烏頭堿對(duì)大鼠心律失常模型的影響

烏頭堿對(duì)大鼠心律失常模型的影響

現(xiàn)在，對(duì)抗心力衰竭藥物模型的篩選和評(píng)價(jià)存在許多問(wèn)題：1。體動(dòng)物模型對(duì)藥物反應(yīng)的影響因素多，藥物反應(yīng)的動(dòng)物與人體差異大，甚至存在質(zhì)差異。2.烏霉堿通常被認(rèn)為是誘導(dǎo)大鼠心律失常模型，并且大多數(shù)陽(yáng)性對(duì)照藥物的療效不佳。3.大腿骨移植引起的復(fù)發(fā)性心律失常模型更多，主要表現(xiàn)為大腿骨移植后的大變化，通道位置難以每個(gè)位置，受體速度也會(huì)影響心律失常的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別和體重影響模型的穩(wěn)定性和可靠性。上述因素嚴(yán)重影響了抗心律失常藥物的評(píng)價(jià)和篩選。因此急需穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確的篩選和評(píng)價(jià)抗心律失常藥物的模型。本文應(yīng)用酶解法分離單細(xì)胞,結(jié)合膜片鉗技術(shù),建立單細(xì)胞篩選和評(píng)價(jià)抗心律失常藥物模型。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)特殊病原微生物大鼠,♀♂各半,體重200～250g(Ⅱ級(jí),No09-2-1),由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2電極液mmoll-1臺(tái)氏液含(mmol·L-1):NaCl126,KCl5.4,MgCl21,CaCl21.8,NaH2PO40.33,glucose10,HEPES10,NaOH調(diào)pH為7.4;KB(Kraftbrune)保存液含(mmol·L-1):glutamicacid70,taurine15,KCl30,KH2PO410,MgCl20.5,egtazicacid(EGTA)0.5,HEPES10,glucose10,1%albumin,KOH調(diào)pH為7.4;電極液(mmol·L-1):KCl20,potassiumasparate110,MgCl21,HEPES5,EGTA10,Na2ATP5,KOH調(diào)pH為7.2。膠原酶(Ⅱ型),EGTA,?；撬?小牛血清蛋白(BSA)以及烏頭堿均購(gòu)自Sigma公司。1.3對(duì)心臟組織的分離方法同以前文獻(xiàn)報(bào)道將大鼠用2%的戊巴比妥鈉麻醉后開(kāi)胸,迅速取出心臟,主動(dòng)脈逆行插管連于Langendorff灌流裝置上,以正常臺(tái)氏液約8ml·min-1連續(xù)灌流5min,洗去心臟殘血,然后用無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流約10min,心臟停止搏動(dòng)后,應(yīng)用含0.05%Ⅱ型膠原酶的無(wú)鈣液灌流分離心臟單細(xì)胞,當(dāng)心臟變軟、色澤變淺時(shí)開(kāi)始取心肌組織,每隔2min取1次。以上操作均在37℃恒溫,并充0.95O2+0.05CO2條件下進(jìn)行。將不同時(shí)間取下的心室肌組織放于裝有KB液的試管中,用吸管輕輕吹打,使之分散成單個(gè)細(xì)胞,置于4℃冰箱穩(wěn)定1h待用。選擇桿狀、耐鈣、橫紋清晰無(wú)顆粒的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。1.4細(xì)胞外液的脈沖激光雷達(dá)實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞離子電流。所用微電極用兩步法拉制而成,制成的微電極充灌電極液后電阻在2～3MΩ之間。將準(zhǔn)備好的微電極連于膜片鉗儀(Axopatch200B,AxonUSA)的探頭上。分離好的單細(xì)胞置于浴槽中,用正常臺(tái)氏液以3ml·min-1恒速灌流沖洗細(xì)胞表面,形成高阻封接(>10GΩ)后,用脈沖式抽吸打破細(xì)胞膜,形成全細(xì)胞構(gòu)型,用電壓鉗和電流鉗模式進(jìn)行刺激和記錄。實(shí)驗(yàn)過(guò)程由計(jì)算機(jī)軟件pCLAMP6.04(AxonInstrument)控制,數(shù)-模轉(zhuǎn)換器完成刺激信號(hào)的產(chǎn)生、反饋信號(hào)的采集以及數(shù)據(jù)分析。電極液和細(xì)胞外液之間的液接電位(10～11mV)未補(bǔ)償。信號(hào)輸入經(jīng)過(guò)1KHz的濾波,數(shù)據(jù)存于計(jì)算機(jī)硬盤以便分析。實(shí)驗(yàn)在室溫(19～22℃)下進(jìn)行。2觀測(cè)指標(biāo)2.1動(dòng)作電位apd形成全細(xì)胞構(gòu)型后,應(yīng)用電流鉗,在保持電壓0mV條件下,給予一持續(xù)2ms的80mV的脈沖刺激,使心肌細(xì)胞產(chǎn)生一次動(dòng)作電位。2.2mmoll-1的制備大鼠心室肌細(xì)胞鈉電流的記錄是在細(xì)胞外液中低鈉(5mmol·L-1,其余用等滲氯化膽堿取代)、室溫下進(jìn)行。保持電壓-80mV,刺激電壓從-70mV開(kāi)始,以10mV步階階躍至+30mV。2.3cshs的取代在室溫下(19～22℃),將細(xì)胞外液中的NaCl用等摩爾的氯化膽堿取代,用CsCl和CsOH分別取代相應(yīng)的KCl和KOH,即無(wú)鈉、無(wú)鉀外液,電極液同樣無(wú)鈉鉀,從而排除鈉電流、鉀電流的干擾。在鉗制電壓模式下記錄,保持電壓-80mV,刺激電壓從-40mV起以10mV步階給予去極化刺激至+50mV,持續(xù)時(shí)間100ms,間隔時(shí)間10s。2.4鉀電流大鼠心肌細(xì)胞以瞬時(shí)外向鉀電流(Ito)為主,同時(shí)記錄內(nèi)向整流鉀電流(Ik1)。2.5統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。用配對(duì)t檢驗(yàn)分析給藥前后動(dòng)作電位時(shí)程和離子電流的變化。3結(jié)果3.1-mol-1和apd50對(duì)大鼠心肌動(dòng)作電位的影響形成全細(xì)胞構(gòu)型后,在電流鉗模式下記錄正常動(dòng)作電位,鉗制5min后,給予烏頭堿1μmol·L-1,分別記錄給藥后1、5、10min的動(dòng)作電位,給藥15min后用正常臺(tái)氏液以3ml·min-1沖洗,沖洗15min后記錄動(dòng)作電位時(shí)程。結(jié)果表明烏頭堿能夠延長(zhǎng)APD,使大鼠心肌細(xì)胞復(fù)極50%的動(dòng)作電位時(shí)程(APD50)由(103.35±7.71)ms延長(zhǎng)至(176.4±16.43)ms,使復(fù)極90%的動(dòng)作電位時(shí)程(APD90)由(150.23±7.02)ms延長(zhǎng)至(236.03±23.22)ms(P<0.01,n=8),但APD50,APD90沖洗15min后恢復(fù)不明顯。應(yīng)用奎尼丁10μmol·L-1后APD90進(jìn)一步延長(zhǎng)至(316.15±67.39)ms,與烏頭堿組比較有顯著意義。但應(yīng)用維拉帕米10μmol·L-1后動(dòng)作電位時(shí)程恢復(fù)近正常。結(jié)果見(jiàn)Tab1及Fig1,2。3.2除極化電壓下mv將分離好的大鼠心室肌單細(xì)胞置于1ml灌流槽中,細(xì)胞附壁后,以正常臺(tái)氏液灌流沖洗,形成全細(xì)胞構(gòu)型后,保持電壓-80mV,以10mV步階階躍至+40mV,持續(xù)時(shí)間100ms,分別記錄各除極化電壓下的電流。結(jié)果提示灌注烏頭堿1μmol·L-15min后,發(fā)現(xiàn)烏頭堿增加INa,當(dāng)除極電壓在-50mV時(shí)INa從(254±55.3)pA增加至(4530.2±475.1)pA(n=4,P<0.01);當(dāng)灌注奎尼丁5min后INa電流被抑制,應(yīng)用奎尼丁10min后抑制率為33.59%,結(jié)果見(jiàn)Fig3,4。3.3灌注東北部小鼠心肌組織ica-l本研究中ICa-L記錄過(guò)程無(wú)衰減(衰減5%則棄之不用),實(shí)驗(yàn)中浴槽液體及電極液無(wú)鈉鉀,從而排除鈉、鉀電流的干擾。記錄ICa-L保持電壓-40mV,刺激波寬300ms,步階電壓10mV。大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L電流峰值在刺激電壓0mV至10mV區(qū)間,當(dāng)灌注1μmol·L-1烏頭堿5min后,ICa-L增加,除極0mV電位時(shí)ICa-L從(727.9±178.0)pA增加至(1082.1±222.2)pA(n=6,P<0.01)。灌注烏頭堿使大鼠心室肌細(xì)胞ICa-L增加時(shí),灌注維拉帕米10μmol·L-15min后發(fā)現(xiàn)維拉帕米減少烏頭堿誘發(fā)的ICa-L增加,15min后作用最強(qiáng),抑制率達(dá)120%。此作用不是ICa-L的衰減,因用正常臺(tái)氏液沖洗后該電流恢復(fù)正常。結(jié)果見(jiàn)Fig5,6。3.4鉆頭堿對(duì)ik1表達(dá)的影響全細(xì)胞構(gòu)型形成后,在電壓鉗模式下記錄Ik1電流。Ik1電流的激活:保持電壓固定于-40mV,在-120～+60mV之間,每隔10mV連續(xù)給予超極化和去極化刺激,脈沖持續(xù)300ms,刺激間隔時(shí)間10s。以300ms穩(wěn)態(tài)值作為測(cè)定Ik1電流值。預(yù)先在細(xì)胞外液中加入CdCl2300μmol·L-1以阻斷ICa。結(jié)果表明,烏頭堿增加內(nèi)向整流鉀電流的內(nèi)向成分,在-120mV的刺激電壓下,Ik1的內(nèi)向成分從(2007.1±359.3)pA增加至(2317.7±401.8)pA(n=10,P<0.01),在實(shí)驗(yàn)電壓-30mV條件下,烏頭堿減弱Ik1的內(nèi)向整流趨勢(shì),即電流由正常的(-22.796±9.20)pA增加為外向趨勢(shì)(2.98±1.89)pA(n=10,P<0.01)。烏頭堿對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞Ik1的作用如Fig7,8所示。3.5ito的電流幅度細(xì)胞外液中應(yīng)用Cd2+0.3mmol·L-1,Ba2+0.2mmol·L-1分別阻斷ICa和Ik1,從保持電壓-70mV激活至+40mV,步階電壓為10mV,持續(xù)1000ms,以外向電流峰值表示Ito的電流幅度。結(jié)果表明烏頭堿具有一定的抑制瞬時(shí)外向鉀電流的作用,實(shí)驗(yàn)電壓為+50mV時(shí),Ito外向電流峰值由正常對(duì)照的(3391.4±522.3)pA下降到(2956.3±504.9)pA(P<0.01,n=6fromsixrats)。結(jié)果如Fig9,10所示。4抗心力衰竭藥物篩選及評(píng)價(jià)指標(biāo)4.1結(jié)合拉多通道改良型模型一個(gè)理想的抗心律失常藥物自身對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程無(wú)縮短作用,但應(yīng)使烏頭堿延長(zhǎng)的動(dòng)作電位時(shí)程縮短或恢復(fù)正常,維拉帕米有此作用,可作為此模型的陽(yáng)性對(duì)照藥。4.2鈉電流陽(yáng)性對(duì)照藥可選奎尼丁,應(yīng)用奎尼丁后鈉電流幅度低于正常值,但奎尼丁過(guò)度延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程,臨床表現(xiàn)為具有誘發(fā)LQT的潛在危害。4.3鈣Ⅳ類抗心律失常藥物應(yīng)具有抑制烏頭堿增加L-型鈣電流的作用,陽(yáng)性對(duì)照藥可選維拉帕米。5抗心律失常藥物的篩選模型抗心律失常藥物的研制開(kāi)發(fā)仍然是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),但近年來(lái)開(kāi)發(fā)成功應(yīng)用于臨床的藥物卻微乎其微,且藥物開(kāi)發(fā)中往往因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型的結(jié)果和臨床人體對(duì)藥物反應(yīng)差距較大,影響了新藥研制開(kāi)發(fā)。傳統(tǒng)的抗心律失常藥物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型均存在共同的不足,如個(gè)體差異大、臨床符合率低等。因此,建立新的抗心律失常藥物篩選模型是新藥開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。以往研究證明烏頭堿是INa激動(dòng)劑,是該試劑誘發(fā)心律失常的機(jī)制,我們研究證明其對(duì)INa有促進(jìn)作用,但對(duì)ICa-L和IK1亦有明顯的增加作用,對(duì)Ito呈現(xiàn)抑制作用,明顯延長(zhǎng)APD,這些也是烏頭堿誘發(fā)心律失常的主要機(jī)制,對(duì)烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常模型陽(yáng)性對(duì)照藥以往選奎尼丁,但此研究結(jié)果提示陽(yáng)性對(duì)照藥應(yīng)首選胺碘酮、維拉帕米。近年來(lái)時(shí)有報(bào)道烏頭堿誘發(fā)嚴(yán)重的心律失常,應(yīng)用胺碘酮治療療效甚好。但由于對(duì)烏頭堿誘發(fā)心律失常的離子機(jī)制仍認(rèn)為是激動(dòng)鈉通道,限制了對(duì)烏頭堿中毒的成功治療。除少數(shù)幾個(gè)抗心律失常藥物外,多數(shù)抗心律失常藥物往往不同程度延長(zhǎng)APD,過(guò)度延長(zhǎng)APD易出現(xiàn)長(zhǎng)Q-T間期綜合征,誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型心律失常,一個(gè)理想的抗心律失常藥物應(yīng)適度抑制INa,ICa-L和IK1,對(duì)APD適度延長(zhǎng)或使APD恢復(fù)正常水平。本研究建立的藥物篩選模型,選擇單個(gè)心室肌細(xì)胞作為研究對(duì)象,以電生理指標(biāo)為觀測(cè)指標(biāo),同時(shí)觀察了目前公認(rèn)的幾大類陽(yáng)性藥物對(duì)本模型中烏頭堿誘發(fā)的大鼠單個(gè)心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程和離子電流改變的治療作用,結(jié)果表明,Ⅰ類抗心律失常藥物奎尼丁具有抑制烏頭堿增加鈉內(nèi)流的作用,但研究發(fā)現(xiàn),該藥物加重烏頭堿誘發(fā)的動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng),這也與臨床上奎尼丁誘發(fā)長(zhǎng)Q-