培養(yǎng)決明生產(chǎn)蒽醌

引言蒽醌介紹蔥醌類（AnthraquinoneS化合物是一類廣泛存在于自然界的重要天然色素，在細菌、低等植物的真菌、地衣和高等植物中都有分布。致瀉作用是蒽醌類化合物主要的生物活性。例如中藥大黃的致瀉作用早已被人們熟知。蒽醌類化合物大多具有一定的抗菌活性，苷元的活性一般比苷類強。如大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素等對多種細菌具有抗菌作用。某些蒽醌類成分還具有抗真菌活性。除上述兩種生物活性外，有些蒽醌類化合物還具有較廣泛的其它方面的生物活性。如對小鼠黑色素瘤、大鼠乳癌及艾氏腹水癌有明顯的抑制作用，對cAMP磷酸二酯酶有顯著的抑制作用，對異常高的免疫反應有強烈的抑制作用。在高等植物中，葸醌類主要分布在蓼科、茜草科及豆科等30余科植物中。蒽醌類成分包括蒽醌及其衍生物、還原產(chǎn)物，其中蒽醌又可分為大黃素型和茜草型。大黃素型蒽醌包括大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等，其分子中羥基分布在蒽醌中苯環(huán)兩側，主要分布于蓼科與豆科等植物中。茜草素型總醌的羥基分布在蒽醌分子一側的苯環(huán)上，主要分布于茜草科植物中。蒽醌具有明目、降血脂和膽固醇、抑制動脈硬化與脂肪肝形成、降血壓、緩瀉和潤腸通便、利尿、抗氧化和過氧化作用、抗誘變和保肝等多種功效。化學性質(zhì)蔥醌不易被氧化，能發(fā)生硝化、磺化和溴化反應。如果向反應體系中加入HgSO，則蔥醌磺化幾乎都是a-磺酸，繼續(xù)碘化可得到1.5-及1.8-二磺酸，1，46-、1，7-蔥醌二磺酸是分兩步磺化來制備的。例如，在蔥醌磺酸中，磺基因受兩個羰基的作用，而有一定的活潑性，如磺酸基可被-X、-NH、-OH等置換。2例如，p-蔥醌磺酸與NaOH和KNO共熔，生成1.2-二羥基蔥醌，即茜紅素，3它是一種紅色的植物染料，它可以從茜草根中分離出來，是紅色針狀結晶，熔點為289°C；它是最早的人工合成的天然染料。結構：分子式：C1HO4 8 2生物反應器培養(yǎng)決明發(fā)根生產(chǎn)蒽醌類化合物決明子簡介決明子為豆科植物決明(CossiaobtusifoliaL.)或小決明(CossiatoraL.)的成熟種子，屬衛(wèi)生部批準使用的藥食兩用植物。決明子為中國藥典收載的常用中藥，含氨基酸、微量元素、維生素A等多種營養(yǎng)成分，還含有多種活性功能成分，具有清熱明目，潤腸通便之功效，并且具有降壓保肝、增強機體免疫、抗衰老等多種生理活性。植物形態(tài)，一年生半灌木狀草本，高1?2m。羽狀復葉互生；小葉3對，倒卵形或長圓狀倒卵形，長1.5?6.5cm,寬0.8?3cm,先端鈍，基部圓形，偏斜，幼時兩面疏被長柔毛；托葉錐形，早落。花成對腋生；萼片5，分離；花瓣5，黃色，有爪；能育雄蕊7，下面3枚較發(fā)達；子房有柄，被白色。莢果線形。種子多數(shù)，菱形，淡褐色，有光澤，花期7?9月，果期9?11月。種子棱方形或短圓柱形，兩端平行傾斜，長3?7mm，寬2?4mm。表面綠棕色或暗棕色，平滑有光澤。一端較平坦，另端斜尖，背腹面各有1條突起的棱線，棱線兩側各有1條斜向?qū)ΨQ而色較淺的線形凹紋。質(zhì)堅硬，不易破碎。種皮薄，子葉2，黃色。味微苦。材料和方法供試材料為用在MS液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的決明發(fā)根作為大量培養(yǎng)的材料。培養(yǎng)方法和條件將生物反應器用高壓滅菌鍋滅菌；3L的MS液體培養(yǎng)基；高壓蒸汽滅菌鍋滅菌；接種18g決明發(fā)根；調(diào)節(jié)充氣量使溶解氧體積分數(shù)穩(wěn)定在20；25攝氏度，每天16h光照培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中根據(jù)需要從添加泵流加MS液體培養(yǎng)基。從PID控制器聯(lián)系觀察記錄液體培養(yǎng)基ph值變化情況；定時從取樣口取出液體培養(yǎng)基，分析其中游離蒽醌化合物的含量。培養(yǎng)基中游離蒽醌類化合物的測定決明發(fā)根的培養(yǎng)基隨著培養(yǎng)時間的增長，顏色由無色、淡黃色到深褐色，逐漸加深，提示發(fā)根想液體培養(yǎng)基中釋放一定量的蒽醌類化合物。用分光度計跟蹤測定生物反應器培養(yǎng)的決明發(fā)根培養(yǎng)基中游離蒽醌類化合物的含量，為適時收取決明發(fā)根提供依據(jù)。取1,8-二羥基蒽醌5.5g，精密稱定，至于100ml容量瓶中，加新配置的1mol/L的NaOH溶解，定容至刻度，搖勻，量取2，4，6，8，10ml，分別置于25ml容量瓶中，用lmol/L的NaOH稀釋至刻度，在分光光度計500nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線，回歸方程為Y=0.0361X-0.0195，相關系數(shù)=0.9984。提取方法常規(guī)方法煎煮與浸漬提取蒽醌類成分效果不好，浪費藥材；滲漉與回流提取法需求大量的溶劑且耗時麻煩．為了彌補常規(guī)方法中的不足，可采用連續(xù)提取法。采用此法之前先要對藥材烘烤粉碎，烘烤的目的是可以降低其結合蒽醌的含量，提高游離蒽醌的含量，結合蒽醌主要起通便保肝的作用。粉碎是為了充分提取藥物中的蒽醌類。實驗儀器索氏提取器（工業(yè)器材裝置與索氏提取器相似）實驗溶劑無水乙醇實驗原理索氏提取器共分三部分，上部是冷凝器、中部是帶有虹吸管的提取管、下部是燒瓶，操作時將決明子藥粉的濾紙袋放入提取管中，內(nèi)裝物高度不得超過虹吸管頂部，燒瓶內(nèi)加入適量乙醇做揮發(fā)性溶劑在水浴上加熱。溶劑受熱氣化，通過中部提取管旁邊的蒸氣上升管到達上部的冷凝器中，冷凝為液體流入提取管中進行成分提取，待溶劑在提取管中進行成分提取，溶劑在提取管中凝集到一定容量，即當其液面超過虹吸管上端時，則因虹吸作用提取管內(nèi)全部溶液虹吸流入燒瓶中，流回燒瓶的溶劑可再受熱而氣化，提取出的蒽醌類成分則留在燒瓶中，如此反復提取，至于植物中蒽醌類成分提盡為止。連續(xù)提取法由于在提取過程中，新鮮溶劑不斷地加入而始終保持較高的濃度差，故提取效率高，此法僅需少量溶劑，就能使有效成分提取完全。所以連續(xù)提取法可以在工業(yè)上很好的提取決明子中蒽醌類。所得提取液進行濃縮，回收溶劑，得到提取物蒽醌類。濃縮方法常壓／減壓蒸餾法，薄膜濃縮法等，濃縮后可得到主要成分蒽醌類粗品，此方法適合工業(yè)推廣生產(chǎn)，可節(jié)約溶劑和藥材，提高藥材中的有效成的提取率。純化鹽析法實驗原理在水溶液中加入無機鹽飽和時，可使某些溶解度小的物質(zhì)與溶解度大的物質(zhì)分離甚至沉淀析出，然后再對溶液進行溶劑萃取，從而萃取出較純品蒽醌類。實驗步驟先把決明子粗提物溶于水中，在加入足量的無機鹽使其飽和，使少部分溶解度小的物質(zhì)先沉淀析出，然后過濾，再用氯仿對濾液進行萃取，萃取后蒸干氯仿，干燥可得較純的蒽醌類成分．此法的缺點是不能達到很好的純化效果，且有機溶劑有毒不利于安全生產(chǎn)。4.2沉淀法實驗原理蒽醌類在一定條件下可以和某些物質(zhì)溶合形成沉淀物而在水溶液中與其他物質(zhì)分離，關鍵是選擇適當?shù)某恋韯褕蟮赖某恋韯┯兴念?，即無機鹽類，生物堿，蛋白質(zhì)類和高分子聚合物，其中無機鹽類最為常用，其他三類沉淀劑成本高，目前尚處在實驗階段，無機鹽類又可分為三類：（1）重金屬堿或鹽，此鹽重金屬離子對產(chǎn)品有影響，不易推廣；（2）氫氧化物，這類沉淀劑廉價，但強堿對容器壁有腐蝕性；（3）鹽離子，如鈣，鎂，鋁，鋅等，是一類比較有前途的沉淀劑，較前兩種均有優(yōu)勢。實驗步驟可以用堿式醋酸鈣與蒽醌類絡合形成沉淀物質(zhì)，過濾出沉淀部分，水洗去沉淀的吸附物，再把沉淀混懸與容器中，通過硫化氫氣體，硫離子和蒽醌類中的絡合鉛可以迅速生成沉淀析出，然后過濾出混懸物，反復幾次，蒽醌類中的鉛被除去生成蒽醌溶于水中，合并濾液，蒸干，干燥，即可得純品蒽醌類。可用于提取物下一步制劑。沉淀法的優(yōu)點是無需使用大量有機溶劑，生產(chǎn)安全性好，大多沉淀劑成本較低，通過對比實驗可以篩選出更好的沉淀劑來純化蒽醌粗品，但重金屬鹽殘留對產(chǎn)品安全性也構成隱。4.3分離法實驗方法層析法又稱色層法或色譜法，是分離復雜混合物的物理方法。用洗脫劑洗脫，分離混合物中不同組分．關鍵是柱填料與洗脫劑的選擇，可以用硅膠或聚酰胺層析法來分離蒽醌類，我們也可以用磷酸氫鈣裝柱，用苯洗脫。實驗原理決明子蒽醌類主要有六種化合物．六種化合物各在磷酸氫鈣柱層中以不同的速率移動，分為不同的色帶，阻滯力小的隨著溶劑在柱層中流動，因此流程短，移動速率快而先流出層析柱；阻滯力大的，流程長，移動速度慢，從層析柱中流出就較晚。由此可達到分離的目的。實驗步驟把純制蒽醌類溶于苯中，濃縮后通過磷酸氫鈣（干裝）柱層析，用苯作洗脫劑，苯展開后可分為5個色帶，繼續(xù)用苯洗脫分別得到第一條色帶的苯洗脫液，第二條黃色帶的苯洗脫液，第三條黃褐色帶的苯洗脫液，第四條黃色帶的苯洗脫液，第五條橙黃色帶的苯洗脫液。第一條黃色帶的苯洗脫液，蒸干苯后得到一種黃色物質(zhì)，次此黃色物質(zhì)溶于石油醚，用石油醚提取得到石油醚提取部分，繼續(xù)通過磷酸氫鈣（干裝）柱層析，這次用石油醚展開，分為兩個部分，繼續(xù)用石油醚洗脫，得上面部分的石油醚洗脫液和下面部分的石油醚洗脫液。把上面部分洗脫液中的石油醚蒸干，溶于甲醇進行重結晶可得到單體大黃素－6－甲醚，5蒽醌的檢驗方法蒽醌類化合物按結構的不同可分成羥基蒽醌類、氧化蒽酚及蒽酚類、二蒽酮類。目前其提取方法主要采用溶劑提取法，如浸漬、滲漉、連續(xù)回流提取等方式，所用的第5頁共8頁溶劑主要有乙醇、甲醇、氯仿、乙醚、苯、石油醚、吡啶、丙酮、硫酸溶液、鹽酸溶液及氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化銨等溶液。其含量測定方法有重量法、熒光法、比色法、極譜法、薄層掃描法、高效液相色譜法等，而單味植物藥或其復方制劑中的蒽醌化合物含量，一般以大黃素或大黃酸、1，8-二羥基蒽醌為標準測定游離蒽醌或總蒽醌，結合蒽醌的量等于總蒽醌減去游離蒽醌。5.1比色法根據(jù)蒽醌類及其苷大多數(shù)是黃色或橙紅色的，羥基蒽醌能溶于堿溶液中而顯紅或紫紅色；蒽酚和二蒽醌與堿液不顯紅色，只能呈黃色，需經(jīng)氧化成羥基蒽醌后才與堿作用顯紅色；羥基蒽醌類因結構不同與醋酸鎂的甲醇溶液反應可顯橙、紅、藍、紫等色的性質(zhì)而比色測定。標準曲線的繪制取經(jīng)五氧化二磷干燥24h的大黃素（或大黃酸、1，8-二羥基蒽醌）對照品適量用堿液（1mol/L氫氧化鈉溶液或其與2%氫氧化銨溶液的混合溶液）或0.5%?1%醋酸鎂甲醇溶液定溶，在500?550nm波長處掃描，在最大吸收波長處測定吸收度，以吸收度對濃度繪制標準曲線，線性范圍4?24“g/ml。游離蒽醌的測定取藥物細粉或其制劑粉末適量（約相當于游離蔥醌1.5mg）加乙醚（或氯仿）溶解或用索氏提取器回流提取至提取液無色。將乙醚揮干，殘渣用甲醇溶解，加醋酸鎂甲醇溶液至定容；或?qū)⒁颐烟崛∫阂迫敕忠郝┒分?，用堿液提取并定容[1]，比色測定，依標準曲線計算含量?？傒祯臏y定先水解后提取：取供試品適量（約相當于總蔥醌1.5mg），用酸液（1?7.5mol/L硫酸溶液或1.5?6mol/L鹽酸溶液）20?30ml[2，3，4]，水浴回流1?2h,以使結合態(tài)的蒽醌苷水解，使蒽醌游離，再用乙醚（或氯仿）萃取，并將過濾的藥物殘渣及濾紙經(jīng)50°C干燥后用乙醚回流提取，待索氏提取器內(nèi)提取液無色，合并乙醚液，照游離蒽醌測定法測定。含還原型蒽酮苷（如番瀉苷）的樣品，根據(jù)其可被三氯化鐵氧化，酸水解成氧化型蔥醌苷元這一原理，稱取供試品適量，加水30ml超聲處理15?30min（提高溶解、提取效率，大大縮短溶解、提取時間），加10.5%三氯化鐵溶液20ml，回流20?60min，再加鹽酸1?3ml繼續(xù)回流30min，放冷，再進行萃取與測定。因蒽醌類與堿液顯色后，過氧化氫不能使其褪色，而其它有色物質(zhì)可被其氧化褪色的原理，對含有干擾測定成分的堿萃取液，加1%過氧化氫溶液少量，在沸水浴中加熱4min氧化，冷卻，定容，比色測定。先提取后水解：取供試品適量，加甲醇（或乙醇、氯仿等），對含蒽醌的浸膏制劑，超聲處理30min,使溶解，對含蔥醌的原植物藥粉末制劑，應置索氏提取器中回流提取，至提取液無色，將甲醇回收至干，殘渣用酸液水解，乙醚（或氯仿）萃取，依法測定。參考文獻1?徐克勛.精細有機化工原料及中間體手冊[M].化學工業(yè)出版社.2001.(3):2242?姚光裕.蒸煮助劑：蔥醌[J].江蘇造紙.1991,1:31-353?姚冬齡.中國蔥醌法生產(chǎn)雙氧水工藝技術發(fā)展[J].黎明化工，1992,(4):19-234?梁鋒，徐丙根，施小紅等.濕式氧化法脫硫的技術進展[J].現(xiàn)代化工.2003,23(5):21-245?張勝梅，韓士田，劉尹欽.光核酸酶-蔥醌衍生物的研究進展[J].河北師范大學學報.2004,28(3):289-292翁世偉，陳松茂.化工產(chǎn)品實用手冊(二)[M].上海交通大學出版社，1989.608-609宋小平，韓長日.精細有機化工產(chǎn)品實用生產(chǎn)技術(下卷)[M].中國石化出版社，2001.1650-16528.SakaenoTomomi，NakamuraMitsuo，KobayashiNobuyuki.Air-fuelratiofeedbacktypemixturecontroller[P].JP，53-020024，1978-02-23TsukamotoEihiko，IchikizakiTetsuo，WakiSeizaburoetal.Pressure-tightcasing[P]