15第十五講蛋白質(zhì)組學(xué)(二)剖析

第十五講蛋白質(zhì)組學(xué)〔二〕第一節(jié)概述其次節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論技術(shù)一、二維凝膠電泳技術(shù)二、質(zhì)譜技術(shù)三、酵母雙雜交體系四、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)第三節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用和進(jìn)展趨勢(shì)其次節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論技術(shù)二、質(zhì)譜技術(shù)1、概述：質(zhì)譜技術(shù)依據(jù)離子的核質(zhì)比〔m/z〕對(duì)離子進(jìn)展分別并鑒定的方法。質(zhì)譜技術(shù)誕生于20世紀(jì)初，始終應(yīng)用于有機(jī)小分子領(lǐng)域．直到20世紀(jì)80年月才漸漸進(jìn)入到生物大分子領(lǐng)域。質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組爭(zhēng)論中的作用在蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論中，蛋白質(zhì)鑒定是最關(guān)鍵的一環(huán)。質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)鑒定的主流技術(shù)，蛋白質(zhì)組爭(zhēng)論的主要支撐技術(shù)。對(duì)蛋白質(zhì)和多肽而言，質(zhì)譜技術(shù)用于確定蛋白質(zhì)或多肽的分子質(zhì)量。通過分子量對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)展鑒定或性質(zhì)爭(zhēng)論。2、質(zhì)譜儀的工作原理根本原理分子被離子化，離子化的分子，經(jīng)過磁場(chǎng)或電場(chǎng)彼此分別，依據(jù)不同離子質(zhì)荷比(m/z)的差異，對(duì)離子進(jìn)展分別并確定分子質(zhì)量。質(zhì)譜儀組成：進(jìn)樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、 離子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)分析等離子化源和質(zhì)量分析器是兩個(gè)核心部件質(zhì)譜儀分類：依據(jù)兩個(gè)中心部件可以分為電嘖霧(ESI)快原子轟擊質(zhì)譜(FAB)飛機(jī)時(shí)間質(zhì)譜四極桿質(zhì)譜工作原理不同離子源和質(zhì)量分析器相匹配——根本確定了質(zhì)譜儀的工作原理和方式。如：ESI離子源與四極桿、離子阱質(zhì)量分析器相匹配如：基質(zhì)幫助的激光解析離子化源與飛行時(shí)間分析器相結(jié)合，〔MALDI-TOF-MS〕。質(zhì)量分析器離子化源2、常用生物質(zhì)譜的類型和特點(diǎn)〔1〕電噴霧質(zhì)譜儀〔ESI-MS〕電噴霧離子化(elcctrosprayionizationESI)：一種“軟電離”方式將樣品溶解，以液相方式通過毛細(xì)管到達(dá)噴口，在噴口高電壓作用下形成帶電荷的微滴，微滴溶劑蒸發(fā)，微滴外表的電荷密度隨半徑減小而增加，到達(dá)某一臨界點(diǎn)時(shí)，樣品將以離子方式從液滴外表蒸發(fā)，進(jìn)入氣相，實(shí)現(xiàn)樣品的離子化。ESI過程圖解〔引自理查德J.辛普森.蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)指南,2023〕ESI離子化過程特點(diǎn)：ESI-MS是一種典型的“軟離子”方式 沒有直接的外界能量作用于分子，分子構(gòu)造破壞較少?？梢员O(jiān)測(cè)大分子質(zhì)量的分子電噴霧質(zhì)譜可形成多電荷離子，在較小的m/z范圍內(nèi)可以監(jiān)測(cè)到大分子質(zhì)量的分子。測(cè)定分子質(zhì)量范圍可測(cè)定分子質(zhì)量10,0100Da以下的蛋白最高達(dá)15,01OODa馬心肌紅蛋白(分子質(zhì)量16951.5Da)的假想ESI質(zhì)量圖譜〔引自理查德J.辛普森.蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)試驗(yàn)指南,2023〕帶不同電荷蛋白質(zhì)的〔抱負(fù)〕質(zhì)譜圖。常見的以電噴霧為離子化方式的質(zhì)譜儀：電噴霧-三級(jí)四極桿質(zhì)譜(ESI-Q-MS)電噴霧-三級(jí)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)電噴霧-傅里葉盤旋共振質(zhì)譜(ESI-FTUCR-MS)液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(LC-MS)液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)：電噴霧質(zhì)譜承受液相方式進(jìn)樣，可與液相色譜聯(lián)用。蛋白質(zhì)或多肽經(jīng)HPLC分別，直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)展分子質(zhì)量測(cè)定。T11：lycopeneLC-ESI-MS測(cè)定類胡蘿卜素四級(jí)桿分析器構(gòu)造四級(jí)場(chǎng)〔見以以以下圖〕原理：在確定的Vdc和Vrf下，只有確定質(zhì)量的離子通過四級(jí)場(chǎng)，到達(dá)檢測(cè)器在確定Vdc和Vrf下，轉(zhuǎn)變Vrf可實(shí)現(xiàn)掃描特點(diǎn)：掃描速度快，靈敏度高四根棒狀電極，形成四級(jí)場(chǎng)1、3棒+(Vdc+Vrf)2、4棒–(Vdc+Vrf)時(shí)間飛行質(zhì)譜分析〔TimeofFlightAnalyze〕特點(diǎn)儀器構(gòu)造簡(jiǎn)潔，不需要磁場(chǎng)、電場(chǎng)等；掃描速度快，可在10-5s內(nèi)觀看到整段圖譜；無聚焦狹縫，靈敏度很高；可用于大分子的分析〔幾十萬原子量單位〕，在生命科學(xué)中用途很廣；(2)基質(zhì)幫助激光解吸離子化質(zhì)譜MALDI〔matrix-assistedlaserdesorptionionization〕將樣品包埋在固體基質(zhì)中，基質(zhì)吸取激光供給的能量而蒸發(fā)，攜帶局部樣品分子進(jìn)入氣相，將一局部能量傳遞給樣品分子使其離子化。激光解吸基質(zhì)的重要性早期—激光解吸離子化沒有基質(zhì)幫助，激光能量直接作用于被分析物，使分子碎裂，產(chǎn)生大量碎片，而不易得到分子離子。1988年，Tanaka等承受可吸取激光的基質(zhì)〔如甘油〕包埋被分析物，避開激光對(duì)分子構(gòu)造的破壞，測(cè)定蛋白分子質(zhì)量為35kDa進(jìn)一步承受固體基質(zhì)使樣品分散得更均勻，離子化效果更好。通常承受的激光束波長為337nm，樣品的電離過程是由基質(zhì)介導(dǎo)的，基質(zhì)對(duì)分析的靈敏度、區(qū)分率和準(zhǔn)確度有很大影響。常用的基質(zhì)有〔對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽樣品〕芥子酸(SA)、d-氰基-4羥肉桂酸〔CHCA〕、2,5-二羥基苯甲酸〔DHB〕等。MALDI主要特點(diǎn)離子電荷數(shù)通常為1～2，不形成簡(jiǎn)潔的多電荷圖，對(duì)圖譜解析比較清晰、簡(jiǎn)潔。如：乙醇脫氫酶的胰蛋白酶酶切肽圖。固相進(jìn)樣方式，不受溶液性質(zhì)的影響，對(duì)雜質(zhì)的忍耐性較好。生物樣品制備時(shí)在樣品中引入去垢劑效果更好。(如尿素和SDS)等乙醇脫氫酶的胰蛋白酶酶切肽圖常見質(zhì)譜儀：基質(zhì)幫助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-TOF-MSMALDI-TOF/TOF—MS基質(zhì)幫助激光解吸離子化三級(jí)四極—飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-Q-TOF-MS3、肽質(zhì)量指紋圖譜與蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemassfingerprinting，PMF)蛋白質(zhì)被酶切位點(diǎn)專一的蛋白酶水解后得到的肽片段質(zhì)量圖譜。每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列〔一級(jí)構(gòu)造〕都不同，蛋白質(zhì)被酶水解后，產(chǎn)生的肽片段序列各不一樣，肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具其特征性，經(jīng)質(zhì)譜分析得到是圖譜稱為指紋圖譜，應(yīng)用：蛋白質(zhì)鑒定在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，查找具有相像肽指紋圖譜的蛋白質(zhì)。酶切蛋白質(zhì)，質(zhì)譜分析得到PMF，檢索數(shù)據(jù)庫進(jìn)展鑒定。PMF鑒定蛋白質(zhì)根本路線蛋白質(zhì)的肽譜的特點(diǎn)肽譜測(cè)定儀器：最有效的質(zhì)譜儀：MALDI-TOF-MS靈敏度高，譜峰簡(jiǎn)潔，每個(gè)譜峰代表一種肽段。肽譜鑒定特點(diǎn)：假設(shè)蛋白質(zhì)翻譯后修飾，或電泳過程中某些氨基酸被修飾〔如半胱氨酸烷基化、甲硫氨酸氧化〕，蛋白質(zhì)PMF就會(huì)有一些質(zhì)量數(shù)與理論值不符，PMF鑒定的不需要將全部肽質(zhì)量數(shù)都與理論值相符。PMF方法可同時(shí)處理很多樣品，是大規(guī)模鑒定的首選方法。舉例：PMF鑒定雙向電泳分別蛋白質(zhì)的實(shí)例，如以以以下圖〔Next〕：來源于人白血病細(xì)胞的蛋白質(zhì)，胰蛋白酶酶切，得到PMF，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索鑒定為人丙酮酸激酶。圖中標(biāo)有“*”峰：能與數(shù)據(jù)庫中肽質(zhì)量數(shù)理論值相符的。蛋白質(zhì)的PMF2D凝膠上蛋白點(diǎn)的PMF丙酮酸激酶“*”與數(shù)據(jù)庫相符人白血病細(xì)胞4、串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)概念：指用質(zhì)譜作質(zhì)量分別的質(zhì)譜分析方法。也稱質(zhì)譜-質(zhì)譜法，多級(jí)質(zhì)譜法，二維質(zhì)譜法和序貫質(zhì)譜法。如：磁分析器-靜電分析器-磁分析器的串聯(lián)特點(diǎn)：自動(dòng)化程度、敏感性，高通量分析如：二維色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(2D-HPLC/MS)優(yōu)點(diǎn)：可大規(guī)模分別鑒定蛋白質(zhì)，在鑒定膜蛋白、低豐度的蛋白質(zhì)及大分子蛋白質(zhì)等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，缺點(diǎn)：串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)得到的肽序列圖譜相對(duì)簡(jiǎn)潔，從圖譜進(jìn)展完整的序列分析難度較大。如：肽序列標(biāo)簽技術(shù)(peptidesequencetag，PST)肽序列標(biāo)簽就是指分子量小，不影響介導(dǎo)蛋白活性的序列的多肽標(biāo)簽。氨基酸序列親和標(biāo)簽+離子質(zhì)量〔2H〕+蛋白質(zhì)結(jié)合部位三者構(gòu)成PSTPST和蛋白質(zhì)結(jié)合，酶切，親和分別，質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)的方法。解決了肽譜分析的難題，靈敏度提高。三、酵母雙雜交技術(shù)1、概念：依據(jù)生物體轉(zhuǎn)錄激活過程，在酵母細(xì)胞內(nèi)建立的爭(zhēng)論蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的有效體系和方法。1989年，F(xiàn)ields等正式建立了酵母雙雜交(veasttwo-hybrid)體系，又稱為“相互作用陷阱”。2、酵母雙雜交的原理：依據(jù)生物體轉(zhuǎn)錄激活過程建立的，先理解轉(zhuǎn)錄激活因子的激活過程轉(zhuǎn)錄激活因子的構(gòu)造特點(diǎn)真核生物的位點(diǎn)特異性轉(zhuǎn)錄激活因子具有兩個(gè)獨(dú)立的構(gòu)造域兩個(gè)獨(dú)立的構(gòu)造域，各具功能，互不影響DNA結(jié)合構(gòu)造域(DNAbindingdomain，BD)轉(zhuǎn)錄激活構(gòu)造域(transcriptionalactivationdomain，AD)激活因子必需同時(shí)含有這兩個(gè)構(gòu)造域，否則無激活功能激活因子對(duì)基因表達(dá)的激活不同來源激活因子的BD區(qū)和AD區(qū)結(jié)合后AD和BD兩種構(gòu)造域的上游活化序列相互接近特異性地激活BD結(jié)合的基因，激活轉(zhuǎn)錄過程，基因表達(dá)依據(jù)這一原理，建立了酵母雙雜交體系轉(zhuǎn)錄激活因子的構(gòu)造和轉(zhuǎn)錄的激活2、酵母雙雜交的原理：爭(zhēng)論“X蛋白”和“Y蛋白”是否發(fā)生相互作用？將蛋白質(zhì)X的基因與特異的BD基因融合，成為“誘餌”蛋白蛋白質(zhì)Y基因與特異的AD基因融合為“獵物”蛋白編碼兩種構(gòu)造域的基因在細(xì)胞核內(nèi)同時(shí)表達(dá)時(shí)假設(shè)蛋白質(zhì)X和Y之間存在相互作用，報(bào)道基因表達(dá)。假設(shè)蛋白質(zhì)X和Y之間不存在相互作用，報(bào)道基因不表達(dá)。酵母雙雜交系統(tǒng)原理示意圖3、酵母雙雜交系統(tǒng)的組成和特點(diǎn)〔1〕三個(gè)局部組成BD融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白AD融合的蛋白表達(dá)載體，表達(dá)的蛋白稱靶蛋白有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株常見報(bào)道基因E.coliLacZ基因，藍(lán)白菌落篩選養(yǎng)分缺陷型篩選發(fā)光蛋白的基因〔GFP〕操作程序：克隆誘餌蛋白基因克隆靶蛋白基因構(gòu)建BD融合的蛋白表達(dá)載體，以表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白構(gòu)建AD融合的蛋白表達(dá)載體，以表達(dá)的蛋白稱靶蛋白載體導(dǎo)入含有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主細(xì)胞細(xì)胞培育，觀看報(bào)告基因的表達(dá)狀況判定誘餌蛋白與靶蛋白的作用狀況〔2〕為何構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)酵母細(xì)胞便于轉(zhuǎn)化，結(jié)果易于篩選；選擇性好。內(nèi)源性酵母蛋白質(zhì)極少與哺乳細(xì)胞靶蛋白結(jié)合，避開了對(duì)文庫編碼蛋白質(zhì)的干擾?！?〕酵母雙雜交系統(tǒng)的進(jìn)展反向雙雜交體系：用于鑒定影響蛋白質(zhì)間相互作用的化合物，在藥物爭(zhēng)論開發(fā)方面具有特殊重要的應(yīng)用價(jià)值。三雜交體系：對(duì)雙雜交體系的一個(gè)有益補(bǔ)充，用于爭(zhēng)論多種蛋白質(zhì)之間的相互作用?！?〕雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)？融合體蛋白質(zhì)之間的相互作用在真核酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)展。蛋白質(zhì)能保持自然的折疊狀態(tài)，類似人體的生理狀態(tài)。證明蛋白質(zhì)間的相互作用更接近于體內(nèi)的真實(shí)水平。正是其他體外生化檢驗(yàn)方法所缺乏的。篩選cDNA文庫中編碼的，與蛋白質(zhì)特異作用的，成分。提示很多蛋白質(zhì)之間的未知作用。有助于覺察〔很多〕新基因。雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)到的相互作用在體內(nèi)發(fā)生，不需要純化蛋白。能檢測(cè)到短暫的相互作用，廣泛應(yīng)用于信號(hào)通路的爭(zhēng)論?！?〕酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性只爭(zhēng)論在核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用融合蛋白的構(gòu)建可能影響蛋白質(zhì)本身的活性或折疊狀態(tài)；假設(shè)特定的翻譯后修飾在酵母細(xì)胞中不發(fā)生，則不能檢測(cè)到修飾后蛋白質(zhì)的相互作用；很多蛋白質(zhì)與BD融合，具有自激活效應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。四、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)1、概念蛋白質(zhì)芯片〔proteinchip〕：又叫蛋白質(zhì)微陣列〔proteinmicroarray〕是檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的生物芯片。將大量純化的蛋白質(zhì)有規(guī)章的固定到某種介質(zhì)載體上，利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，酶與底物，蛋白質(zhì)與其他小分子之間的相互作用檢測(cè)分析蛋白質(zhì)的一種芯片。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)依據(jù)蛋白質(zhì)之間的相互作用的原理，利用蛋白質(zhì)芯片，對(duì)樣品中存在的特定蛋白質(zhì)分子進(jìn)展高通量分析檢測(cè)的方法。是在蛋白質(zhì)水平上，了解和爭(zhēng)論，各種生命現(xiàn)象本質(zhì)的重要方法。蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)示意圖2、根本原理將各種蛋白質(zhì)〔探針〕有序地固定于載體上，制備蛋白芯片。常用載體：滴定板、濾膜或載玻片。利用蛋白與分子之間相互作用的原理，用標(biāo)記了特定熒光抗體的蛋白質(zhì)或其他成分〔報(bào)告分子〕與芯片作用，經(jīng)漂洗將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去。利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù)，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系，測(cè)定各種蛋白質(zhì)功能。4、分類：依據(jù)用途的不同，可分為蛋白功能芯片：〔用于爭(zhēng)論〕將自然蛋白、酶或酶底物固定在載體上制成芯片用于自然蛋白質(zhì)活性及分子親和性的高通量分析可用來進(jìn)展蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-小分子、蛋白-DNA-RNA結(jié)合以及蛋白-酶反響等爭(zhēng)論。蛋白檢測(cè)芯片：〔用于檢驗(yàn)〕將具有高度親和性的蛋白質(zhì)或多肽〔如單抗，小片段抗體，受體等〕固定在載體上，制備檢測(cè)芯片。用以識(shí)別簡(jiǎn)潔生物樣品中的抗原、目標(biāo)多肽和蛋白等。5、操作關(guān)鍵環(huán)節(jié)蛋白質(zhì)芯片的制備報(bào)告分子〔探針〕的標(biāo)記信號(hào)的檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理——儀器和軟件蛋白質(zhì)芯片的制備固相載體的選擇和處理〔膜載體和玻璃載體〕；蛋白質(zhì)靶標(biāo)的處理；將蛋白質(zhì)靶標(biāo)點(diǎn)在固相載體上，并將其固定；蛋白質(zhì)芯片的封閉。報(bào)告分子〔探針〕的標(biāo)記熒光染料酶融合表達(dá)紅色熒光蛋白〔RFP〕和綠色熒光蛋白〔GFP〕與檢測(cè)蛋白形成融合蛋白共表達(dá)信號(hào)的檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理熒光標(biāo)記的芯片：激光共聚焦或電荷耦合器件〔CCD〕檢測(cè)酶標(biāo)芯片：顯色后用高精度的CCD檢測(cè)應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)展數(shù)據(jù)分析，得出結(jié)論。6、蛋白質(zhì)芯片的特點(diǎn)高通量、高靈敏度、操作自動(dòng)化、重復(fù)性好大量蛋白質(zhì)的快速、定性、定量〔？〕分析使用簡(jiǎn)潔，結(jié)果正確率較高只需少量標(biāo)本承受光敏染料標(biāo)記，靈敏度高，準(zhǔn)確性好所需試劑少，可直接應(yīng)用血清樣本，便于診斷，有用性強(qiáng)其缺乏在于：穩(wěn)定性，操作簡(jiǎn)潔7、蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用根底爭(zhēng)論蛋白質(zhì)－DNA相互作用爭(zhēng)論蛋白質(zhì)－mRNA相互作用爭(zhēng)論臨床：疾病診斷與療效判定 需要的時(shí)間短、樣品量少， 給出大量的診斷和預(yù)后信息。新藥篩選與研制 查找藥物的靶標(biāo)，檢查藥物的毒副作用， 高通量篩選，縮短藥物篩選時(shí)間環(huán)境監(jiān)測(cè)及食品檢測(cè)診斷舉例：國內(nèi)臨床上應(yīng)用較多的蛋白質(zhì)芯片〔C-12〕多種腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)系統(tǒng)主要是檢測(cè)患者血清中的腫瘤標(biāo)志物含量及變化狀況，作為推斷常見腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、治療效果及其預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。C-12多種腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)系統(tǒng)原理及操作步驟原理操作分析靶分子識(shí)別分子報(bào)告分子第三節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用和進(jìn)展趨勢(shì)概述已應(yīng)用到生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域如：細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、臨床蛋白質(zhì)組學(xué)、藥理蛋白質(zhì)組學(xué)、毒理蛋白質(zhì)組學(xué)等。爭(zhēng)論對(duì)象掩蓋生物范圍：原核微生物、真核微生物、植物和動(dòng)物等涉及各種重要的生物學(xué)現(xiàn)象：如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、蛋白質(zhì)折疊等。在臨床上心腦血管病、腫瘤的發(fā)生〔機(jī)制〕與進(jìn)展。毒理學(xué)、細(xì)胞分化與胚胎發(fā)育等基因調(diào)控機(jī)制。重大疾病的發(fā)生與治療、個(gè)體化診斷、肝臟疾病、早老性癡呆藥學(xué)爭(zhēng)論。環(huán)境與安康關(guān)系方面的爭(zhēng)論等。全面分析地方病發(fā)病機(jī)理了解一、蛋白質(zhì)組學(xué)與微生物總體概述：為適應(yīng)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)展，微生物蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。微生物蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論集中在兩個(gè)方面：各類模式微生物，特殊是典型的模式微生物〔大腸桿菌和酵母菌〕蛋白質(zhì)組學(xué)的爭(zhēng)論，幾乎涉及了蛋白質(zhì)組學(xué)現(xiàn)有領(lǐng)域的方方面面。 尤其是物質(zhì)代謝、能量代謝和信號(hào)途徑分析等病原微生物方面：蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論，對(duì)于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制備特殊重要。主要集中在以下幾個(gè)層面：病原微生物，特殊是模式微生物在不同生長條件下的蛋白表達(dá)譜的爭(zhēng)論；同一種病原微生物的不同菌株之間的蛋白質(zhì)組的比較；同一種病原微生物的不同生理狀態(tài)的蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論；病原微生物的“亞蛋白質(zhì)組”分析；宿主和微生物的相互關(guān)系，查找新型疫苗的靶分子等。二、蛋白質(zhì)組學(xué)與醫(yī)學(xué)疾病與蛋白質(zhì)的關(guān)系疾病的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后和正常生理過程，都與蛋白質(zhì)的變化有關(guān)。對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)的性質(zhì)和數(shù)量變化的準(zhǔn)確把握，是提示機(jī)體生理變化，疾病的病因、發(fā)病機(jī)制的重要手段。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在疾病診斷和治療中的應(yīng)用對(duì)于疾病生物標(biāo)志物的檢測(cè)具有不行替代的優(yōu)勢(shì).〔高通量〕查找特異性蛋白質(zhì)，用于疾病早期診斷。在消逝臨床病癥之前就實(shí)行相應(yīng)的干預(yù)治療手段?！苍缙谠\斷、早期治療〕在腫瘤上的應(yīng)用從正常組織演化到早期、中晚期癌的不同的病程階段蛋白質(zhì)組的轉(zhuǎn)變，爭(zhēng)論腫瘤發(fā)生氣制、標(biāo)志物篩選和鑒定、腫瘤分類、治療效果的評(píng)價(jià)，使腫瘤的診斷、分類和療效評(píng)價(jià)，由單一腫瘤標(biāo)志物進(jìn)展成為蛋白質(zhì)譜或基因譜的轉(zhuǎn)變來進(jìn)展綜合推斷?！哺陀^準(zhǔn)確〕結(jié)腸癌標(biāo)記物覺察和應(yīng)用正常結(jié)腸和結(jié)腸癌組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論覺察三種特異性結(jié)腸癌標(biāo)記物：(S100A8)、(S100A9)和(S100All)用于結(jié)腸癌的早期篩查乳腺癌標(biāo)記物覺察和應(yīng)用組學(xué)爭(zhēng)論覺察：核基質(zhì)蛋白66(NMP66)，28.3kDa，用于大規(guī)模的乳腺癌早期診斷臨床試驗(yàn)。與現(xiàn)有血清學(xué)標(biāo)記物CA15-3和CA27-29的特異性和敏感性相比，更高。在心血管疾病的應(yīng)用擴(kuò)張性心肌病的治療是醫(yī)學(xué)工作者面臨的巨大挑戰(zhàn)， 病理機(jī)制——不清晰通過蛋白質(zhì)組分析有可能從蛋白質(zhì)水平闡述其病理機(jī)制。爭(zhēng)論結(jié)果覺察擴(kuò)張性心肌病約100種蛋白質(zhì)表達(dá)水平下調(diào)這些蛋白質(zhì)變化可能在發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用有待于深入在感染性疾病上的應(yīng)用很多致病微生物〔如支原體、結(jié)核分枝桿菌〕全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成。蛋白質(zhì)組分析有助于鑒定該微生物產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)查找新的診斷標(biāo)記、藥物作用靶點(diǎn)和制備疫苗的抗原預(yù)備族等有望解決臨床上令人麻煩的致病微生物耐藥性問題研制出針對(duì)性的疫苗可進(jìn)一步提高感染性疾病的預(yù)防治療效果如：結(jié)核分枝桿菌的蛋白質(zhì)組爭(zhēng)論Rosenkrands等 篩選出一種新的蛋白質(zhì)，用作診斷標(biāo)記物，取得了滿足的效果。三、蛋白質(zhì)組學(xué)與藥學(xué)疾病的發(fā)生和藥物治療靶點(diǎn)與很多蛋白有關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)在查找有效的藥物靶點(diǎn)及新藥開發(fā)方面有廣泛的應(yīng)用。比較正常狀態(tài)和疾病狀態(tài)及藥物治療后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的差異高通量藥物篩選，有可能找到有效的藥物靶點(diǎn)的藥物。蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物作用方面的應(yīng)用加速了藥物開發(fā)、鑒定及改進(jìn)過程例如，分析降血脂藥物〔洛伐他汀〕的蛋白質(zhì)表達(dá)差異——分析藥理作用機(jī)制 說明洛伐他汀影響了與膽固醇代謝相關(guān)的一些蛋白質(zhì)的表達(dá)。在藥物毒理學(xué)爭(zhēng)論中的作用如：環(huán)孢素A，對(duì)小鼠腎臟的毒性作用機(jī)制，的爭(zhēng)論Steiner等通過二維凝膠電泳比較環(huán)孢素A，處理腎臟細(xì)胞〔前——后〕，蛋白質(zhì)表達(dá)豐度變化，結(jié)果覺察：一個(gè)28kDa的特異蛋白(calbindinD)表達(dá)削減，現(xiàn)已證明環(huán)孢素A的毒性與這種參與鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)削減有關(guān)。靶點(diǎn)——新藥四、蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論中存在的問題及前景展望1、蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論中存在的問題在方法學(xué)上二維凝膠電泳和質(zhì)譜分析是主流技術(shù)，但其區(qū)分率、特異性、靈敏度及重復(fù)性有待進(jìn)一步提高?！踩纾篍.Coli，1100個(gè)蛋白點(diǎn)，微量蛋白？〕如：細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行重要功能的蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子表達(dá)豐度往往很低，用目前的顯色方法難以區(qū)分。如：對(duì)一些高分子量、極酸或極堿性的蛋白質(zhì)和膜蛋白分別難度較大?，F(xiàn)有染色方法：考馬斯亮藍(lán)染色：操作簡(jiǎn)潔、顯色背景低，但顯色所需時(shí)間較長、靈敏度太低．低豐度蛋白難以顯示；銀染：費(fèi)用相對(duì)低廉且靈敏度較高，但不適于膠內(nèi)酶切及質(zhì)譜分析，有待進(jìn)一步的完善；熒光染色：靈敏度高、簡(jiǎn)潔與下游的質(zhì)譜鑒定連接，線性動(dòng)態(tài)范圍超過了考馬斯亮和銀染，但費(fèi)用昂貴，在確定程度上限制了它的應(yīng)用范圍。二維色譜技術(shù)更有利于高通量和自動(dòng)化分析鑒定蛋白質(zhì)。串聯(lián)電噴霧質(zhì)譜，進(jìn)展蛋白質(zhì)鑒定，但區(qū)分率和重復(fù)性有待提高。同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽(ICAT)技術(shù)準(zhǔn)確分析不同樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)量差異的技術(shù)〔22H+42H〕簡(jiǎn)化了樣品分析的簡(jiǎn)潔性，是蛋白質(zhì)定量分別與鑒定的新工具。樣品總蛋白質(zhì)與不同標(biāo)記的lCAT充分反響，進(jìn)展蛋白酶切，經(jīng)親和色譜分別，再通過HPLC-MS/MS比較分析標(biāo)記了同位素試劑肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)展不同條件下蛋白質(zhì)差異表達(dá)的定量分析，該方法的缺點(diǎn)是只能鑒定含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)。酵母雙雜交技術(shù)不能準(zhǔn)確、高效分析簡(jiǎn)潔蛋白質(zhì)連鎖群間的作用關(guān)系獲得的結(jié)果僅是“可能”的相互作用，還需進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)芯片用于蛋白質(zhì)識(shí)別的分子仍是亟待解決的問題2、蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論的前景——前途是光明的，任重道遠(yuǎn)在將來的生命科學(xué)領(lǐng)域乃至整個(gè)自然科學(xué)進(jìn)展中地位舉足輕重的在生命活動(dòng)規(guī)律的提示和疾病治療的探究方面具有寬闊的前景。21世紀(jì)將是一個(gè)整體細(xì)胞生物學(xué)的時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)爭(zhēng)論將成為后基因組學(xué)爭(zhēng)論的重要內(nèi)容。核酸水平的爭(zhēng)論與蛋白質(zhì)組信息相結(jié)合，才能準(zhǔn)確地詮釋生命科學(xué)的內(nèi)涵。在提示諸如發(fā)育、新陳代謝調(diào)控、年輕等生命活動(dòng)規(guī)律上將有所突破，最終將為人類重大疾病機(jī)制闡述、診斷和防治掀開新的一頁?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的重要性，各國政府、生物醫(yī)藥跨國公司，紛紛參與到蛋