生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

./實(shí)驗(yàn)一糖類(lèi)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)糖類(lèi)的顏色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私馓穷?lèi)某些顏色反應(yīng)的原理。學(xué)習(xí)應(yīng)用糖的顏色反應(yīng)鑒別糖類(lèi)的方法。顏色反應(yīng)α-萘酚反應(yīng)原理糖在濃無(wú)機(jī)酸〔硫酸、鹽酸作用下,脫水生成糠醛及糠醛衍生物,后者能與α-萘酚生成紫紅色物質(zhì)。因?yàn)榭啡┘翱啡┭苌飳?duì)此反應(yīng)均呈陽(yáng)性,故此反應(yīng)不是糖類(lèi)的特異反應(yīng)。器材試管及試管架,滴管試劑莫氏試劑：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.稱(chēng)取α-萘酚5g,溶于95％酒精中,總體積達(dá)100mL,貯于棕色瓶。用前配制。1％葡萄糖溶液100mL1％果糖溶液100mL1％蔗糖溶液100mL1％淀粉溶液100mL0.1％糠醛溶液100mL濃硫酸500mL實(shí)驗(yàn)操作取5支試管,分別加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、0.1％糠醛溶液各1mL。再向5支試管中各加入2滴莫氏試劑,充分混合。傾斜試管,小心地沿試管壁加入濃硫酸1mL,慢慢立起試管,切勿搖動(dòng)。觀(guān)察記錄各管顏色。間苯二酚反應(yīng)原理在酸作用下,酮醣脫水生成羥甲基糠醛,后者再與間苯二酚作用生成紅色物質(zhì)。此反應(yīng)是酮醣的特異反應(yīng)。醛糖在同樣條件下呈色反應(yīng)緩慢,只有在糖濃度較高或煮沸時(shí)間較長(zhǎng)時(shí),才呈微弱的陽(yáng)性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)條件下蔗醣有可能水解而呈陽(yáng)性反應(yīng)。器材試管及試管架,滴管試劑塞氏試劑：0.05％間苯二酚－鹽酸溶液1000mL,稱(chēng)取間苯二酚0.05g溶于30mL濃鹽酸中,再用蒸餾水稀至10001％葡萄糖溶液100mL1％果糖溶液100mL1％蔗糖溶液100mL實(shí)驗(yàn)操作取3試管,分別加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液各0.5mL。再向3支試管中各加入塞氏試劑5mL,充分混合。將試管同時(shí)放入沸水浴中,。觀(guān)察記錄各管顏色。<二>糖類(lèi)的還原作用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、理解并掌握糖類(lèi)的還原性質(zhì)；2、學(xué)習(xí)常用的鑒定糖類(lèi)還原性的方法。3、了解斐林氏、本尼迪克特試法檢驗(yàn)糖的原理。二、實(shí)驗(yàn)原理還原糖是指含有自由醛基〔如葡萄糖或酮基〔如果糖的單糖和某些二糖〔如乳糖和麥芽糖。在堿性溶液中,還原糖能將Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金屬離子還原,而糖本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類(lèi)的這種性質(zhì)常被用于糖的定性和定量測(cè)定。三、器材試管及試管架,水浴鍋電爐四、試劑1斐林試劑甲液氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1g/mL的溶液。乙液硫酸銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05g/mL的溶液。2本尼迪克特試劑31％葡萄糖溶液100mL41％果糖溶液100mL5、1％蔗糖溶液100mL五實(shí)驗(yàn)操作六思考題1、斐林氏、本尼迪克特試法檢驗(yàn)糖的原理是什么？2、試比較斐林氏、本尼迪克特試法的方法。實(shí)驗(yàn)二總糖的測(cè)定蒽酮比色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆蛰焱y(cè)定可溶性糖含量的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理強(qiáng)酸可使糖類(lèi)脫水生成糠醛,生成的糠醛或羥甲基糖醛與蒽酮脫水縮合,形成糠醛的衍生物,呈藍(lán)綠色,該物質(zhì)在620nm處有最大吸收。在10-100ug圍其顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。這一方法有很高的靈敏度,糖含量在30ug左右就能進(jìn)行測(cè)定,所以可做為微量測(cè)糖之用。一般樣品少的情況下,采用這一方法比較合適。三、儀器、試劑和材料1.儀器<1>分光光度計(jì)<2>電子頂載天平<3>三角瓶：50m1X1<4>大試管：9支<5>試管架,試管夾<6>漏斗,漏斗架<7>容量瓶：50m1X2<8>刻度吸管：1m1X3,2m1X1,5mlX1<9>水浴鍋2.試劑<1>葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：l00ug/ml<2>濃硫酸<3>蒽酮試劑:0.2g蒽酮溶于100ml濃H2SO4中當(dāng)日配制使用。3.材料小麥分蘗節(jié)〔或者其它材料。四、操作步驟1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作取7支大試管,按下表數(shù)據(jù)配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液：管號(hào)1234567葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液〔ml00.10.20.30.40.60.8蒸餾水〔ml10.90.80.70.60.40.2葡萄糖含量〔ug0102030406080在每支試管中立即加入蒽酮試劑4.0m1,迅速浸于冰水浴中冷卻,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加蓋玻璃球,以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起,準(zhǔn)確煮沸l(wèi)0min取出,用流水冷卻,室溫放置10min,在620nm波長(zhǎng)下比色。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量〔ug>作橫坐標(biāo),以吸光值作縱坐標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2.植物樣品中可溶性糖的提取將小麥分蘗節(jié)剪碎至2mm以下,準(zhǔn)確稱(chēng)取1g,放入50m1三角瓶中,加沸水25m1,在水浴中加蓋煮沸10min,冷卻后過(guò)濾,濾液收集在50m1容量瓶中,定容至刻度。吸取提取液2m1,置另一50m1容量瓶中,以蒸餾水稀釋定容,搖勻測(cè)定。3.測(cè)定吸取lml已稀釋的提取液于大試管中,加入4.Oml蒽酮試劑,以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作。比色波長(zhǎng)620nm,記錄吸光度,在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出葡萄糖的含量〔ug。查表所得糖含量<ug>×稀釋倍數(shù)五、結(jié)果處理六、注意事項(xiàng)1該顯色反應(yīng)非常靈敏,溶液中切勿混入紙屑及塵埃。2H2SO4要用高純度的。3不同糖類(lèi)與蒽酮的顯色有差異,穩(wěn)定性也不同。加熱、比色時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格掌握。七、思考題1蒽酮比色測(cè)定糖的原理是什么？2用水提取的糖類(lèi)有哪些？3制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？4分光光度計(jì)的原理是什么？使用時(shí)需要注意哪些？實(shí)驗(yàn)三粗脂肪的提取和定量測(cè)定一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)和掌握粗脂肪提取的原理和測(cè)定方法。2.熟悉和掌握重量分析的基本操作,包括樣品的處理、定量轉(zhuǎn)移、烘干、恒重等。二實(shí)驗(yàn)原理本法為重量法,用脂肪溶劑將脂肪提出后進(jìn)行稱(chēng)量。該法適用于固體和液體樣品,通常將樣品浸于脂肪溶劑,如乙醚或沸點(diǎn)為30-60度的石油醚,借助于索氏提取管進(jìn)行循環(huán)抽提。本法提取的脂溶性物質(zhì)為脂肪類(lèi)似物的混合物,其中含有脂肪,游離脂肪酸,磷脂,酯,固醇,芳香油,某些色素及有機(jī)酸等,因此,稱(chēng)為粗脂肪。用該法測(cè)定樣品含油量時(shí),通常采用沸點(diǎn)低于60度的有機(jī)溶劑,此時(shí),樣品中結(jié)合狀態(tài)的脂類(lèi)〔脂蛋白不能直接提取出來(lái),所以該法又稱(chēng)為游離脂類(lèi)定量測(cè)定法。三儀器、試劑和材料1.儀器索式提取器,分析天平,燒杯,烘箱,干燥器,恒溫水浴,脫脂棉,脫脂濾紙,鑷子2試劑和材料石油醚芝麻或者花生等油料種子。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品的準(zhǔn)備將花生在80度烘箱烘去水分,烘干時(shí)需避免過(guò)熱,冷卻后準(zhǔn)確地稱(chēng)取1克左右放入研缽中研碎,再用濾紙將樣品包裹好放入索氏提取管。注意勿使紙包樣品高于提取管的虹吸部分,研磨后的研缽應(yīng)用濾紙擦凈并將濾紙放入提取管,用少量溶劑洗滌研缽,將溶劑倒入提取管中2.抽提2.1洗凈提取瓶于105度烘干至恒重,記下其重量。裝入石油醚達(dá)提取瓶容積的一半,連接提取器各部分,不能漏氣〔不能用凡士林或真空脂。2.2加熱提?。菏故兔衙啃r(shí)循環(huán)10-20次,約2-2.5小時(shí),用濾紙粗略判斷脂肪是否提取完全。2.3蒸去石油醚,烘干至恒重。3.稱(chēng)量計(jì)算粗脂肪%=脂肪重÷樣品重×100%思考題1、索式提取法提取的為什么是粗脂肪？2、做好本試驗(yàn)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？3、本實(shí)驗(yàn)裝置磨口處為什么不能涂抹凡士林或真空脂？實(shí)驗(yàn)四總氮量的測(cè)定——?jiǎng)P氏定氮法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)微量凱氏定氮法的原理2、掌握微量凱氏定氮法的操作技術(shù),包括標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨含量的測(cè)定,未知樣品的消化、蒸餾、滴定及其含氮量的計(jì)算等。二、實(shí)驗(yàn)原理凱氏定氮法常用于測(cè)定天然有機(jī)物〔如蛋白質(zhì),核酸及氮基酸等的含氮量。天然的含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱時(shí),其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水,而氮?jiǎng)t變成氨,并進(jìn)一步與硫酸作用生成硫酸銨。此時(shí)程稱(chēng)之為"消化"。但是,這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢,通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)的沸點(diǎn),并加入硫酸銅作為催化劑,以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。濃堿可使消化液中的硫酸銨分解,游離出氮,借水蒸汽將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量,一定濃度的硼酸溶液中,硼酸吸收氨后,氨與溶液中的氫離子結(jié)合,生成銨離子,使溶液中氫離子濃度降低。然后用標(biāo)準(zhǔn)無(wú)機(jī)酸滴定,直至恢復(fù)溶液中原來(lái)氫離子濃度為止,最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的當(dāng)量數(shù)〔相當(dāng)于待測(cè)物中氨的當(dāng)量數(shù)計(jì)算出待測(cè)物中的氮量。滴定時(shí)用甲烯藍(lán)和甲基紅混合指示劑,其指示圍為pH5.2-5.6,將NH4H2BO3的藍(lán)色滴至原來(lái)H3BO3的藍(lán)紫色即為終點(diǎn)。本法適用圍0.2-1.0毫克氮。相對(duì)誤差應(yīng)小于2%。三、材料、試劑與器具〔一材料人的血清或豬的血清〔二試劑1、濃硫酸〔化學(xué)純2、30%氫氧化鈉〔分析純?nèi)芤?、0.9%NaCl溶液4、硫酸鉀—硫酸銅混合物：硫酸鉀與硫酸銅〔CuSO4、5H2O以3：1〔W/W的配比混合研磨成粉末。5、2%硼酸6、混合指示劑的配制：方法一：取50毫升0.1%甲烯藍(lán)無(wú)水醇溶液與200毫升0.1%甲基紅無(wú)水乙醇溶液混合配成,貯于棕色瓶備用,這種指示劑酸性時(shí)為紫色,堿性時(shí)為綠色,變色圍窄且靈敏。方法二：0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10毫升與0.1%甲基紅乙醇溶液2毫升混和即成。本指示劑的變色圍為紫紅色灰色綠色7．0.01MHCl8.硼酸一指示劑混合液：取100毫升2%硼酸溶液,滴加混合指示劑貯備液,搖勻后溶液呈現(xiàn)紫紅色即可?！布s加1毫升左右混合指示劑9.標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液〔0.3毫克氮/毫升〔三、器具1、凱氏燒瓶2、消化架3、吸量管〔1毫升、2毫升4、量筒〔10毫升5、凱氏定氮蒸餾裝置6、微量滴定管〔3毫升、5毫升,可讀至0.02毫升7、錐形瓶〔50-100毫升8、容量瓶〔50毫升四、操作步驟〔一樣品的處理血清樣品：取人血〔或豬血,放于離心管中,于冰箱中放置過(guò)液,次日離心除去凝血塊,上層黃色透明清液即為血清。準(zhǔn)確吸取血清1.0毫升加入0.9%NaCl4.0毫升,仔細(xì)混勻備用。固體樣品：某一固體樣品中的含氮量是100克該物質(zhì)〔干重中所含氮的克數(shù)來(lái)表示〔%。因此在定氮前,應(yīng)將固體樣品中的水份除掉。一般樣品干燥的溫度都采用105℃,因?yàn)榉怯坞x的水都不能在在稱(chēng)量瓶中稱(chēng)入一定量的磨碎的樣品,然后置105℃的烘箱干燥4小時(shí)。用坩堝將稱(chēng)量瓶放入干燥器,待降至室溫后稱(chēng)重,按上述操作繼續(xù)烘干樣品。每干燥1〔二消化取2個(gè)50毫升的凱氏燒瓶,向第一號(hào)燒瓶加2毫升稀釋血清溶液〔或4毫升核酸制品溶液,或200毫克固體粉末。注意,用吸量管直接將溶液〔或用試管加入固體樣品加至燒瓶底部,切勿沾于瓶口或瓶頸上,向2號(hào)燒瓶加入2毫升水作空白對(duì)照。在每個(gè)燒瓶加入硫酸鉀—硫酸銅混合物約0.2克,濃硫酸3毫升,小瓷片兩粒,搖勻。將燒瓶約60在消化開(kāi)始時(shí),應(yīng)控制火力,不要使液體沖到瓶頸。待瓶水汽蒸完,硫酸開(kāi)始分解并放出SO2白煙后,適當(dāng)加強(qiáng)火力,繼續(xù)消化,直至消化液呈透明綠色為止。消化完畢,待燒瓶容物冷卻后,加蒸餾水10毫升〔注意慢加,邊加邊搖。冷卻后將瓶容物轉(zhuǎn)入50毫升的容量瓶中,并用蒸餾水洗燒瓶數(shù)次,溶液一并倒入容量瓶,最后定容至刻度搖勻,做上記號(hào)備用?！踩麴s1、儀器的洗滌：儀器應(yīng)先經(jīng)一般洗滌,再經(jīng)水蒸氣洗滌。蒸餾器有幾種,應(yīng)用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：開(kāi)放自來(lái)水龍頭,使水E進(jìn)入G,從K管流出〔水不宜開(kāi)得過(guò)大以免水從G管溢出。開(kāi)放P3,使水進(jìn)入A室,漏斗D中加蒸餾水約10毫升入B室。用拇指將管口按緊,同時(shí)開(kāi)放P1,則B室中的水先從Y型管口沖出,隨后A室中水經(jīng)K管流出,一般情況下如此重復(fù)洗滌兩次即可。若蒸餾器有氨存在,則應(yīng)加入蒸餾水后,不加樣品蒸餾一次方可使用?！部捎肞H試紙檢查。A為蒸氣發(fā)生室,P3為其開(kāi)關(guān),P1為出水開(kāi)關(guān),B為蒸餾室,與出氣室M相遇,M管插入盛有定量酸液的錐形瓶,B室有Y型管,一端與A室相通,另一端經(jīng)P4與漏斗D相連,可經(jīng)此將樣品及試劑加入B室,F為指形冷凝管,E為進(jìn)水管,水經(jīng)F、G、K而流出,蒸餾時(shí)B室進(jìn)消化好的樣品及NaOH,二者反應(yīng)產(chǎn)生氨,B室經(jīng)M管進(jìn)入錐形瓶中的酸吸收。2、滴定標(biāo)準(zhǔn)樣品先用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液試驗(yàn)2~3次。蒸餾器洗凈后,開(kāi)放水龍頭P3,使水進(jìn)入A室,水放至A室球部即可。取3個(gè)50毫升的錐形瓶,各準(zhǔn)確加入10毫升硼酸〔加有混合指示劑。用表面皿覆蓋備用。加樣：用吸管吸取1毫升標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液,細(xì)心地由漏斗D傾入蒸餾室,再用蒸餾水1毫升清洗漏斗。取一個(gè)盛有硼酸—混合指示劑的錐形瓶,置于M管下,使管口恰好接觸硼酸溶液,用量筒從漏斗D加入30%氫氧化鈉8毫升,隨即將P4夾緊,并往漏斗加入少量蒸餾水封閉。蒸餾：用酒精燈加熱〔應(yīng)用擋風(fēng)板將燈圍攏,維持火力恒定,沸騰不可高于Y管口以免A室溶液從Y管倒吸,待第一滴蒸餾液從冷凝柱F頂端滴下時(shí)起,繼續(xù)蒸餾5分鐘,然后將錐形瓶放低,使導(dǎo)管離開(kāi)液面再蒸2分鐘,最后用蒸餾水洗導(dǎo)管外壁,蒸餾完畢,取下錐形瓶,隨即將蒸餾器洗凈。3、樣品及空白蒸餾：用吸量管分別吸取1毫升樣品和1毫升蒸餾水按上述操作步驟進(jìn)行蒸餾。4、滴定：蒸餾完畢,用0.01N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定錐瓶溶液至淡紫色或灰色,記錄所用鹽酸的量?！菜挠?jì)算若樣品中除有蛋白外,尚有其他含氮物質(zhì),則樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定要更復(fù)雜一些。首先需向樣品中加入三氯乙酸,使其最終濃度為5%,然后測(cè)定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后的樣品的上清液中的含氮量,從而計(jì)算出蛋白氮,再進(jìn)一步算出蛋白質(zhì)的含量。蛋白氮=總氮—非蛋白氮蛋白質(zhì)含量〔克/%=蛋白氮×6.25五、注意事項(xiàng)1、凱氏法的優(yōu)點(diǎn)是適用圍廣,可用于動(dòng)植物的各種組織,器官及食品等成組復(fù)雜樣品的測(cè)定,只要細(xì)心操作都能得到精確的結(jié)果。其缺點(diǎn)是操作比較復(fù)雜,含有大量堿性氨基酸的蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果偏高。2、普通實(shí)驗(yàn)室中的空氣中常含有少量的氨,會(huì)影響結(jié)果,所以操作應(yīng)在單獨(dú)潔凈的房間中進(jìn)行,并盡可能快地對(duì)硼酸吸收液進(jìn)行滴定。七、思考題1、正式測(cè)定未知樣品前為什么必須測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的含氮量及空白？2、寫(xiě)出以下各步的化學(xué)反應(yīng)式：①蛋白質(zhì)消化②氨的蒸餾③氨的滴定3．指出本測(cè)定方法產(chǎn)生的誤差的原因。實(shí)驗(yàn)五氨基酸分離鑒定——紙層析法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)氨基酸的分離,學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理和操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析是以濾紙作支持物,用一定的溶劑系統(tǒng)展開(kāi),使混合樣品達(dá)到分離分析的層析方法。其一般操作是將樣品溶解在適當(dāng)溶劑中,點(diǎn)樣在濾紙的一端；再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng),從點(diǎn)樣的一端通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展開(kāi),展開(kāi)完畢,取出濾紙晾干或烘干,再以適當(dāng)?shù)娘@色劑或紫外燈、熒光燈下觀(guān)察其圖譜。樣品經(jīng)展開(kāi)后其一物質(zhì)在紙層析譜上的位置常用比移值Rf來(lái)表示。紙層析可看作是溶質(zhì)〔樣品在固定相與流動(dòng)相之間的連續(xù)抽提,由于溶質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離。一定的物質(zhì)在兩相間有固定的分配系數(shù),因而在恒定條件〔液劑、PH、溫度下,各物質(zhì)有固定的Rf值,據(jù)此可達(dá)到分析鑒定的目的。由于濾紙纖維可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氫鍵形式與纖維素上羥基結(jié)合,一般條件下難脫去；所以紙層析實(shí)際上是以水相作固定相,展開(kāi)的溶劑作流動(dòng)相。紙層析操作按溶劑展開(kāi)方向可分為上行、下行和徑向三種。氨基酸分離一般用上行法。上行法又分單向〔成分較為簡(jiǎn)單的樣品和雙向〔單向時(shí)斑點(diǎn)重疊分離不開(kāi),于是在其垂直方向用另一種溶劑系統(tǒng)展層。雙相層析譜可分辨十幾種以上的樣品。層析濾紙要求：〔1質(zhì)地均勻,平整無(wú)折痕,厚薄適當(dāng),溶劑能勻速展開(kāi)。〔2機(jī)械強(qiáng)度好,溶劑展開(kāi)后能保持原狀,不易折到?！?有一定純度而少雜質(zhì),以免影響層析圖譜背景?！?纖維松緊適宜,一般選用中速濾紙,或根據(jù)溶劑選擇。如丁醇類(lèi)粘度大,宜用快速濾紙；而氯仿、石油醚展開(kāi)快,宜用慢速濾紙。層析溶劑要求：〔1被分離物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中Rf在0.05～0.8之間,各組分之Rf值相差最好能大于0.05,以免斑點(diǎn)重疊?！?溶劑系統(tǒng)中任一組分與分離物之間不能起化學(xué)反應(yīng)?！?分離物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的分配較恒定,不隨溫度而變化,且易迅速達(dá)到平衡,這樣所得斑點(diǎn)較圓整。本實(shí)驗(yàn)采用八種混合氨基酸為樣品,用酸性和堿性?xún)煞N溶劑進(jìn)行雙向?qū)游?以茚三酮為顯色劑,可獲得分離清晰的層析圖譜。三、試劑和器材1、試劑0.1%〔W/V茚三酮溶丙酮液。溶劑系統(tǒng)：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2〔V/V；第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1〔V/V。2、測(cè)試樣品標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合溶液：亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天門(mén)冬氨酸、組氨酸、絲氨酸各100mg溶于50ml0.01M鹽酸中。3、器材層析缸25×40cm〔×2；培養(yǎng)皿15cm〔×2；噴霧器；毛細(xì)管徑0.1cm；電吹風(fēng)；烘箱。層析濾紙14×11cm；鉛筆,尺。四、操作方法1、點(diǎn)樣取層析濾紙一〔14×11cm,在距紙邊1.2cm處劃一基線(xiàn)；再將紙轉(zhuǎn)90°,距紙邊1.2cm處作一線(xiàn)與上線(xiàn)垂直。以毛細(xì)管吸取混合氨基酸溶液,點(diǎn)與二線(xiàn)交點(diǎn)處,點(diǎn)的直徑控制在2mm左右,不可過(guò)大。待樣品干燥后再點(diǎn)一次。濾紙上點(diǎn)樣斑點(diǎn)干燥后,把濾紙卷成圓筒形,紙的兩邊以鉻絲相連,但不可重疊相碰。2、展層在層析缸中平穩(wěn)的放入裝有第一相層析溶劑的培養(yǎng)皿。將圓筒形濾紙放入,點(diǎn)樣一段接觸溶劑,以點(diǎn)樣處不浸入溶劑為準(zhǔn)。待溶劑自下而上均勻展開(kāi),約2小時(shí)后溶劑到達(dá)距紙邊0.5cm處取出濾紙,懸掛于室溫中,以電吹風(fēng)充分吹盡溶劑。然后裁去未走過(guò)溶劑的濾紙邊緣,將濾紙轉(zhuǎn)90°,卷成如前圓筒狀,放入盛第二相溶劑的層析缸展開(kāi)〔操作同上,約1小時(shí)后溶劑展開(kāi)到距紙邊0.5cm時(shí)取出,以電吹風(fēng)吹盡溶劑使其干燥。3、顯色以噴霧器將茚三酮均勻地噴在濾紙上,然后懸濾紙于65℃烘箱加熱20五、注意事項(xiàng)〔1烘箱加熱溫度不可過(guò)高,且不可有氨的干擾,否則圖譜背景會(huì)泛紅。〔2第一相溶劑最好在使用前再按比例混合,否則會(huì)引起酯化影響層析效果?！?接觸濾紙時(shí),要戴手套。六、思考題：1、什么叫紙層析法？2、何謂Rf值？影響Rf值的主要因素是什么？3、怎樣制備擴(kuò)展劑？4、層析缸中平衡溶劑的作用是什么？5、酸性與堿性溶劑系統(tǒng)對(duì)氨基酸極性基團(tuán)的解離各有何影響？實(shí)驗(yàn)六蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)〔一蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要聯(lián)接方式。2.了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3.學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法二、呈色反應(yīng)：<一>雙縮脲反應(yīng)：1.原理：尿素加熱至180℃左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與cu2+一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽部有雙縮脲反應(yīng),但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。2.試劑：<1>尿素：10克<2>10%氫氧化鈉溶液250毫升<3>1%硫酸銅溶液60毫升<4>2％卵清蛋白溶液80毫升3.操作方法：取少量尿素結(jié)晶,放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開(kāi)始硬化時(shí),停止加熱,尿素放出氨,形成雙縮脲。冷后,加10％氫氧化鈉溶液約1毫升,振蕩混勻,再加1％硫酸銅溶液1滴,再振蕩。觀(guān)察出現(xiàn)的粉紅顏色。避免添加過(guò)量硫酸銅,否則,生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約l毫升和10％氫氧化鈉溶液約2毫升,搖勻,再加1％硫酸銅溶液2滴,隨加隨搖,觀(guān)察紫玫色的出現(xiàn)。<二>茚三酮反應(yīng)1.原理：除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外,所有α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏,1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng),是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。茚三酮反應(yīng)分為兩步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分于和氨縮合生成有色物質(zhì)。反應(yīng)機(jī)理如下：此反應(yīng)的適宜pH為5—7,同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同,酸度過(guò)大時(shí)甚至不顯色。2.試劑：<1>蛋白質(zhì)溶液100毫升2％卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液<蛋清：水＝1：9><2>0.5％甘氨酸溶液80毫升<3>0.1％茚三酮水溶液50毫升<4>0.1％茚三酮—乙醇溶液20毫升3.操作方法：<1>取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1毫升,再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液,混勻,在沸水浴中加熱1—2分鐘,觀(guān)察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。<2>在一小塊濾紙上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液,風(fēng)干后,再在原處滴上一滴0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干顯色,觀(guān)察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。<三>黃色反應(yīng)：1.原理：含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸,如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后,可被硝化成黃色物質(zhì),該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。反應(yīng)式如下：多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸,所以有黃色反應(yīng),苯丙氨酸不易硝化,需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。2.試劑：<1>雞蛋清溶液100毫升將新鮮雞蛋的蛋清與水按1：20混勻,然后用六層紗布過(guò)濾。<2>大豆提取液100毫升將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀用紗布過(guò)濾。<3>頭發(fā)<4>指甲<5>0.5％苯酚溶液50毫升<6>濃硝酸200毫升<7>0.3％色氨酸溶液10毫升<8>0.3％酪氨酸溶液10毫升<9>10％氫氧化鈉溶液100毫升3.操作方法：向7個(gè)試管中分別按下表加入試劑,觀(guān)察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象,有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后,于室溫下逐滴加入10％氫氧化鈉溶液至堿性,觀(guān)察顏色變化。<四>乙醛酸反應(yīng)1.原理：在濃硫酸存在下,色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì),反應(yīng)機(jī)理尚不清楚,可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。2.試劑：<1>蛋白質(zhì)溶液100毫升雞蛋清：水＝1：20<2>0.03％色氨酸溶液10毫升<3>冰醋酸200毫升<4>濃硫酸<分析純>100毫升3.操作方法：取3支試管。編號(hào)。分別按上表加入蛋白質(zhì)溶液、色氨酸溶液和水,然后各加入冰醋酸2毫升?；靹蚝髢A斜試試管,沿管壁分別緩緩加入濃硫酸約I毫升,靜置。觀(guān)察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。若不明顯,可于水浴中微熱實(shí)驗(yàn)〔二蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)一、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定：1.目的：<1>了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。<2>學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法2.原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí),蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)日相等,在電場(chǎng)中,蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng),也不向陽(yáng)極移動(dòng),此時(shí)溶液的pH值稱(chēng)為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同蛋白質(zhì)各有其特異的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化,可利用此種性質(zhì)的變化測(cè)定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是測(cè)其溶解度最低時(shí)的溶液pH值。本實(shí)驗(yàn)借觀(guān)察在不同pH溶液中的溶解度以測(cè)定酪蛋白的等電點(diǎn)。用醋酸與酷酸鈉<醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中>配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后,沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。3.器材：<1>水浴鍋。<2>溫度計(jì)。<3>200毫升錐形瓶。<4>100毫升容量瓶。<5>吸管。<6>試管。<7>試管架。<8>乳缽。4.試劑：<1>0.4％酪蛋白醋酸鈉溶液200毫升取0.4克酪蛋白,加少量水在乳缽中仔細(xì)地研6,將所得的蛋白質(zhì)懸波移入200毫升錐形瓶,用少量40～50℃的溫水洗滌乳缽,將洗滌液也移入錐形瓶。加入10毫升1當(dāng)量/升醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50<2>1.00當(dāng)量／升醋酸溶液100毫升<3>0.10當(dāng)量／升醋酸溶液100毫升<4>0.01當(dāng)量／升醋酸溶液50毫升5.操作方法：<1>取同樣規(guī)格的試營(yíng)4支,按下表顛序分別精確地加入各試劑,然后混勻。<2>向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1毫升,加一管,搖句一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH值依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀(guān)察其混濁度。靜置10分鐘后,再觀(guān)察其混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。二、蛋白廈的沉淀及變性：1.目的：<1>加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。<2>了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。<3>了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。2.原理：在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒,在一定的理化因素影響下,蛋白質(zhì)穎拉可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類(lèi)。<1>可逆的沉淀反應(yīng)：此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化,除去引起沉淀的因素后,蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來(lái)的溶劑中,并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇<或丙酮>短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí),常利用此類(lèi)反應(yīng)。<2>不可逆沉淀反應(yīng)：此時(shí)蛋白質(zhì)分子部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變,蛋白質(zhì)常變性而沉淀,不再溶于原來(lái)溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固,蛋