抗壞血酸谷胱甘肽測(cè)定

還原型谷胱苷肽GSH試劑配制（1）1mMGSH原則液10mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）：稱3.0733mgGSH,加蒸餾水至10mL。(不要)（2）5％磺基水楊酸500mL：25g溶于500mL水中。（3）6mMDTNB：稱取0.118905gDTNB溶于50mLPBS（0.1M，pH7.5）中。（4）2mMNADPH：18.1mgNADPH溶于10mLPBS中。（5）1mMGSSG原則液10mL：6.126mgGSSG加PBS至10mL。(不要)實(shí)際配備0.1MPBS(pH7.5):3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.5ml*3次測(cè)定=27ml;（實(shí)際配備50ml）6mMDTNB:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.2ml*3次測(cè)定=10.8ml;（實(shí)際配備50ml，實(shí)際用量0.1189g）2mMNADPH:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測(cè)定=5.4ml;（實(shí)際配備50ml,實(shí)際用量18.1mg）(1U)GRⅢ:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測(cè)定=5.4ml;（實(shí)際配備50ml,實(shí)際用量10ml）5％磺基水楊酸：3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.01ml*3次測(cè)定=0.54ml;（實(shí)際配備10ml）(實(shí)際用量0.5g/10ml)0.5mMPBS:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*1.5ml*3次測(cè)定=81ml;（實(shí)際配備100ml）乙醚（二乙醚）:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*10ml*3次測(cè)定=540ml;（實(shí)際配備1000ml）PBSBuffer0.5mM:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*1.5ml*3次測(cè)定=81ml;（實(shí)際配備150ml）2-乙烯吡啶:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.2ml*3次測(cè)定=10.8ml;（實(shí)際用量20ml）乙醚:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*10ml*3次測(cè)定=540ml;（實(shí)際用量1000ml）1．標(biāo)線制作：配制濃度為0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的原則GSH溶液（吸取上述原則液各0.1mL）加入0.5mL0.1M磷酸鈉Buffer（pH7.5）(含5mMEDTA)，0.2mL6mMDTNB,0.1mL2mMNADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（谷胱甘肽還原酶）(sigma),從0.1mLGSH啟動(dòng)反映，測(cè)定650s的A412（OD412），繪制原則曲線。以PBS替代DTNB作空白。GSH（還原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）（1）取1g新鮮葉片，加入10μL（能夠取0.2g鮮樣，加1.6ml提取液）5％磺基水楊酸，研磨后在14000g離心10分鐘，取1mL上清液，加入1.5mL,0.5mMPBS（pH7.5）中，再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（雜質(zhì)會(huì)融到乙醚層中，而乙醚處在整個(gè)反映體系得上層，你直接用槍吸取上層乙醚丟棄即可，重復(fù)進(jìn)行兩次即為抽取兩次），此提取液用于分析總谷胱苷肽含量。各取1mL上清液，加入1.5mLPBSBuffer0.5mM(pH7.5),0.2mL2-乙烯吡啶（原裝試劑濃度）混合至乳膠狀，在25℃反映1小時(shí)，再用5mL乙醚（原裝試劑濃度）抽提2次，此提取液用于分析GSSG『GSSG－氧化型谷胱甘肽，GSH－還原型谷胱甘肽不能夠直接測(cè)出，需測(cè)出氧化型和還原型谷胱甘肽含量，即總的谷胱甘肽含量，然后減去氧化型谷胱甘肽(GSSG）含量得到還原型谷胱甘肽含量（GSH））取反映混合液（0.5mL0.1MPBS(pH7.5)(內(nèi)含5mMEDTA)，0.2mL6mMDTNB，0.1mL2mMNADPH,0.1mL(1U)GRⅢ（sigma），由加入0.1ml提取液開始反映，測(cè)OD412，在25℃下，反映650s（大概十分鐘），分別計(jì)算總谷胱苷肽及GSH含量。以不加DTNB，加對(duì)應(yīng)劑量的PBS作空白。還原型谷胱甘肽含量的測(cè)定辦法（分光光度計(jì)法）實(shí)驗(yàn)試劑50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/LNa2-EDTA）：稱取5g三氯乙酸，用蒸餾水溶解稀釋至100ml。再稱取186mgNa2-EDTA·2H2O，加入到100ml50g/L三氯乙酸溶液中溶解。0.1mol/L磷酸鈉溶液緩沖液（pH7.7）：配制辦法見附錄。0.1mol/L(pH6.8)磷酸鈉緩沖液：配制辦法見附錄。4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoicacid，DTNB）溶液：稱取15.8mgDTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸緩沖液溶解，定容至10ml，混勻，4℃保存。現(xiàn)用現(xiàn)配。100μmol/L還原型谷胱甘肽原則液：稱取3.1mg還原型谷胱甘肽，加入少量無(wú)水乙醇溶解，加蒸餾水定容至100ml。實(shí)驗(yàn)材料同抗壞血酸?！緦?shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)】原則曲線制作取6支試管，編號(hào)，按照表1加入多個(gè)試劑，混勻，25℃保溫反映10min。以0號(hào)管為參比調(diào)零，測(cè)定顯色液在412nm處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，還原型谷胱甘肽物質(zhì)的量（μmol）為橫坐標(biāo)，繪制原則曲線。項(xiàng)目試管號(hào)012345100μmol/L還原型谷胱甘肽原則液/ml00.20.40.60.81.0蒸餾水/ml1.00.80.60.40.200.1mol/LpH7.7磷酸緩沖液/ml1.01.01.01.01.01.04mmol/LDTNB試劑/ml0.50.50.50.50.50.5相稱于還原型谷胱甘肽物質(zhì)的量/μmol020406080100提取取材后，稱取2.5g樣品置于研缽中，加入5ml經(jīng)4℃預(yù)冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/LNa2-EDTA）,在冰浴條件下研磨成勻漿后，于4℃、1g離心20min。收集上清液來測(cè)定谷胱甘肽含量，測(cè)量提取液體積。測(cè)定取1支試管，依次加入1ml蒸餾水、1ml0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.7）和0.5ml4mmol/LDTNB榮毅仁，混勻，即為繪制原則曲線的0號(hào)管液。以此溶液作為參比，在波長(zhǎng)412nm處對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零。另取2支試管，分別加入1ml上清液、1ml0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.7）。向一支試管加入0.5ml4mmol/LDTNB溶液，另一支試管中加入0.5ml0.1mol/L磷酸緩沖液（pH6.8），將兩支試管置于25℃保溫10min。按照制作原則曲線的辦法，快速測(cè)定顯色液在波長(zhǎng)412nm處的吸光度，分別記作ODs和ODc。重復(fù)3次?！居?jì)算成果】n×VVs×m顯色反映后，分別統(tǒng)計(jì)樣品管混合液的吸光度（ODsn×VVs×m還原型谷胱甘肽含量（μmol/g）=式中，n為由原則曲線查的的溶液中還原型谷胱甘肽物質(zhì)的量（μmol）；V為樣品提取液總體積（ml）；Vs為吸取樣品液體積（ml）；m為樣品質(zhì)量（g）?！咀⒁馐马?xiàng)】1.在提取樣品時(shí)，需要沉淀出去蛋白質(zhì)，以方志蛋白質(zhì)中所含巰基及有關(guān)酶對(duì)測(cè)定成果的影響。2.運(yùn)用本辦法還能夠測(cè)定樣品中總谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量。在谷胱甘肽還原酶（GR）作用下，將GSSG還原成GSH再進(jìn)行測(cè)定和計(jì)算。3.建議在第一次測(cè)定時(shí)先做2或3個(gè)樣品本底對(duì)照，如果樣品中本底對(duì)照和空白對(duì)照非?？拷?，則闡明樣品液中不存在干擾物質(zhì)，能夠不再檢測(cè)樣品本底對(duì)照。MDAR(單脫氫抗壞血酸還原酶)活性的測(cè)定（MustafaErkanandWen-ChiHou,,1999）MDAR提?。浩胀ㄈ?.2g材料于預(yù)冷的研缽中，分三次加入0.05mol/L（PH7.3）的磷酸鉀緩沖液（預(yù)冷）1.8ml（難磨的材料能夠加入適量的石英砂），在冰浴上研磨至勻漿，然后移到2.0ml的離心管（沖洗），于4℃1r/min下離心20min，上清液即為MDAR粗提液，將其放入冰箱中備用（-20℃或-80℃，在液氮中快速冷卻）。MDAR的測(cè)定：酶活性的測(cè)定的反映體系涉及：2.7ml的預(yù)冷磷酸鉀緩沖液（0.05mol/L，pH7.3）+0.1ml的NADH（0.2mmol/L）+0.1ml的ASA（1.0mmol/L）+0.001ml的AAO（1.0U）+0.1ml的酶提取液，以不加酶液的體系為對(duì)照，在340nm下測(cè)OD值的變化。GR（谷胱苷肽還原酶）測(cè)定試劑配備50mMPBS（K）（pH7.0，含0.2mmolEDTA,與APX的相似）：K2HPO4·3H2O6.9607g+KH2PO42.6538g混合后定容到1L；然后加入292.25×0.2=58.45gEDTA;10mMGSSG（用水配）：612.63×10×0.001=6.126g溶于1L水中;2.4mMNADPH（用PBS配）：833.4×2.4×0.001=2.0g溶于1L水中.實(shí)際配備50mMPBS（K）:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*1.7ml*3次測(cè)定=91.8ml;（實(shí)際配備150ml,實(shí)際用量58.45g*0.15=8.7675g）10mMGSSG:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測(cè)定=5.4ml;（實(shí)際配備50ml,實(shí)際用量6.126g*0.05=0.3063g）2.4mMNADPH:3個(gè)解決*2個(gè)品種*3次重復(fù)*0.1ml*3次測(cè)定=5.4ml;（實(shí)際配備50ml,實(shí)際用量2.0g*0.05=0.1g）二、測(cè)定環(huán)節(jié)用3mL比色杯，依次加入1700μL50mMPBS（K）（pH7.8，含0.2mmolEDTA），100μL10mmolGSSG，100μL2.4mmolNADPH，100μL酶液（葉綠體懸浮液，與APX相似）啟動(dòng)反映，25℃，以NADPH啟動(dòng)發(fā)應(yīng)（指最后加NADPH），測(cè)定OD340