影響杜鵑組織培養(yǎng)因素的研究進(jìn)展

影響杜鵑組織培養(yǎng)因素的研究進(jìn)展

杜鵑花是杜鵑科的一種多年生落葉灌木。它是世界著名的花之一。它不僅具有很高的應(yīng)用價(jià)值，還可以被藥物治療疾病。野生杜鵑多為雜合體,種子繁殖后代發(fā)生嚴(yán)重分離,通?？壳げ宸敝?產(chǎn)量有了提高,但生長(zhǎng)周期長(zhǎng),繁殖系數(shù)低,同時(shí)受母株材料和繁殖季節(jié)的影響,不能滿足社會(huì)需求。采用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行大量快速繁殖是實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的有效措施。在杜鵑離體繁殖中,試管苗的增殖與生根不僅與植株的基因型有關(guān),還受外植體的來源、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、培養(yǎng)程序等諸多其它因素的影響,故對(duì)近三十年來(1975~2008)國(guó)內(nèi)外杜鵑組織培養(yǎng)研究概況進(jìn)行綜述,以期能給杜鵑花的組培研究帶來一些借鑒價(jià)值。1生物群落基因杜鵑花是多年生木本植物,由于多毛、多鱗片、發(fā)粘、材料大而消毒困難,因此大多數(shù)組織培養(yǎng)外植體取自幼嫩的組織,染菌較少,消毒容易,易于分化形成愈傷組織或直接分化成芽。通常培養(yǎng)杜鵑可采用的外植體有頂芽,腋芽,雌蕊,帶腋芽的嫩莖段以及嫩葉。1975年,Anderson等以杜鵑莖尖培養(yǎng)植株獲得成功。1999年宗憲春培養(yǎng)毛葉杜鵑R.championae與比利時(shí)杜鵑R.hybridun采用新發(fā)幼苗新梢。2001年鐘宇以不同季節(jié)的莖尖(含莖段)為材料,培養(yǎng)西洋杜鵑R.hybridn,結(jié)果表明,最適外植體為摘花芽后萌發(fā)的頂芽莖尖。2003年王亦菲等對(duì)兩種來自比利時(shí)的高山西洋杜鵑R.britannia,R.america的莖尖進(jìn)行了成功培養(yǎng)。2003年梁曉華等對(duì)亮毛杜鵑R.microphyton的莖尖進(jìn)行了培養(yǎng),但成功率不高。2004年閆鳳霞等選取杜鵑花R.simsii莖尖、嫩葉和老葉為外植體,誘導(dǎo)不定芽產(chǎn)生再生植株,結(jié)果表明莖尖、嫩葉效果較好。1982年Meyer等以花芽作外植體,成功培養(yǎng)了NovaZembla,RoseumElegans,Sefon等品種的杜鵑。1986年,從毛葉杜鵑R.mollicomum葉片培養(yǎng)得到植株。1991年報(bào)道了以葉為外植體,離體條件下誘導(dǎo)杜鵑R.‘P.J.M.Hybride’植株再生。1996年,從杜鵑R.simsii7個(gè)栽培品種Paloma,Avenir,Mme.Petrick,Aline,Flamenco,Lara和Mme.M.DePaepe葉片誘導(dǎo)植株,該試驗(yàn)從葉片誘導(dǎo)出了不定芽,但在進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)未獲得成功。2003年秦靜遠(yuǎn)等從R.simsii品種“HellmutVogel”幼葉誘導(dǎo)出愈傷組織,并進(jìn)一步分化為叢生苗。1987年有報(bào)道從子房組織誘導(dǎo)杜鵑R.prinophyllum再生。1985年,有人培養(yǎng)春鵑和西鵑莖尖成功率僅4%~5%,后用種子無菌苗莖段培養(yǎng)獲得成功。1991年,從莖段再生杜鵑R.laetum×aurigeranum獲得成功。2002年鄧百萬等對(duì)比利時(shí)杜鵑的幼莖進(jìn)行培養(yǎng),使休眠腋芽萌發(fā),且誘導(dǎo)出不定芽,并從幼葉誘導(dǎo)出愈傷組織。2004年,湯桂鈞等以德國(guó)產(chǎn)高山杜鵑R.lapponicum的莖段和莖尖進(jìn)行外植體誘導(dǎo)試驗(yàn),結(jié)果顯示,莖段誘導(dǎo)無菌芽效果較好。2006年朱春艷等以新發(fā)莖段為外植體,研究了云錦杜鵑R.fortunei的組培快繁技術(shù),取得成功。2007年,羅彭等以幼嫩莖段為外植體對(duì)大白杜鵑R.decorum、美容杜鵑R.calophytum、喇叭杜鵑R.discolor進(jìn)行組培研究,效果較好。2008年程雪梅等以馬纓杜鵑R.delavayi的種子萌發(fā)的無菌苗莖段為外植體進(jìn)行研究,獲得成功。1993年有報(bào)道從雄蕊誘導(dǎo)杜鵑R.‘P.J.M.’再生植株和器官發(fā)生?？偨Y(jié)以上表明,最優(yōu)良的外植體是旺盛生長(zhǎng)季節(jié)(3月下旬到4月上旬)杜鵑新發(fā)枝的幼嫩芽,這個(gè)時(shí)期外植體處于旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)而且芽的苞片還未展開,將帶苞片的芽進(jìn)行消毒,即使滅菌時(shí)間長(zhǎng)一些也不會(huì)傷害到里面的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn),接種后成活率高,增殖速度快,褐變程度輕。2消毒方法的選擇因子分析在對(duì)三葉膠初級(jí)培養(yǎng)污染的研究中發(fā)現(xiàn)高溫、多雨的環(huán)境易導(dǎo)致污染,而且隨著植物材料年齡的增長(zhǎng),植物材料的健康狀況不斷惡化,組培污染也會(huì)更加嚴(yán)重,研究認(rèn)為外植體帶菌多少的順序?yàn)?腋芽<莖尖<頂點(diǎn)。外植體的狀況、環(huán)境條件和操作過程是引起污染的主要原因。對(duì)大多數(shù)植物來說,采用新生的或新抽的枝條,4~5月份的新葉、莖尖、枝條,污染率可下降20%~30%。杜鵑外植體消毒困難,腋芽,頂芽和雌蕊等幼嫩部位若消毒時(shí)間過長(zhǎng),容易死亡,若消毒時(shí)間縮短,則菌尤其是內(nèi)源菌難以殺死。大多研究者采用自來水沖洗外植體5~30min,飽和洗衣粉水洗5~30min,自來水沖洗5~30min,在無菌條件下用濃度70%酒精消毒15~30s,無菌水沖洗1次,再用濃度0.1%HgCl2消毒5~8min,無菌水沖洗4~10次。也有不經(jīng)過70%酒精步驟,只用HgCl2消毒的。2003年梁曉華等用濃度10%H2O2,2%Br2,2%NaClO,0.1%HgCl2各浸泡10min,對(duì)亮毛杜鵑進(jìn)行消毒滅菌比較實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)濃度0.1%HgCl2消毒滅菌效果最好。2005年邱璐等用濃度0.2%HgCl2代替0.1%HgCl2消毒2~3min,取得較好效果。0.2%HgCl2優(yōu)于0.1%HgCl2的原因在于高濃度的HgCl2能迅速殺死外植體表面的微生物,達(dá)到迅速殺菌的作用;另外由于滅菌時(shí)間較短,僅2~3min,消毒劑對(duì)外植體細(xì)胞的損傷小,外植體易于恢復(fù)生長(zhǎng)。2003年,陳新平等在進(jìn)行R.simsiiPlanch組織培養(yǎng)研究時(shí)發(fā)現(xiàn),外殺菌能力較強(qiáng)的升汞液(氯化汞)對(duì)杜鵑花的嫩莖具有較強(qiáng)的損傷,外植體材料易褐變死亡,故不宜使用。該實(shí)驗(yàn)表明,采用飽和的次氯酸鈣上清液或5%的次氯酸鈉溶液滅菌,效果較好,處理時(shí)間為15~20min。為加強(qiáng)滅菌效果,還可加入1%的克菌丹和0.1%的Twine-20配合使用,并且證明材料滅菌前的預(yù)處理,采用70%酒精浸泡,處理時(shí)間不超過30s效果更好。2003年,秦靜遠(yuǎn)采用10%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒。2004年,黃萍萍用5%次氯酸鈉溶液浸泡15min進(jìn)行消毒。2006年,在高山杜鵑R.Delavayi的組織培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)研究中,首次采用把莖段先在洗衣粉液浸泡20min,流水沖洗至清,再用1%的84消毒液振蕩15min,以達(dá)到清除污垢,還對(duì)莖段和莖尖進(jìn)行了消毒效果的比較實(shí)驗(yàn),主要比較在消毒時(shí)間及消毒條件相同的情況下,5%次氯酸鈉+0.1%的山梨糖醇浸泡15min和0.1%升汞浸泡10min的效果差別,結(jié)果發(fā)現(xiàn),用升汞對(duì)杜鵑進(jìn)行消毒,污染率低,但會(huì)加重外植體的褐化程度,尤其是成年型外植體,褐化率可達(dá)60%以上,因此,作者建議采用5%次氯酸鈉+0.1%的山梨糖醇對(duì)外植體進(jìn)行消毒(何芳蘭)。2008年,官汝淳等用5%青霉素溶液浸泡10min代替0.1%HgCl2進(jìn)行消毒?？偟膩碚f,杜鵑花的新莖柔嫩度高、酚類物質(zhì)含量高,處理時(shí)宜采用氧化性較低的滅菌劑類型。外植體大小對(duì)實(shí)驗(yàn)有很大影響,外植體太大,給消毒滅菌帶來困難,消毒不徹底;但外植體太小,容易受消毒液損傷,難以恢復(fù)生長(zhǎng)。消毒完后,在超凈臺(tái)上將腋芽,頂芽,雌蕊,帶腋芽的嫩莖段的切口上面被損傷的細(xì)胞切除,再進(jìn)行接種。嫩葉則要去除葉脈及葉邊緣損傷細(xì)胞,然后切成適當(dāng)?shù)拇笮?再進(jìn)行接種。3帶模培養(yǎng)基的外植體養(yǎng)殖技術(shù)1975年Anderson等人總結(jié)出可廣泛應(yīng)用于杜鵑屬組培的Anderson培養(yǎng)基。1985年,用Anderson培養(yǎng)春鵑和西鵑種子苗切段獲得成功。2003年孫振元等以Anderson改良的杜鵑花培養(yǎng)基對(duì)毛白杜鵑R.mucronatum進(jìn)行組培,效果好。1980年,木本培養(yǎng)基(woodyplantmedium,WPM)被研制出,這種培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)杜鵑科的一些木本植物非常有效。秦靜遠(yuǎn)用WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)杜鵑的葉片,獲得再生植株。2004年,苗永美對(duì)大樹杜鵑R.protisum,桃葉杜鵑R.anne和銀葉杜鵑R.argyrophyllum的葉片愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行研究,得到最佳培養(yǎng)基為WPM(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2004)。2006年朱春艷等以WPM為基本培養(yǎng)基,研究了云錦杜鵑R.fortunei的組培快繁技術(shù),效果好。2008年程雪梅等以WPM為培養(yǎng)基,成功進(jìn)行馬纓杜鵑R.delavayi的組培研究,取得成功。1984年采用Read培養(yǎng)基培養(yǎng)耐寒落葉杜鵑。用Read培養(yǎng)基培養(yǎng)錦秀杜鵑R.pulchrum、映山紅R.simsii、迎紅杜鵑R.mucronulatum,成功獲得再生植株。2001年,鐘宇用這種培養(yǎng)基成功培養(yǎng)了西洋杜鵑。2003年,王亦菲等以西洋杜鵑的兩個(gè)栽培品種R.britannia和R.america為供試材料,比較MS,Anderson,Read,N64種基本培養(yǎng)基對(duì)外植體誘導(dǎo)的影響,研究結(jié)果表明Read培養(yǎng)基表現(xiàn)最為出色,誘導(dǎo)率達(dá)85%。1986年培養(yǎng)春夏杜鵑R.indicum選用1/4MS。2008年顧地周等用1/4MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基對(duì)牛皮杜鵑R.chrysanthum進(jìn)行組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究。2004年,閆鳳霞等選取1/4MS型培養(yǎng)基來進(jìn)行杜鵑花R.simsii&R.spp.的快繁生產(chǎn)。2004年,黃萍萍采用高山杜鵑R.delavayi莖節(jié)為初代培養(yǎng)的外植體,篩選出相對(duì)較優(yōu)的培養(yǎng)基為1/4MS。2007年周艷等以1/4MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,對(duì)馬纓杜鵑R.delavayi進(jìn)行研究。2008年,官汝淳等培養(yǎng)短果杜鵑R.brachycarpum,采用的芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基為MS,壯苗生根培養(yǎng)基為1/4MS,成活率達(dá)90%以上。1999年培養(yǎng)毛葉杜鵑與比利時(shí)杜鵑時(shí)選用B5培養(yǎng)基。2002年鄧百萬用Anderson,Read,N6培養(yǎng)基(MS大量元素、B5培養(yǎng)基的維生素、MS鐵鹽、Read微量元素)為基本培養(yǎng)基培養(yǎng)比利時(shí)杜鵑,發(fā)現(xiàn)3種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)腋莖萌發(fā)、不定芽形成及愈傷組織的形成,其中以N6培養(yǎng)基為優(yōu),最適合比利時(shí)杜鵑生長(zhǎng)。2003年梁曉華以Read,Anderson,1/4MS,1/10MS對(duì)亮毛杜鵑進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在Read,Anderson,1/4MS培養(yǎng)基上7d后完全褐化死亡,培養(yǎng)在1/10MS上的植株21d后死亡。2003年,王荃等研究東洋杜鵑花R.obtussum的合適的組織培養(yǎng)各因素條件。結(jié)果表明,由于杜鵑花科植物原產(chǎn)于高山酸性土壤,低鹽分濃度及高比值NH4+/NO3-的基本培養(yǎng)基K和B適合東洋杜鵑。目前為止,培養(yǎng)杜鵑廣泛選用MS,Anderson的改良MS,1/4MS、Anderson和Read這5種培養(yǎng)基。這5種培養(yǎng)基在許多方面存在差異,但主要的區(qū)別在于總鹽含量和銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的比值。選用何種培養(yǎng)基,因杜鵑的種、品種及外植體而異,需要實(shí)驗(yàn)來確定。4外源激素對(duì)斷裂強(qiáng)度的影響因培養(yǎng)的杜鵑種和品種差異激素的效果是不同的,因此在培養(yǎng)中應(yīng)當(dāng)仔細(xì)觀察比較,選定適宜的細(xì)胞分裂素。6-BA和ZT在杜鵑組培中應(yīng)用較多。1975年Anderson培養(yǎng)高山杜鵑的實(shí)驗(yàn)表明6-BA有害于杜鵑的生長(zhǎng)增殖。1981年,培養(yǎng)幾個(gè)杜鵑種和雜種R.cauescens,R.ChopTank,R.prounifolium,R.prounifolium×arbrescens時(shí),發(fā)現(xiàn)6-BA不但抑制側(cè)芽萌發(fā),也抑制增殖,而采用2iP時(shí),有兩個(gè)種6周內(nèi)可增值3~4倍。2001年鐘宇用ZT培養(yǎng)西洋杜鵑R.hybridn。2003年孫振元等用ZT培養(yǎng)基培養(yǎng)毛白杜鵑R.mucronatum,獲得成功。2003年李俊強(qiáng)(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2003)用6-BA培養(yǎng)銀葉杜鵑R.argyrophyllum。顧地周等進(jìn)行牛皮杜鵑R.chrysanthum組織培養(yǎng)與快速繁殖的研究時(shí),用6-BA作為愈傷誘導(dǎo)和分化的激素,取得成功。陳新平在R.simsii組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素以ZT的誘芽效應(yīng)較為顯著。2003年王亦菲等以西洋杜鵑的兩個(gè)栽培品種R.britannia,R.america為材料探討外源激素種類對(duì)杜鵑繁殖系數(shù)的影響,結(jié)果在ZT與NAA組合上獲得了較高的繁殖系數(shù)。2003年王荃等研究東洋杜鵑花R.obtussum的合適的組織培養(yǎng)各因素條件,結(jié)果表明,6-BA適合東洋杜鵑。2004年,苗永美在用6-BA、KT并附加一定的生長(zhǎng)素培養(yǎng)大樹杜鵑R.protistum時(shí),發(fā)現(xiàn)葉片逐漸變黃死亡,最后導(dǎo)致材料的整體死亡,因此,認(rèn)為6-BA、KT至少其中的一種對(duì)大樹杜鵑有毒害作用。2004年,閆鳳霞等進(jìn)行R.simsii的快繁生產(chǎn)時(shí),選取6-BA為細(xì)胞分裂素,取得較好效果。2003年梁曉華等對(duì)亮毛杜鵑R.microphyton的研究得出的結(jié)果是ZT比較適合亮毛杜鵑生長(zhǎng)。TDZ也被廣泛應(yīng)用于杜鵑的離體培養(yǎng)。苗永美用TDZ誘導(dǎo)R.Simsii的葉片產(chǎn)生叢芽,但芽極短(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2004)。在苗永美的3種杜鵑的葉片培養(yǎng)研究中,TDZ不僅誘導(dǎo)3種杜鵑葉片產(chǎn)生了愈傷組織,而且TDZ還誘導(dǎo)桃葉杜鵑和銀葉杜鵑葉片直接產(chǎn)生不定芽。李俊強(qiáng)用6-BA誘導(dǎo)銀葉杜鵑葉片產(chǎn)生了愈傷組織,發(fā)現(xiàn)愈傷組織不能在含有6-BA的培養(yǎng)基上存活,最后逐漸死亡,而在苗永美研究中發(fā)現(xiàn),TDZ能很好地維持銀葉杜鵑愈傷組織的生長(zhǎng),且發(fā)生了再分化誘導(dǎo)出了不定芽,說明TDZ在使銀葉杜鵑葉片脫分化和再分化方面要強(qiáng)于6-BA;同樣用6-BA也沒有從銀葉杜鵑葉片誘導(dǎo)出不定芽,說明TDZ具有比6-BA更高的使培養(yǎng)物直接分化芽的能力。2008年,程雪梅在馬纓杜鵑R.delavayi的組織培養(yǎng)中首先利用TDZ誘導(dǎo)從生芽,然后轉(zhuǎn)入含KT的培養(yǎng)基使叢生芽伸長(zhǎng),取得較好效果。苗永美用Anderson的改良MS+TDZ+IBA(NAA)杜鵑R.spp的莖段、莖尖,1個(gè)月產(chǎn)生了大量叢生芽;而用6-BA、KT時(shí),只出現(xiàn)腋芽萌發(fā),頂芽伸長(zhǎng),無叢生芽產(chǎn)生。由此看來,TDZ對(duì)誘導(dǎo)叢生芽很有效,但不會(huì)使芽伸長(zhǎng)。杜鵑組培苗成本較高,降低組培苗成本,是工廠化生產(chǎn)杜鵑組培苗的迫切需要。在細(xì)胞分裂素的選擇上,ZT和TDZ都有成功的范例,但是ZT的價(jià)格較高,所以采用TDZ更好。5不同培養(yǎng)條件對(duì)植物基人林根系的影響杜鵑生根并不困難,當(dāng)把杜鵑的莖尖培養(yǎng)在無細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上,將停止增殖,并且90%的莖尖會(huì)在插入培養(yǎng)基的部分長(zhǎng)出不分枝的根。國(guó)內(nèi)大多使用IBA,NAA,IAA等生長(zhǎng)素來誘導(dǎo)生根。鐘宇使用IBA生根效果優(yōu)于NAA,用NAA處理的嫩枝先在莖的基部生成較多的愈傷組織,甚至接觸培養(yǎng)基的葉片也長(zhǎng)有大量愈傷組織,稍后從愈傷組織上長(zhǎng)出根,數(shù)量極多,但細(xì)短,而采用IBA誘導(dǎo)根的小苗,根部愈傷組織少,根較壯,但數(shù)量少。以IBA、NAA共同作用的Read+NAA2.0mg/L+IBA2.0mg/L對(duì)R.hybridn生根效果最好。王亦菲的實(shí)驗(yàn)表明,西洋杜鵑在不含激素的1/2Read(僅大量元素減半)培養(yǎng)基上有22%的生根率;在1/2Read+IBA1.0mg/L的培養(yǎng)基上生根最好,達(dá)84%;而在NAA的培養(yǎng)基上雖有生根,但來自愈傷組織,易脫落,效果不好。秦靜遠(yuǎn)采用WPM+IAA1.75mg/L+活性炭0.25%生根效果較好。杜鵑組培苗生根數(shù)量隨繼代次數(shù)而增加,直到第4代達(dá)到最高,以后保持平穩(wěn),故應(yīng)以第4代以后培養(yǎng)的枝條進(jìn)行生根培養(yǎng)最好,均可達(dá)到100%的生根率。也有人使用Anderson或1/2Anderson,1/3Anderson+IAA1.0mg/L+活性炭1.0g/L,得到較好的生根效果。2004年,毛元榮等從活性炭、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)條件、碳源等方面討論了影響高山杜鵑R.delavayi生根的因素,結(jié)果表明活性炭有利于根的正常生長(zhǎng)與發(fā)育;無瓊脂的液體培養(yǎng)基生根明顯快于固體培養(yǎng)基;培養(yǎng)基的pH值5.0~5.5最適合杜鵑生根;蔗糖濃度對(duì)生根率無影響,但影響小苗根的生長(zhǎng)速率。2006年,苗永美對(duì)桃葉杜鵑組織培養(yǎng)技術(shù)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種生長(zhǎng)素(IBA,NAA)和AC是生根的主要因子。國(guó)內(nèi)對(duì)于杜鵑的培養(yǎng)大多采用瓶?jī)?nèi)生根,而國(guó)外大多采用瓶外生根,瓶外生根所使用的生長(zhǎng)素與瓶?jī)?nèi)一致。瓶外生根的主要方法是;將芽的基部在生長(zhǎng)素中浸泡,然后栽到泥炭∶珍珠巖=2∶1(V∶V)的