,P=0.21,提示早期氣虛程度嚴(yán)重者,預(yù)后較差(圖13)。陽(yáng)虛程度與預(yù)后的相關(guān)系數(shù)為0.236,P=0.29,提示早期陽(yáng)虛程度嚴(yán)重者,預(yù)后較差(圖14)。陽(yáng)氣虛程度與預(yù)后的相關(guān)系數(shù)為0.287,P=0.19,提示早期陽(yáng)氣虛程度嚴(yán)重者,預(yù)后較差(圖15)。從以上結(jié)果可見(jiàn):①早期腫瘤增長(zhǎng)迅速,體積大,邪毒壅盛者,預(yù)后不良。這是決定預(yù)后的主要原因。②早期氣盛略優(yōu)于氣虛,陽(yáng)氣盛略優(yōu)于陽(yáng)氣虛。此外,我們還觀察到:實(shí)驗(yàn)中,腋溫下降、體重持平和下降是預(yù)后差的重要標(biāo)志。一旦腋溫或體重下降,多瀕臨死亡。與陽(yáng)氣衰竭、陰虛液脫類似?？傊?痰瘀邪盛證候與預(yù)后的關(guān)系最為密切,痰瘀邪盛證候越重,其生存期越短。其次與預(yù)后有關(guān)的證候依照密切程度為陽(yáng)氣虛、氣虛、陽(yáng)虛。2.5病料中的制劑的選擇依據(jù)荷瘤小鼠虛證復(fù)雜和嚴(yán)重程度,以及生存天數(shù),總體上癸、己、庚、辛等4張?zhí)幏蒋熜л^好,而丙、丁、戊、壬4張?zhí)幏蒋熜л^差。這些療效較好的處方主要包括清熱解毒、健脾益氣、養(yǎng)陰、行氣破血活血和化痰等治法;藥物涉及半枝蓮、白花蛇舌草、鐵樹葉、石見(jiàn)穿、生山梔,生地黃、山萸肉、炙鱉甲,黨參、黃芪、白術(shù)、甘草、淮山藥、紅棗,炒白芍、當(dāng)歸、三棱、莪術(shù)、五靈脂、牡丹皮、雞內(nèi)金,炒枳實(shí)、香附、木香、升麻、柴胡,半夏、陳皮、茯苓、生薏苡等。那么以上療效的取得,單純?nèi)Q于處方,還是由于分組偏倚,尤其是那些早期邪毒壅盛證候的小鼠分配到那些療效不好的組別中所造成的?我們把療效較差的丙、丁、戊、壬4張?zhí)幏浇M別合并,把療效較好的癸、己、庚、辛等4張?zhí)幏浇M別合并,與模型和正常對(duì)照。結(jié)果如下。2.5.1組不同偏倚造成療效差異的原因如圖16所示,療效較差的4個(gè)組別,早期腫瘤邪毒壅盛,因而其療效差異的主要原因可能是分組偏倚所造成的。鑒于第一次檢查是在用藥后第2天,所以其差異可能還與不同處方療效有一定的聯(lián)系。2.5.2氣孔虛早期不同組別的陰虛、氣虛、陽(yáng)虛、陽(yáng)氣虛程度類似,以后逐漸有了差別。這種差別可能是腫瘤自然發(fā)生的,也可能受到了藥物影響(圖17~20)。3結(jié)論3.1不同日期檢測(cè)結(jié)果腋溫、爪尾顯微照片雖然采用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)和拍攝,但由于受到設(shè)備、環(huán)境等因素的影響,不同日期檢測(cè)得到的數(shù)據(jù),在所有組別出現(xiàn)了一致的波動(dòng),或偏高或偏低。為了前后比較,一律采用初次正常組均數(shù)校正。3.2職業(yè)性狀的證候分析①中醫(yī)學(xué)通常把腫瘤病機(jī)歸結(jié)為痰瘀毒。邪毒盛則增長(zhǎng)迅速,因此依據(jù)腫瘤體積大小,劃分為邪毒壅盛(為所有腫瘤體積均數(shù)的2倍)、邪毒甚(1.5倍)、居中,邪較弱(0.75倍)和邪弱(0.5倍),反映邪氣盛衰。②陰虛主要表現(xiàn)為形質(zhì)減少,例如消瘦、脈細(xì)、剝苔等,一旦兼見(jiàn)氣虛、陽(yáng)虛,熱象往往不顯著。鑒于此,我們把正?；蛉チ鲶w重/正常組體重均值,<0.9計(jì)為陰偏虛,<0.8計(jì)為陰虛。③氣虛的重要標(biāo)志是乏力,突出表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)減少。小鼠曠場(chǎng)移動(dòng)是很好的檢測(cè)方法。在曠場(chǎng)中,小鼠表現(xiàn)為水平移動(dòng),以及直立兩種主要運(yùn)動(dòng)方式。相比之下,水平移動(dòng)區(qū)域廣,差別大。因此我們?nèi)「餍∈笏揭苿?dòng)格數(shù)/正常移動(dòng)均數(shù)×0.6+各小鼠抬頭起立數(shù)/正常均數(shù)×0.4,與正常組均數(shù)相比,>1.5計(jì)為氣盛,<0.5計(jì)為氣虛。④陽(yáng)熱盛衰的重要標(biāo)志包括體溫和體表顏色,陽(yáng)熱盛往往表現(xiàn)為體表溫度高、面紅目赤。從小鼠爪、尾標(biāo)準(zhǔn)攝像中,可以提取反映紅色程度的r值,r值愈高表示爪愈紅。鑒于小鼠腋溫波動(dòng)較大,以及爪反映紅色的程度和靈敏度優(yōu)于尾,我們采用各樣本校正腋溫/正常均數(shù)×0.3+各樣本爪校正r/正常爪r均數(shù)×0.5+各樣本尾校正r/正常尾r均數(shù)×0.2的運(yùn)算公式,求出各小鼠的陽(yáng)熱指數(shù),并依據(jù)數(shù)據(jù)分布,初步設(shè)定為>1.02為陽(yáng)偏盛,<0.98陽(yáng)偏虛,<0.95陽(yáng)虛。⑤陽(yáng)氣集中代表了氣和陽(yáng)的綜合特征。鑒于小鼠曠場(chǎng)移動(dòng)頻率波動(dòng)較大,我們采用氣虛程度×0.2+陽(yáng)虛程度×0.8來(lái)綜合反映陽(yáng)氣盛衰程度,與正常組均數(shù)相比,>1.1為陽(yáng)氣盛,<0.85為陽(yáng)氣虛。以上證候閾值的確定,是參照臨床特點(diǎn)和實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)分析后作出的。至于如何驗(yàn)證和獲得最佳閾值,需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但是,作為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),這樣的閾值對(duì)所有小鼠是一致的,因而是可以比較的。3.3不同節(jié)點(diǎn)的治療①荷瘤小鼠氣虛的程度最嚴(yán)重。②荷瘤小鼠腋溫逐漸下降,類似的爪、尾紅色程度一致下降,表明荷瘤小鼠具有典型的陽(yáng)虛證候,并成為該病的主要證候之一。③腫瘤邪毒證候貫穿始終。其程度早期差異大,腫瘤增長(zhǎng)或快或慢,以后逐漸趨同,增長(zhǎng)緩慢的個(gè)體比例逐漸增加,這可能與存活時(shí)間長(zhǎng)的小鼠腫瘤細(xì)胞的不活躍和體質(zhì)較好有關(guān)。因此,早、中、晚不同節(jié)點(diǎn)的治法應(yīng)有所區(qū)別。④荷瘤小鼠的兼證和證候演變與人類類似,隨著病情的發(fā)展,兼證的比例增加;趨勢(shì)是無(wú)證可辨、單證數(shù)量和比例下降,復(fù)合證顯著增加。⑤通過(guò)對(duì)正常小鼠證候觀察,表明正常小鼠存在一定的體質(zhì)差異,而歷次檢測(cè),所獲得數(shù)據(jù)基本是穩(wěn)定的,集中在正常范圍之內(nèi),提示我們所建立的工作站和方法、標(biāo)準(zhǔn)是可行的,也是可以真實(shí)反映證候及其演變的。3.4荷蘭瘤鼠的預(yù)后3.5診檢測(cè)指標(biāo)的發(fā)展是前提①在小鼠證候采集中,首次采用了標(biāo)準(zhǔn)化的四診檢測(cè)技術(shù),所有指標(biāo)實(shí)現(xiàn)了計(jì)量化、標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化;小鼠證候的嚴(yán)重程度實(shí)現(xiàn)了量化描述;該方法的建立有助于療效評(píng)價(jià)。②所有小鼠的辨證采用了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算機(jī)計(jì)量辨證,避免了人工辨證帶來(lái)的誤差。③客觀揭示了荷瘤小鼠與人類類似,證候及其兼證會(huì)逐漸增加,日漸嚴(yán)重,因此可以很好地模擬臨床腫瘤證候的演變,用于病證結(jié)合研究。④采用疾病模型,通過(guò)非創(chuàng)傷性的四診手段,觀察疾病狀態(tài)下證候的自然發(fā)生及其演變,從而可以避免以方測(cè)證、微觀辨證、病證疊加造模等方法的局限,為中醫(yī)藥病證結(jié)合和辨證論治的基礎(chǔ)研究提供了方法學(xué),具有重要的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究存在的問(wèn)題在于所選擇的四診檢測(cè)指標(biāo)還很有限。鑒于中醫(yī)臨證的特點(diǎn)是通過(guò)望聞問(wèn)切采集四診指標(biāo),方便、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、有效,鑒于此,我們依據(jù)文獻(xiàn)和我們的經(jīng)驗(yàn),業(yè)已建立了系列標(biāo)準(zhǔn)[17~19],但付諸大樣本的檢測(cè),工作量大,檢測(cè)質(zhì)量難以控制。因此,如何進(jìn)一步探索和發(fā)展小鼠四診檢測(cè)指標(biāo),重在實(shí)用和有效,是我們今后努力的方向。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)分析。(1)總體上,荷瘤小鼠預(yù)后與早期腫瘤增長(zhǎng)速率(邪毒盛衰)密切相關(guān),早、中期腫瘤增長(zhǎng)迅速者,生存期往往較短。由此得到的啟迪是:①不同治法的療效比較與評(píng)價(jià),要求荷瘤小鼠接種出瘤后,依據(jù)腫瘤出瘤先后、大小分層隨機(jī)分組,避免分組偏倚,影響療效判斷;②早期控制腫瘤的迅速增長(zhǎng)十分必要。(2)總體看,荷瘤預(yù)后與氣和