疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞脂肪沉積的影響

疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞脂肪沉積的影響

非酒精性脂肪性肝病（nafd）是與遺傳環(huán)境或代謝反應(yīng)相關(guān)的臨床病理綜合征，其特點(diǎn)是沒有飲酒過量的酒精歷史、肝功能減退和脂質(zhì)積累。包括個(gè)體肝炎、非酒精脂肪性肝炎、相關(guān)肝細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌等。大量研究表明:脂質(zhì)代謝異常是NAFLD發(fā)病機(jī)制中最關(guān)鍵也是最基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)之一。近年來,隨著核受體調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪代謝途徑的發(fā)現(xiàn),核受體對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡機(jī)制的研究也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。有研究表明:LXR/FAS通路是調(diào)控肝細(xì)胞脂肪代謝平衡的重要通路之一,通過對(duì)肝細(xì)胞的脂肪代謝平衡的影響,進(jìn)而影響肝細(xì)胞脂肪的沉積。由于NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前缺乏最有效和適當(dāng)?shù)乃幬镏委烴AFLD,傳統(tǒng)中醫(yī)藥能夠溫和而有效的治療NAFLD已經(jīng)得到循證醫(yī)學(xué)的證實(shí)。但中藥的意義在于通過由特定活性物質(zhì)群介導(dǎo)的多靶點(diǎn)、多途徑整合作用發(fā)揮方證對(duì)應(yīng)的終末效應(yīng),在前期研究發(fā)現(xiàn)疏肝健脾方藥具有降低NAFLD大鼠肝組織的LXRα、FAS基因和蛋白表達(dá),改善脂質(zhì)代謝紊亂,減輕脂肪沉積的效果。本實(shí)驗(yàn)在既往研究的基礎(chǔ)上,運(yùn)用疏肝健脾方藥對(duì)LXRα/FAS信號(hào)通路介導(dǎo)NAFLD大鼠肝細(xì)胞脂肪沉積的影響進(jìn)行研究,旨在從細(xì)胞水平進(jìn)一步探討疏肝健脾方藥防治NAFLD的機(jī)制,為NAFLD的中醫(yī)藥治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。材料和方法1醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)雄性SD大鼠75只,體重(200±20)g,購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批號(hào):0107792,使用許可證號(hào):SCXK(粵)2008-0020;飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi),使用許可證號(hào):SYXK(粵)2012-0117。2試劑和機(jī)器2.1dna酶、epta和trizel核酸提取液Nycodenz(挪威Axis-Shield公司),Ⅳ型膠原酶、RPMI-1640培養(yǎng)基為(美國(guó)GIBCO公司),蛋白酶E(德國(guó)Roche公司),Hepes(美國(guó)Amresco公司),DNA酶Ⅰ、EGTA(美國(guó)Sigma公司)。TRIzol核酸提取液(美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO公司))。核蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Anti-LXRα(美國(guó)Abcam公司),Anti-FAS(美國(guó)Abcam公司),QuantcDNA第一鏈合成試劑盒、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)。高脂飼料配方:基礎(chǔ)飼料88%,豬油10%,膽固醇1.5%,膽鹽0.5%;該飼料由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工,廣州市華大輻照中心鈷60照射滅菌(輻照劑量25.0kGy)。2.2co培養(yǎng)箱美國(guó)a冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);AU600全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);PCT-200型梯度PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司);Chromo4實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司);懸垂式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司);ELITE流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman-coulter公司);凝膠成像系統(tǒng)(中國(guó)AUTEL公司)。3高脂飼料的制備SD大鼠75只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,分別為:正常組、模型組、疏肝組、健脾組及合方組(柴胡疏肝散聯(lián)合參苓白術(shù)散),每組15只。模型建立采用改進(jìn)后的課題組前期實(shí)驗(yàn)方法:正常組大鼠給予維持飼料喂養(yǎng),其余各組均以高脂飼料喂養(yǎng)高脂飼料,喂養(yǎng)時(shí)間為8周。在造模同時(shí),各組按10mL/kg給予相應(yīng)的藥物或超純水灌胃干預(yù),分別為疏肝組:柴胡疏肝散(柴胡6g芍藥5g枳殼5g川芎5g香附5g陳皮6g炙甘草3g)9.6g/kg;健脾組:參苓白術(shù)散(人參15g茯苓15g白術(shù)15g白扁豆12g薏苡仁9g砂仁6g山藥15g桔梗6g蓮子9g炙甘草9g)30g/kg;合方組:柴胡疏肝散聯(lián)合參苓白術(shù)散合方,39.6g/kg。上述實(shí)驗(yàn)藥物均為中藥配方免煎顆粒劑,由深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn),購(gòu)于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房,組成、劑量均參考方劑學(xué),劑量為人臨床等效劑量的3倍用量。正常組和模型組分別給予相應(yīng)體積的超純水。4指標(biāo)和方法的檢測(cè)4.1肝組織病理學(xué)檢測(cè)8周后,每組取9只大鼠,腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,采集右葉1.5cm×1cm×0.5cm肝組織,油紅O染色觀察肝組織病理變化。4.2肝組織勻漿的制備取各組大鼠右葉1cm×1cm×1cm肝組織,加入異丙醇溶液中,進(jìn)行肝組織勻漿,后取上清。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組肝組織TC、TG含量。4.3分離所獲從細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)的企業(yè)各細(xì)胞具體方法在前期細(xì)胞分離與鑒定的基礎(chǔ)上加以改進(jìn),以RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)10mL,在無菌培養(yǎng)皿中,撕開肝包膜,使細(xì)胞懸液流出,剪碎未完全消化的肝組織。細(xì)胞懸液分別經(jīng)200目及300目細(xì)胞篩網(wǎng),GBSS液垂懸,108r/min離心3min,共2次,4℃離心。離心沉淀物加GBSS液垂懸,108r/min離心3min,共2次,4℃離心洗滌,10%RPMI-1640培養(yǎng)基垂懸所得沉淀,取懸液9∶1染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞終濃度調(diào)整為2~5×106個(gè)/mL,此即為分離所獲肝細(xì)胞,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。95%肝細(xì)胞在培養(yǎng)12h后,可以貼壁,洗去未貼壁的細(xì)胞,更換培養(yǎng)基,即得到純化后的肝細(xì)胞。胰酶消化細(xì)胞后,PBS洗滌兩次,固定劑固定15min,離心去上清后,加入破膜試劑,兩種細(xì)胞分別加入一抗(兔抗大鼠ck-18和Lysozyme),室溫孵育30min,加入二抗(羊抗兔IgG-FITC)室溫孵育30min,破膜試劑洗滌兩次后,上機(jī)檢測(cè)。4.4引物的設(shè)計(jì)與合成采用TRIzol常規(guī)一步法提取肝細(xì)胞RNA,測(cè)定RNA樣品含量及純度,然后逆轉(zhuǎn)錄為cD-NA。GeneBANK中查找到大鼠GAPDH內(nèi)參和LXRα、FASmRNA序列。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成(見表1)。PCR按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,采用10μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:(1)95℃持續(xù)1min預(yù)變性;(2)95℃持續(xù)10s變性;(3)GAPDH57.5℃,LXRα54℃,FAS54℃,退火20s;(4)68℃持續(xù)30s延伸,(2)~(4)39個(gè)循環(huán);(5)溶解曲線分析,72~95℃,持續(xù)5~10s。反應(yīng)完畢,采用OpticonMonitor3.1軟件分析,用公式2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量。4.5蛋白含量和洗養(yǎng)液制備取1mL的裂解液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF的最終濃度為1mmol/L。計(jì)數(shù)新鮮分離的細(xì)胞,按照5~10×106個(gè)細(xì)胞加入1mLRIPA裂解液,4℃,14000r/min離心5~10min,蛋白含量的測(cè)定,根據(jù)碧云天BCA蛋白濃度試劑盒說明書對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,加5%脫脂奶粉封閉液,室溫下平搖1h;洗膜,加一抗稀釋液(LXRα1∶5000,FAS1∶2000),4℃過夜孵育;洗膜,加二抗稀釋液(1∶6000~8000)室溫孵育1h,洗膜后,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。曝光、顯影、定影,最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以u(píng)e0af±s表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(SNK法),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)nafld大鼠肝組織血脂表達(dá)的影響正常組大鼠肝細(xì)胞核呈淡藍(lán)染色,少許肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見散在的紅染脂滴。模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹,細(xì)胞核呈深藍(lán)染色,細(xì)胞漿可見大量紅色脂滴,少許肝細(xì)胞脂滴融合成大脂滴。各用藥組大鼠肝細(xì)胞脂滴含量介于正常組與模型組之間,其中以疏肝組大鼠肝細(xì)胞脂滴含量與正常組最為接近,提示疏肝組方藥減少NAFLD大鼠脂肪沉積療效較好。與正常組比較,模型組大鼠肝組織TC、TG含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,疏肝組大鼠肝組織TC、TG含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各用藥組組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。每只NAFLD大鼠獲得純化后肝細(xì)胞為6.0~7.5×108個(gè)/肝。取少量2種細(xì)胞,胰酶消化,行臺(tái)盼藍(lán)染色,倒置相差顯微鏡細(xì)胞計(jì)數(shù),測(cè)定其活力,肝細(xì)胞在95%以上。新鮮剛分離獲得的肝細(xì)胞透亮、呈圓形或球形,折光性強(qiáng),邊界清晰;12h后細(xì)胞透亮、呈圓形或橢圓形、邊緣伸展。FCM鑒定肝細(xì)胞:共檢測(cè)細(xì)胞10000個(gè),CK-18受體表達(dá)的細(xì)胞共9322個(gè),占所有細(xì)胞比例為93.22%,即肝細(xì)胞純度為93.22%。與正常組比較,模型組肝細(xì)胞LXRα、FASmRNA表達(dá)明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),分別為正常組的13.08和22.63倍;與模型組比較,各用藥組肝細(xì)胞LXRαmRNA均有不同程度下降(P<0.01,P<0.05),其中以疏肝組下降明顯,與健脾組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)。5比較兩組大學(xué)生的統(tǒng)計(jì)學(xué)效果與正常組比較,模型組LXRα、FAS蛋白表達(dá)均有明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,各用藥組LXRα、FAS蛋白表達(dá)均有不同程度下降(P<0.01)。lxr和fas基因表達(dá)NAFLD的最典型特征是肝臟脂肪積聚,各種原因引起肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝自穩(wěn)的破壞致使脂質(zhì)在肝細(xì)胞異常沉積,而肝內(nèi)脂肪沉積又是代謝紊亂的啟動(dòng)因素,當(dāng)肝細(xì)胞異常脂質(zhì)沉積到一定程度,可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡紊亂,進(jìn)而加重NAFLD的脂質(zhì)代謝。本研究中模型組NAFLD大鼠肝脂含量較正常組存在非常顯著性差異(P<0.01),說明NAFLD大鼠肝臟中存在大量脂肪沉積,出現(xiàn)了較為明顯的脂質(zhì)代謝紊亂。而油紅O染色進(jìn)一步證實(shí)了肝細(xì)胞存在明顯的脂肪沉積,也證實(shí)了NAFLD模型組大鼠肝細(xì)胞存在明顯脂肪變性和脂肪沉積。肝細(xì)胞脂質(zhì)平衡受到多條信號(hào)途徑共同調(diào)控和影響,核受體對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡機(jī)制的研究也日趨增多。本實(shí)驗(yàn)研究了核受體LXRα與靶基因FAS結(jié)合對(duì)肝細(xì)胞脂肪酸的生成進(jìn)行調(diào)節(jié),從而影響脂肪的合成。LXRα是脂肪酸生成的一些關(guān)鍵酶的基因,其中FAS是它的下游基因,LXR對(duì)于脂肪合成的關(guān)鍵酶FAS的調(diào)節(jié),既可以是通過直接與FAS啟動(dòng)子結(jié)合,又可以間接通過SREBP-1C途徑上調(diào)FAS基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。SREBP-1C的過度表達(dá)可引起FAS基因轉(zhuǎn)錄增加,從而導(dǎo)致FAS活性的增強(qiáng),并引起脂肪酸合成增多和增加,在肝細(xì)胞中異常沉積形成脂肪肝。在缺失LXR基因的小鼠體內(nèi),肝SREBP-1C的mRNA基礎(chǔ)表達(dá)水平顯著下降,與之相平行的是受SREBP-1C調(diào)控的FASmRNA水平顯著下降。本研究結(jié)果表明,NAFLD模型組較正常組肝細(xì)胞LXRα、FAS基因及蛋白的表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01),這個(gè)結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致,結(jié)合油紅O染色和肝脂的結(jié)果可見:LXRα/FAS信號(hào)通路介導(dǎo)NAFLD大鼠肝細(xì)胞脂肪沉積,導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)平衡紊亂。但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究,或許與LXRα/FAS信號(hào)通路導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)。脂肪肝屬于中醫(yī)古代“脅痛”、“肝著”、“肝痞”等病范疇,但無明顯對(duì)應(yīng)關(guān)系。前期研究表明認(rèn)為肝郁脾虛是NAFLD發(fā)生發(fā)展的基本病機(jī),疏肝健脾治法當(dāng)貫穿疾病全程。由于脂質(zhì)屬于精微物質(zhì)的范疇,機(jī)體內(nèi)的精微物質(zhì)是在不斷地化生、轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化和代謝的,處于一種動(dòng)態(tài)平衡中,這一平衡,有賴于脾主運(yùn)化與肝主疏泄功能,二者相互協(xié)調(diào)、相互為用維持動(dòng)態(tài)平衡,維持脂質(zhì)代謝自穩(wěn)態(tài),一旦肝郁脾虛則脂質(zhì)代謝自穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)紊亂,導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生發(fā)展。疏肝健脾方藥主要由中醫(yī)傳統(tǒng)名方柴胡疏肝散、參苓白術(shù)散組成,主要針對(duì)肝郁脾虛的病機(jī)。現(xiàn)代研究表明:柴胡疏肝散及參苓白術(shù)散的主要活性成分包括:阿魏酸、人參皂苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、新橙皮苷、芍藥內(nèi)酯苷和白術(shù)苷等藥物成分組成,其中人參皂苷、白術(shù)苷等成分可能具有降低脂的效果。在本次研究中疏肝健脾方藥具有顯著改善肝細(xì)胞脂肪沉積,降低肝脂的效果,但以疏肝組療效最為顯著,