含附子湯劑后烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的藥動學研究

含附子湯劑后烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的藥動學研究

附子是麻痹科植物的子根，具有辛、甜、性熱、有毒等特點。首先記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，并被列為以下產(chǎn)品，但具有回陽、調(diào)陽、補火、調(diào)陽、驅(qū)寒、緩解疼痛等功效。中醫(yī)理論認為,通過科學配伍,可降低附子毒性,發(fā)揮其特長。善用附子者,當首推醫(yī)圣張仲景,《傷寒論》中有相當多的復方應用了附子,其中四逆湯是回陽救逆的經(jīng)典名方,組方簡單,由生附子一枚,配以干姜、炙甘草而成。目前已知烏頭類生物堿是四逆湯中發(fā)揮藥效作用的部分,其中包括烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿等雙酯型二萜類生物堿(diesterditerpenoidalkaloids,DDAs)。DDAs具有毒性,在較低濃度即可產(chǎn)生毒性反應,治療窗窄。已有文獻采用LD50補量法、藥物累積法等對烏頭類生物堿藥動學數(shù)據(jù)進行報道,這些方法可以測得表觀動力學參數(shù),但方法間參數(shù)有一些差異。李銳等用LC法測定了犬血清中的烏頭堿濃度并計算藥動學參數(shù),但血清用量大,且方法靈敏度不高。王朝虹等以LC-MS為手段測定了大鼠經(jīng)口給予烏頭堿單體(0.5mg/kg)后的藥動學參數(shù)。Zhang等也報道了用LC-MS同時測定血漿中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿濃度的方法,但在所建立方法下,靈敏度不高,并未能獲得完整的藥動學數(shù)據(jù)。目前已有不少文獻利用LC-MS對生物樣品中的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿進行檢測,主要涉及法醫(yī)毒物分析等,但所建立的方法靈敏度不高,文獻最低定量限做到0.1ng/mL。由于烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿具有毒性,且在湯劑中含量較低,文獻報道方法尚不能測得完整的藥動學曲線,需要建立更為靈敏的方法進行檢測。本文采用簡單的液液萃取,利用LC-MS-MS的選擇反應監(jiān)測(SRM)模式,把最低定量限濃度降至0.01ng/mL,靈敏、專屬地進行了3個成分的同時測定,并完成了4個含附子藥材湯劑的藥動學研究。1材料表面1.1藥品、化學品檢定所生附子、干姜、炙甘草,均購自安徽亳州藥材公司,并由中國藥科大學中藥學院秦民堅教授鑒定。烏頭堿(批號:110720-200410)、新烏頭堿(批號:110799-200404)和次烏頭堿(批號:110798-200404)均購自中國藥品生物制品檢定所;西酞普蘭(純度>98.5%,海南三葉制藥有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);其余試劑均為市售分析純;水為去離子純化水。1.2finningantsqquequatum-n質(zhì)譜儀FinniganHPLC系統(tǒng),FinniganSurveyor自動進樣器,FinniganTSQQuantumUltran質(zhì)譜儀,ESI離子源(美國ThermoElectron公司);BS21S十萬分之一分析天平(德國Satorius公司);PL5242實驗室超純水系統(tǒng)(美國Pall公司)。1.3動物清潔級SD大鼠,雄性,體重180～220g,南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK(蘇)2008-0004。2方法2.1流動相1.4.3色譜柱:LichrospherCN(250mm×4.6mm,5μm,江蘇漢邦科技有限公司);流動相:甲醇-醋酸銨緩沖液(40mmol/L)-甲酸(950∶45∶5);流速:1.0mL/min;柱溫:25℃。2.2堿[m+h]+離子化方式:ESI;掃描方式:SRM;離子模式:正離子;檢測離子:烏頭堿[M+H]+,m/z646.1→586.1;新烏頭堿[M+H]+,m/z632.1→572.1;次烏頭堿[M+H]+,m/z616.1→556.1;內(nèi)標西酞普蘭[M+H]+,m/z325.0→262.0;噴霧電壓5000V;加熱毛細管溫度350℃;源碰撞誘導解離電壓10eV;碰撞能為35eV;鞘氣(N2)壓力2.07×105Pa;輔助氣壓力3.45×104Pa;碰撞氣(Ar)壓力為0.20Pa。2.3對照品標準溶液精密稱取烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿各5mg置100mL量瓶中,加入含0.1%HCl的乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻即得50μg/mL對照品儲備液。取儲備液加入含0.1%HCl的乙腈依次稀釋為0.2,0.4,0.8,1.6,8,16,40,200ng/mL的對照品標準溶液。精密稱取西酞普蘭5mg,置100mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻即得50μg/mL西酞普蘭儲備液。取儲備液加入甲醇稀釋得200ng/mL西酞普蘭標準溶液。稱取生附子5g,干姜15g,炙甘草20g,加水600mL,加熱至沸騰并保持1h。藥液趁熱用紗布過濾至250mL量瓶,用少量水洗滌藥渣,過濾,合并濾液和洗液,用水定容,即得藥液a。稱取生附子5g,按相同煎煮條件制備得藥液b。稱取生附子5g,炙甘草20g,按相同煎煮條件制備得藥液c。稱取生附子5g,干姜15g,按相同煎煮條件制備得藥液d。以上各溶液均置于4℃冰箱保存。2.4樣品總離子類化血漿樣品0.1mL,加入西酞普蘭溶液(內(nèi)標)5μL,渦旋30s,加入10%氨水堿化,并加乙酸乙酯1mL,渦旋3min,12000r/min離心3min,上清于40℃水浴用N2吹干,用流動相80μL復溶,12000r/min離心3min,取上清20μL進樣。2.5胃給予制備SD大鼠20只,隨機分為4組,實驗前禁食12h,自由飲水。按22.5mL/kg分別灌胃給予藥液a～d。于給藥前及給藥后0.083,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,3,5,8,12,16,24h從眼底靜脈叢取血0.3mL置肝素化的Eppendorf管中,4000r/min離心10min,分離血漿,置-20℃冰箱保存待測。3結(jié)果3.1不同種堿類所保留時間在本試驗條件下,大鼠血漿中雜質(zhì)不干擾各樣品峰及內(nèi)標峰,烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿及內(nèi)標的保留時間分別為3.95,3.97,4.05,3.89min(見圖1)。基質(zhì)效應考察后發(fā)現(xiàn)無明顯基質(zhì)效應。3.2血藥濃度權重的選擇取大鼠空白血漿0.1mL,加入不同濃度的標準品5μL,使其質(zhì)量濃度分別為0.01,0.02,0.04,0.08,0.4,0.8,2,10ng/mL,按“2.4”項處理,利用標準品峰面積與內(nèi)標峰面積比(R)對血藥濃度(c)作權重回歸?；貧w曲線表明,烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿均在0.01～10ng/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系,定量下限為0.01ng/mL,回歸方程分別為:烏頭堿,c=374×R+4.68;新烏頭堿,c=372×R+5.00;次烏頭堿,c=328×R+6.44。權重系數(shù)w=1/c2。3.3回收率的測定配制各含烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿0.02,0.4,2ng/mL低、中、高3個濃度的標準含藥血漿,按“2.4”項處理,記錄圖譜,根據(jù)標準曲線方程計算濃度,測得濃度和加入濃度的比值即為準確度。在批內(nèi)和批間(3d)對低、中、高3個濃度各做5份樣品,測得烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿3個濃度的批內(nèi)和批間相對標準偏差(RSD)。按照“2.4”項處理低、中、高3個濃度的標準含藥血漿,并將對應濃度的標準品吹干復溶作為對照品溶液,進樣分析,計算提取回收率,結(jié)果見表1。由表1可見,烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的準確度、精密度和提取回收率試驗的結(jié)果均符合生物樣品分析要求。3.4樣品穩(wěn)定性測定分別考察了血漿樣品室溫放置6h,-20℃反復凍融3次及-20℃冷凍放置1個月,結(jié)果表明樣品在儲存及測定過程中均穩(wěn)定。進樣器放置12h樣品無明顯變化。標準工作液及儲備液,由于樣品在偏酸性的非質(zhì)子性溶劑中,非常穩(wěn)定,6個月內(nèi)無顯著變化。3.5大鼠體內(nèi)藥物采用DAS2.0軟件以統(tǒng)計矩法求算相應的藥動學參數(shù),結(jié)果見表2。測得的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。4樣品的提取已有文獻報道采用固相萃取(SPE)、液液萃取(LLE)、蛋白沉淀等方法處理此類化合物的生物樣品?？紤]到靈敏度及基質(zhì)效應問題,蛋白沉淀法未予以考慮,本實驗比較了LLE和SPE兩種處理方法,SPE法雖可以得到干凈的樣品,但在低濃度時回收率偏低,LLE法處理樣品簡單快捷,在比較了乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等提取溶劑后發(fā)現(xiàn),用乙酸乙酯提取的樣品無明顯干擾,且回收率較高,在低濃度亦能達到要求,故采用以乙酸乙酯作為提取溶劑的LLE法處理樣品。本實驗優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜條件,流動相中含高比例的有機相,使被測物可以有效洗脫并有好的離子化效率;甲酸的加入有利于質(zhì)譜響應的穩(wěn)定;被測物為含氮化合物,醋酸銨的加入,可以顯著改善色譜峰的峰形。大鼠經(jīng)口給予各湯劑后所得的藥動學結(jié)果表明,藥材配伍對藥動學參數(shù)有影響。大鼠經(jīng)口給予單味附子湯劑后,其中烏頭堿的tmax、MRT0-t與王朝虹等進行的大鼠經(jīng)口給予烏頭堿單體藥動學研究所得的結(jié)果接近,提示附子藥材中共存組分對烏頭堿的藥動學行為影響不大。烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿3個成分的藥動學行為在同一個湯劑中基本一致,但相同的成分在不同湯劑中則因配伍的影響各不相同。單味附子湯劑給藥后烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿的t