四逆湯中附子和甘草對(duì)藥配伍對(duì)烏頭生物堿類成分的影響

四逆湯中附子和甘草對(duì)藥配伍對(duì)烏頭生物堿類成分的影響

四逆湯由附子、干姜和甘草組成。這是“傷寒論”回陽救寒的代表。具有加熱和祛寒、回陽救寒、手足心腎陽虛、陽肩寒和厥證。方中附子主要含有烏頭生物堿類成分,屬于堿性藥,甘草主要含有甘草酸等酸性皂苷類成分,屬于酸性藥,二者是一對(duì)酸堿對(duì)藥,在方劑中常常配伍使用,如四逆湯、通脈四逆湯、四逆加人參湯等。早年筆者曾采用薄層掃描法對(duì)四逆湯中甘草對(duì)附子的解毒作用做過研究,證明四逆湯方中隨甘草劑量的增加,烏頭生物堿含量降低。張宇等的離子對(duì)萃取-分光光度法的實(shí)驗(yàn)表明了附子與甘草配伍煎煮生物堿類成分含量降低。本研究從酸堿對(duì)藥的角度系統(tǒng)研究了甘草中的甘草酸與附子中的主要烏頭生物堿類成分在四逆湯中配伍后提取量的變化情況。1藥品、藥材與藥品檢驗(yàn)所Waters515系列高效液相色譜儀;2996二極管陣列檢測(cè)器;M32色譜工作站。附子為毛茛科植物烏頭AconitumcarmicaeliDebx.的子根,采自四川省江油縣;甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖,山西省大同市藥品檢驗(yàn)所張朔生副主任藥師提供;干姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的干燥根莖,購(gòu)自四川省五塊石藥材市場(chǎng)。以上藥材均由山西中醫(yī)學(xué)院裴香萍講師鑒定為正品。烏頭堿(批號(hào)110720-200410)、新烏頭堿(批號(hào)110799-200404)、次烏頭堿(批號(hào)110798-200404)、甘草酸單銨鹽(批號(hào)110731-200510)以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。色譜測(cè)定用水為重蒸水,甲醇為色譜純,其他所用試劑均為分析純。2方法2.1加味甘草提取液、水制備按四逆湯處方比例(附子、甘草、干姜處方比3∶3∶2),精密稱取附子、甘草單味藥、附子與甘草對(duì)藥、四逆湯全方,分別加水煎煮2次,一部分提取液雙層紗布濾過,一部分提取液經(jīng)離心處理,作為水煎液與水煎離心液。精密稱取單味藥、對(duì)藥及全方,分別加95%乙醇回流提取2次,每次1h,作為乙醇提取液。2.2測(cè)定了氨基丙烯酸的含量2.2.1雙酯型頭皮氧化物水zeaHypersilBDSC18柱(4.6mm×150mm,5μm);檢測(cè)波長(zhǎng)230nm;流速1.0mL·min-1;柱溫室溫;其中雙酯型烏頭生物堿的流動(dòng)相甲醇-水(65∶35),水中含0.08%三乙胺;單酯型烏頭生物堿的流動(dòng)相甲醇-水(42∶58),水中含0.2%三乙胺、0.3%冰醋酸。2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品,分別加甲醇制成0.28,0.40,0.40g·L-1的溶液,搖勻,0.45μm濾膜過濾后作為對(duì)照品溶液。2.2.3供試品溶液的制備分別取相當(dāng)于附子3.0g的上述水提取液,用濃鹽酸調(diào)pH至2,乙醚萃取2次,每次50mL,棄去乙醚液,水層用濃氨水調(diào)pH至10,用乙醚萃取4次,第1次50mL,以后每次40mL,合并乙醚液,蒸干,殘?jiān)佣燃淄?甲醇(70∶30)溶解并轉(zhuǎn)移至5mL量瓶?jī)?nèi),加二氯甲烷-甲醇(70∶30)稀釋至刻度,搖勻,作為水煎液與水煎離心液的供試品溶液。分別取相當(dāng)于附子3.0g的上述乙醇提取液,蒸干,殘?jiān)铀D(zhuǎn)移至分液漏斗中,同法萃取制備乙醇提取液的供試品溶液。2.2.4方法研究2.2.4.精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)對(duì)線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率等方法學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了考察。烏頭堿在0.0504～1.008μg、新烏頭堿在0.3008～6.016μg、次烏頭堿在0.1024～2.048μg呈良好的線性,相關(guān)系數(shù)分別為0.9996,0.9995,0.9996;3種烏頭類生物堿精密度試驗(yàn)RSD分別為1.9%,1.1%,1.0%;24h穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD分別為1.6%,1.0%,1.2%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD分別為1.5%,1.4%,1.5%;烏頭堿平均回收率為99.72%,RSD2.3%;新烏頭堿平均回收率為98.82%,RSD1.6%;次烏頭堿平均回收率為100.28%,RSD2.3%。2.2.4.供試品溶液穩(wěn)定性由于未取得單酯型烏頭生物堿的化學(xué)對(duì)照品,故采用新烏頭堿作為外標(biāo)參照物考察了穩(wěn)定性與重復(fù)性。供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好,單酯型新烏頭堿RSD1.2%、單酯型烏頭堿RSD1.7%、單酯型次烏頭堿RSD2.0%;重復(fù)性試驗(yàn)單酯型新烏頭堿RSD1.2%、單酯型烏頭堿RSD2.1%、單酯型次烏頭堿RSD1.7%。2.3甘草酸的含量2.3.1流動(dòng)相-0.2mol-1醋酸銨溶液液相Diamonsil(鉆石)C18柱(4.6mm×200mm,5μm);流動(dòng)相甲醇-0.2mol·L-1醋酸銨溶液(含3.03%冰醋酸)(67∶33);檢測(cè)波長(zhǎng)250nm;流速1.0mL·min-1;柱溫室溫。2.3.2對(duì)照溶液的制備精密稱取甘草酸單銨鹽對(duì)照品,加甲醇制成0.22g·L-1的溶液,搖勻,0.45μm濾膜過濾后作為對(duì)照品溶液。2.3.3供試品溶液的制備分別取相當(dāng)于甘草0.15g的上述水提取液,濃縮至約5mL,用95%的乙醇(含8%鹽酸)溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為水煎液與水煎離心液的供試品溶液。分別取相當(dāng)于甘草0.15g的上述乙醇提取液,放冷,濾過,濾液作為乙醇提取液的供試品溶液。2.3.4方法學(xué)考察以檢測(cè)甘草酸的四逆湯水煎液作為方法學(xué)考察的供試品溶液。試驗(yàn)中對(duì)線性范圍、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率等方法學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了考察。甘草酸單銨鹽在0.9208～4.6040μg呈良好線性,相關(guān)系數(shù)為0.9996;精密度試驗(yàn)RSD2.2%;10h穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD1.8%;重復(fù)性試驗(yàn)RSD1.3%;平均回收率為98.31%,RSD1.8%。3綜合研究的結(jié)果3.1單藥、對(duì)藥、全方的配伍對(duì)甘草酸提取量的影響附子在煎煮過程中所含雙酯型烏頭堿類成分水解成單酯型烏頭堿類,水煎液和水煎離心液,提取量均隨著單藥、對(duì)藥、全方的配伍變化逐漸降低(表1),甘草酸提取量也具有相同的變化趨勢(shì)(表2)。對(duì)藥煎煮液與對(duì)藥煎煮離心液、全方煎煮液與全方煎煮離心液兩兩比較,煎煮離心液中單酯型烏頭堿類成分及甘草酸提取量略有下降,但幅度不大(表1,2)。3.2不同種類頭皮原則采用乙醇提取,生物堿類成分既可檢測(cè)到單酯型烏頭生物堿類,也可檢測(cè)到雙酯型烏頭生物堿類。單酯型烏頭生物堿類成分隨著單藥、對(duì)藥、全方的配伍變化提取量均逐漸降低;雙酯型烏頭生物堿類成分隨著單藥、對(duì)藥、全方的配伍變化提取逐漸升高(表3)。隨著單藥、對(duì)藥、全方的配伍變化,甘草酸的提取量逐漸降低(表2)。4逆湯中導(dǎo)藥成分的提取附子所含烏頭生物堿類成分及甘草中甘草酸的含量測(cè)定方法已有較多報(bào)道,筆者參照文獻(xiàn)方法建立了本實(shí)驗(yàn)樣品液中的烏頭生物堿及甘草酸的含量測(cè)定方法,由于未取得單酯型烏頭生物堿的化學(xué)對(duì)照品,參考文獻(xiàn)的方法分別將烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的化學(xué)對(duì)照品進(jìn)行水解,用水解物的色譜峰與供試液的色譜峰進(jìn)行了比對(duì),確定了單酯型烏頭生物堿的出峰位置。而單酯型烏頭生物堿的定量分析以新烏頭堿作為外標(biāo)參照物。經(jīng)考察表明所建立的方法重復(fù)性好,準(zhǔn)確可行。水提取液中單酯型烏頭生物堿隨著單藥、對(duì)藥、全方的配伍變化提取量漸次降低,且變化明顯(對(duì)藥提取量為單味藥的66.3%、全方為38.0%),甘草酸提取量也有相同趨勢(shì),但變化不明顯(對(duì)藥與全方甘草酸的提取量分別為單味藥的91.5%,86.8%)。比較單味藥與對(duì)藥的提取量變化可見,酸堿對(duì)藥甘草與附子在合煎時(shí)形成了沉淀,導(dǎo)致烏頭生物堿類成分及甘草酸提取量的減損;全方較對(duì)藥酸堿性成分的提取量也降低,說明四逆湯中的干姜可促進(jìn)甘草酸與烏頭生物堿沉淀的形成,進(jìn)一步證實(shí)筆者過去的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道,四逆湯中干姜除助附子溫陽為臣藥外,亦可降低附子毒性,有一定佐制作用。由于甘草中所含甘草酸的量(4.79%)遠(yuǎn)較附子中所含烏頭生物堿的量(0.13%)為多,故使甘草酸對(duì)烏頭生物堿提取量的影響強(qiáng)于烏頭生物堿對(duì)甘草酸的影響,由此可見,四逆湯配伍后甘草可緩和附子辛烈之性,又不影響甘草“益氣補(bǔ)中,治虛寒之本”作用的發(fā)揮。為考察酸、堿性成分形成大分子復(fù)合物的穩(wěn)定性,筆者對(duì)煎液采用了2種處理,紗布濾過在藥液中保留煎煮過程中形成的沉淀物,煎液離心處理則將沉淀物完全除去。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中水煎液與水煎離心的對(duì)藥與對(duì)藥、全方與全方進(jìn)行兩兩比較,烏頭生物堿與甘草酸的提取量均變化不大(對(duì)藥煎煮液與水煎離心液,烏頭生物堿的提取量分別為單味藥的66.3%,61.9%,甘草酸分別為單味藥的91.5%,87.4%;全方煎煮液與水煎離心液,烏頭生物堿的提取量分別為單藥提取量的38.0%,35.3%,甘草酸分別為單味藥的86.8%,82.1%),說明水煎液中保留的大分子復(fù)合物非常穩(wěn)定,在酸、堿處理時(shí)幾乎不解離。若水煎液中含有的大分子復(fù)合物沉淀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差,則會(huì)在測(cè)定過程中用酸、堿處理時(shí)被解離,使檢測(cè)量明顯高出完全除去不溶性沉淀的水煎液離心液。筆者還對(duì)甘草與附子合煎形成的沉淀物進(jìn)行人工胃液與腸液的溶解、解離試驗(yàn),結(jié)果在人工胃液與腸液中未檢出烏頭生物堿和甘草酸,也證實(shí)了烏頭堿-甘草酸復(fù)合物的穩(wěn)定性。水煎煮使附子中雙酯型烏頭生物堿幾乎全部水解,只能檢測(cè)到單酯型烏頭生物堿,而乙醇回流可使藥材中近一半(49.4%)的雙酯型烏頭生物堿被保留,且隨著單藥、對(duì)藥、全方的配伍變化,提取量還有所增加。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明①雙酯型烏頭生物堿在乙醇中較為穩(wěn)定,因此在用乙醇提取時(shí),不易水解成單酯和原堿型烏頭生物堿,但對(duì)附子來說,因其所含雙酯型烏頭生物堿毒性較大,在臨床和工業(yè)生產(chǎn)中已不允許用生附子入藥,制附子中雙酯型烏頭生物堿已微乎其微,當(dāng)然也就不需要顧及其水解不水解的問題了;②甘草、干姜中所含的成分增加了雙酯型烏頭生物堿在乙醇中的溶解度;③以乙醇為溶媒回流提取酸、堿性成分不易形成大分子復(fù)合物。全方乙醇