細(xì)胞工程制藥技術(shù) 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

生化制藥工藝項目四

細(xì)胞工程制藥技術(shù)1細(xì)胞融合2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)3動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目錄CONTENTS02植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、植物細(xì)胞的全能性1、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞全能性為細(xì)胞的某種特征，有這種能力的細(xì)胞可保留形成有機體

所有的細(xì)胞類型的能力----1984年國際組織培養(yǎng)協(xié)會全能細(xì)胞是能夠表達(dá)生物體基因組的任何一種基因，并能分化出該生物體內(nèi)任何一種類型的細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)育為一個完全相同的生物體德國植物學(xué)家Haberlandt1902年預(yù)言“植物細(xì)胞具有全能性”。不久Hanning成功地在培養(yǎng)基上培育出正常發(fā)育的蘿卜和辣根菜的胚。稱為植物組織培養(yǎng)的鼻祖Haberlandt（1854-1945）Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、植物細(xì)胞的全能性2、植物培養(yǎng)相關(guān)概念植物組織培養(yǎng)（tissueculture）/試管植物/離體培養(yǎng)在無菌條件下，將離體的植物器官（如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等）、組織（如花藥組織、胚乳、皮層等）、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚）、原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配置的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織、潛伏芽等，或者長成新的完整植株一種實驗技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，使組織分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量的細(xì)胞群體的一種技術(shù)兩者區(qū)別：是否形成組織Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、植物細(xì)胞的全能性2、植物培養(yǎng)相關(guān)概念外植體（explant）進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)所選取的植物部分愈傷組織（callus）由外植體的增生細(xì)胞產(chǎn)生的脫分化的植物細(xì)胞團脫分化（dedifferentiation）指植物離體器官、組織、細(xì)胞在人工培養(yǎng)液上，經(jīng)過多次細(xì)胞分裂而失去原來的分化狀態(tài)形成無結(jié)構(gòu)的愈傷組織或細(xì)胞團的過程，使其回復(fù)到胚性細(xì)胞的狀態(tài)再分化（redifferentiation）指離體培養(yǎng)的植物組織或細(xì)胞可以由脫分化狀態(tài)再度分化成另一種或幾種類型的細(xì)胞、組織、器官，甚至最終再生成完整植株P(guān)art2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、植物細(xì)胞的全能性3、植物組織/細(xì)胞培養(yǎng)的意義植物中含有豐富的次生代謝物質(zhì)，有25%的法定藥物來自植物，規(guī)?；参锛?xì)胞培養(yǎng)以提取天然產(chǎn)物是解決此瓶頸的有前途的方法珍貴植物和名貴花草等種苗的快速繁殖植物細(xì)胞遺傳、生理、生化和病毒方面的研究紅豆杉紫杉醇據(jù)有關(guān)專家估計，全世界每年需要500kg紫杉醇才能滿足廣大癌癥患者的需求。生產(chǎn)1kg紫杉醇需要砍伐60年生大樹3000-4000棵。若僅從樹皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200萬棵左右的大樹。紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)具有如下特點可能會成為能夠解決紫杉醇長期供應(yīng)問題的非常有希望的手段：細(xì)胞培養(yǎng)過程都有效控制，不受地理環(huán)境、病蟲害和季節(jié)等因素的影響，保證產(chǎn)物無限、連續(xù)、均勻地生產(chǎn)可以進(jìn)行紅豆杉細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化而獲得超過原植株紫杉醇含量的細(xì)胞和培養(yǎng)條件易于在生物反應(yīng)器中大規(guī)模、高密度地培養(yǎng)。減少占用可耕地面積，降低生產(chǎn)成本和提高生產(chǎn)率。利用現(xiàn)有的或探索新的生物技術(shù)進(jìn)行紅豆杉細(xì)胞紫杉醇代謝途徑和規(guī)律的研究，使細(xì)胞定向合成次生代謝物Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物組織培養(yǎng)1、植物組織培養(yǎng)的要求用于培養(yǎng)的外植體細(xì)胞必須具有全能性離體隔離適宜的培養(yǎng)條件環(huán)境條件：光照、溫度、濕度（1）光照表現(xiàn)在光強、光質(zhì)、光照時間方面光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長。一般光照強度為1000~5000lx光周期，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。光質(zhì)，對愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物組織培養(yǎng)1、植物組織培養(yǎng)的要求適宜的培養(yǎng)條件環(huán)境條件：光照、溫度、濕度（2）溫度大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23-27℃之間進(jìn)行，一般采用25土2℃（3）濕度容器內(nèi)相對濕度要保持在99%左右，環(huán)境的要求70％-80％（4）滲透壓培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，影響到滲透壓的變化。通常1-2個大氣壓對植物生長有促進(jìn)作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用（5）通氣氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料固體培養(yǎng)基→活性炭；液體培養(yǎng)基→振蕩Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物組織培養(yǎng)1、植物組織培養(yǎng)的要求適宜的培養(yǎng)條件營養(yǎng)條件無機鹽類大量元素：C、H、O、N、P、K、S、Ca、Mg微量元素：Mo、Co、Mn、Cu、Zn、Fe等無機鹽對非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)的影響Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物組織培養(yǎng)營養(yǎng)條件有機營養(yǎng)碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖蔗糖濃度：使用量1-5%，常用量為2-3%，幼胚培養(yǎng)可提高到4-15%蔗糖具有熱易變性，高壓滅菌后部分糖會分解蔗糖在培養(yǎng)基中的作用為培養(yǎng)物提供能源和碳骨架可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓氮源氨基酸類、酰胺類碳源濃度對非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)的影響Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物組織培養(yǎng)營養(yǎng)條件活性物質(zhì)維生素類、肌醇、生物素等

Auxins----生長素誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化Cytokinins----細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織形成器官，分化不定芽生長素濃度對非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)的影響細(xì)胞分裂素濃度對非洲紫羅蘭組織培養(yǎng)的影響Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物組織培養(yǎng)營養(yǎng)條件活性物質(zhì)生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向（形成愈傷組織；長根；長芽）

高：有利于根、愈傷組織的形成生長素/細(xì)胞分裂素適中：有利于根芽的分化

低：有利于芽的形成Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物組織培養(yǎng)2、組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基無機鹽濃度高、元素間比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強的緩沖性，是目前使用最廣泛的培養(yǎng)基White培養(yǎng)基無機鹽、有機成分含量較低，適用于生根培養(yǎng)B5培養(yǎng)基含較高的NO3-N，氨態(tài)氮含量較低，含有較高的硫胺素（VB1）較適用于一些要求較高氮素營養(yǎng)的植物培養(yǎng)，如常見木本植物雙子葉植物組培的選擇N6培養(yǎng)基成分簡單，KNO3

和(NH4)2SO4含量高，適合花藥培養(yǎng),尤其適合禾本科植物的組織培養(yǎng)Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物的組織培養(yǎng)2、組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基母液配制與保存配制母液可以保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時的快速移取常將大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物類和激素類分別配制成比培養(yǎng)基濃度高10-100倍的母液，低溫保藏培養(yǎng)基的配制加入蔗糖并充分溶解→定容→調(diào)pH值→加瓊脂→分裝封囗→滅菌不同植物的最適pH值Part2植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、植物的組織培養(yǎng)3、組織培養(yǎng)操作無菌培養(yǎng)體系的建立與增殖外植體的選擇、滅菌、接種、培養(yǎng)外植體的脫分化----愈傷組織誘導(dǎo)

器官發(fā)生、生根與試管苗的移植離體器官發(fā)生:指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）、類原球莖（PLBs）等器官的過程對于上述途徑所獲得的芽，在大多數(shù)情況下均需要轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)進(jìn)行生根誘導(dǎo)發(fā)育成完整植株生根培養(yǎng)基一般要求降低礦物營養(yǎng)的濃度，提高生長素的濃度試管苗的移植移栽前將培養(yǎng)物不開口，移到自然