hplc同時測定梔子中8個環(huán)烯醚苷類成分的含量

hplc同時測定梔子中8個環(huán)烯醚苷類成分的含量

梔子來源于水生百合科植物。它具有凈化火焰、消除不適、清熱、解毒、消除腫脹和緩解疼痛的功效。梔子資源廣泛分布于長江以南各省區(qū),主產(chǎn)于江西、湖北、湖南、浙江等地。以梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類化合物為其主要成分,該類成分具有保肝、利膽、解痙、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降血糖血脂等多種藥理活性。目前市場上流通的梔子藥材,因受產(chǎn)地來源、采收時間、貯藏年限及基源植物等因素的影響,質量參差不齊,甚者以偽充真,嚴重影響了藥材及其相關制劑的臨床藥效。而2010年版《中國藥典》僅以梔子苷作為梔子質量控制的唯一含量測定指標,未能真實、全面地反映出梔子藥材的內在質量;相關文獻在梔子化學成分的含量測定及控制上,亦僅測定包括梔子苷在內的1~2個成分的含量,本研究通過建立同時測定梔子中包括梔子苷在內的8個主要環(huán)烯醚萜苷類成分的HPLC,為進一步完善梔子質量控制與品質評價提供參考依據(jù)。1含量測定儀器Agilent1100液相色譜儀(包括AgilentChemstation工作站,美國Agilent公司);AG285型電子分析天平(瑞士MettlerToledo公司),中藥粉碎機(DFT-100,溫嶺市大德中藥機械有限公司),KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,160W,40kHz)。所用對照品均為本實驗室從梔子藥材中分離、鑒定,經(jīng)HPLC面積歸一化法測定純度均達98%以上,可供含量測定用。乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。實驗材料于2010—2011年分別采集于江西各地及購自安徽亳州,共計10個樣品,經(jīng)魯南制藥閆光軍高級工程師鑒定,均為茜草科梔子G.jasminoides的干燥成熟果實,憑證標本保存于魯南制藥中藥制藥共性技術國家重點實驗室,見表1。2方法和結果2.1對照品貯備液的制備分別精密稱取梔子苷0.5012g,梔子新苷0.1064g,山梔苷0.1038g,梔子苷酸0.0248g,去乙酰車葉草苷酸甲酯0.1166g,羥異梔子苷0.1032g,雞矢藤次苷甲酯0.0510g,京尼平龍膽二糖苷0.1164g置50mL量瓶中,用50%甲醇溶解并定容至刻度,即得梔子苷10.0240g·L-1,梔子新苷2.1280g·L-1,山梔苷2.0760g·L-1,梔子苷酸0.4960g·L-1,去乙酰車葉草苷酸甲酯2.3320g·L-1,羥異梔子苷2.0640g·L-1,雞矢藤次苷甲酯1.0200g·L-1,京尼平龍膽二糖苷2.3280g·L-1的對照品貯備液。分別精密吸取7.5mL梔子苷,1.0mL梔子新苷,2.5mL山梔苷,1.0mL梔子苷酸,0.5mL去乙酰車葉草苷酸甲酯,10.0mL羥異梔子苷,1.0mL雞矢藤次苷甲酯和10.0mL京尼平龍膽二糖苷對照品貯備液,置50mL量瓶中,用超純水定容至刻度,即得混合對照品溶液。2.2超聲處理法取干燥藥材粉碎,過4號篩。取藥材粉末約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25mL,密塞,稱定質量,超聲處理30min,放冷,用50%甲醇補足失重,搖勻,濾過。取續(xù)濾液適量,用0.45μm微孔濾膜濾過,即得。2.3檢測波長和溫度采用KromasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動相為乙腈-水-三氟乙酸(6∶94∶0.05),流速1.0mL·min-1,檢測波長238nm,柱溫40℃,進樣量5μL。在該色譜條件下,梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷8個成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,對稱因子均在0.90~1.10,見圖1。2.4色譜條件的測定精密吸取2.1項下混合對照品溶液1,2,4,6,8,10μL,分別注入液相色譜儀,按2.3項下的色譜條件進行測定。以對照品進樣量(μg)為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程,見表2。2.5加樣回復合成高效的rsd精密吸取2.1項下混合對照品溶液5μL,于同一天和3d內重復進樣,測定梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷8個環(huán)烯醚萜苷類成分的峰面積,計算RSD。結果日內精密度,各成分峰面積的RSD(n=6)分別為0.040%,0.20%,0.090%,1.7%,0.14%,0.090%,0.61%,0.090%;日間精密度各成分峰面積的RSD(n=6)分別為0.10%,0.17%,0.080%,1.9%,0.18%,0.16%,0.54%,0.22%。日內、日間精密度均RSD≤2.0%,表明該方法的日內和日間精密度均良好。2.6去乙酰車葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷,雞佐藤酯和京尼平龍膽二糖苷的平均質量分數(shù)取同一樣品6份,按2.2項下方法制備供試品溶液,進樣測定峰面積,計算梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷平均質量分數(shù)(n=6)分別為63.31,1.31,2.56,0.26,0.63,8.90,0.88,9.40mg·g-1,RSD分別為0.52%,0.49%,0.58%,1.4%,1.2%,0.68%,2.0%和0.72%。表明方法重復性良好。2.7不同種類梔子新苷、山類、香港梔子苷酸、去乙酰車葉草苷酸甲酯和京尼平龍膽二糖苷峰面積的rsdn取同一供試品溶液,分別于制備后0,2,4,6,8,10h進樣測定,測得梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.66%,0.63%,0.61%,1.9%,0.69%,0.79%,1.3%,1.1%。表明供試品溶液在10h內穩(wěn)定。2.8加樣回收率試驗取2.6項下已知含量樣品粉末(過4號篩)6份,每份約0.25g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加入梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷對照品溶液適量,按2.2項下梔子藥材供試品制備方法制備,進樣5μL,計算各對照品的平均加樣回收率和RSD。結果梔子中上述8個環(huán)烯醚萜苷類成分的平均加樣回收率在98.72%~101.2%,RSD均≤3.2%,表明該方法的準確度良好,見表3。2.9樣品測定分別精密稱取各梔子樣品約0.5g,按2.2項下方法制備供試品溶液,按2.3項下的色譜條件進樣測定,以外標法計算質量分數(shù),結果見表4。3梔子苷及其類化品含量測定以梔子苷含量為指標,分別考察了甲醇、乙醇、50%甲醇3種提取溶劑,結果表明50%甲醇提取效果最好,與文獻報道相一致,其更能反映藥材中內在成分的真實含量,故選用50%甲醇為供試品溶液制備的提取溶劑。參考文獻,選擇了乙腈-酸水系統(tǒng)作為流動相,在此基礎上比較了該系統(tǒng)的等度洗脫與梯度洗脫2種方式,結果表明雖然梯度洗脫出峰較快而節(jié)省時間,但二者在上述成分的分離度上并無明顯差別,且等度洗脫對儀器要求較低,分離效果較為理想,彼此并無峰形重疊,故以乙腈-酸水系統(tǒng)為流動相,以等度洗脫方式進行測定。采用本實驗建立的色譜方法對10個不同來源的梔子藥材進行了含量測定。結果顯示,梔子苷等8個指標性成分之間含量差異較大,其中以梔子苷最高,為38.26~69.60mg·g-1;梔子苷酸最低,為0.28~1.27mg·g-1。在《中國藥典》2010年版中藥材梔子項下,以梔子苷為指標性成分對其含量作出了相應規(guī)定,結合本實驗數(shù)據(jù),表明上述10個來源的梔子藥材中梔子苷含量均明顯高于藥典規(guī)定(藥典規(guī)定梔子苷不得少于1.8%),約為藥典規(guī)定的2~4倍,說明現(xiàn)行藥典在梔子苷含量限定上存在偏低情況,未能真實反映出藥材本身質量優(yōu)劣差異,建議下版藥典能對其含量限定項進行相應修訂提高,使之更能客觀地反映藥材的質量現(xiàn)狀。同時由表3可知,9號野生種樣品在梔子新苷、山梔苷、羥異梔子苷等3個成分含量及上述8個環(huán)烯醚萜苷類成分總含量上均高于其他栽培種樣品,說明野生種藥材質量異于(或優(yōu)于)栽培種,具有一定的物質基礎。筆者前期對梔子中的環(huán)烯醚萜苷類成分進行了系統(tǒng)分離,共得到梔子苷、梔子新苷、山