18srdna在發(fā)酵啤酒酵母工業(yè)菌株中的應(yīng)用

18srdna在發(fā)酵啤酒酵母工業(yè)菌株中的應(yīng)用

在啤酒生產(chǎn)過程中，由于原料、生產(chǎn)工藝和母乳喂養(yǎng)的影響，啤酒的味道和分解不可避免。啤酒的風(fēng)味老化已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)。啤酒中的自由基活性很高,自由基反應(yīng)構(gòu)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)涵蓋了大部分老化反應(yīng),具有風(fēng)味活性的羰基化合物很多通過自由基反應(yīng)形成。谷胱甘肽(GSH)作為重要的抗氧化物質(zhì),可以和許多氧自由基發(fā)生非酶促反應(yīng),對平衡不同亞細(xì)胞環(huán)境的氧化還原勢能,維持啤酒酵母體內(nèi)的氧化還原環(huán)境具有重要作用;酵母中GSH含量豐富,而在啤酒生產(chǎn)時(shí)酵母代謝分泌一部分GSH可以顯著提高啤酒的抗風(fēng)味老化能力,延長啤酒的風(fēng)味保鮮期。在GSH的合成過程中,γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)受到GSH的反饋抑制,由GSHⅠ催化的反應(yīng)是GSH生物合成過程的限速步驟。通過提高相應(yīng)基因GSH1的拷貝數(shù)來增強(qiáng)GSHⅠ的活性,則可以提高GSH的生成量。酵母基因組中核糖體DNA(rDNA)有100～200個重復(fù)單元,以此為整合位點(diǎn)可以提高整合拷貝數(shù),在釀酒酵母(S.cerevisiae)中已有應(yīng)用。本研究通過構(gòu)建以18SrDNA為整合位點(diǎn)包含GSH1基因和Kan基因的轉(zhuǎn)化片段,與工業(yè)啤酒酵母染色體中與釀酒酵母同源的18SrDNA發(fā)生同源重組,獲得GSH生成量顯著提高的重組菌株。1材料和方法1.1材料表面1.1.1nvitrog公司saccharomico大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、pPIC9K載體(Invitrogen公司產(chǎn)品)由沈微副教授惠贈,工業(yè)啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株G03本實(shí)驗(yàn)室保藏;pMD18-TSimpleVector購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。1.1.2聚合酶、質(zhì)粒、菌株和培養(yǎng)基限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa);堿性磷酸酶(CIAP)、SuperPfuDNA聚合酶、質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;PCRPurificationMiniKit、GelExtractionMiniKit購自上海華舜生物工程有限公司;酵母提取物和蛋白胨為OXOID公司產(chǎn)品;遺傳霉素(G418)、GSH還原酶、NADPH、DTNB、ATP等購自Sigma公司;除特別注明外,實(shí)驗(yàn)用各種試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1酵母菌培養(yǎng)方法LB培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)配制,固體和液體培養(yǎng)基在需要時(shí)加入硫酸卡那霉素至50μg/mL或氨芐青霉素至100μg/mL。培養(yǎng)酵母菌用YEPD培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)配制。發(fā)酵用麥汁培養(yǎng)基采用全麥芽糖化制得,酒花添加量0.8g/L。1.2.2文獻(xiàn)的方法和pcr產(chǎn)物的純化大腸桿菌轉(zhuǎn)化按氯化鈣法進(jìn)行。啤酒酵母染色體DNA的提取及啤酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物純化,從瓊脂糖凝膠回收DNA以及質(zhì)粒的提取等操作按照各個公司提供的說明書進(jìn)行。常規(guī)基因操作均參考文獻(xiàn)。1.2.3引用設(shè)計(jì)和pcr擴(kuò)展(1)保健體基因rt-3根據(jù)GenBank公布的釀酒酵母的18SrDNA序列,設(shè)計(jì)引物:PrDNA01:5′-GCTTGTCTCAAAGATTAAGCC-3′;PrDNA02:5′-CTTGTTACGACTTTTAGTTCC-3′。以G03的染色體DNA為模板,進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃40s,52℃1min10s,72℃2min10s,重復(fù)30個循環(huán)后72℃15min使產(chǎn)物延伸完全。(2)ppc9k載體的構(gòu)建根據(jù)pPIC9K載體全序列設(shè)計(jì)引物:Pkan01:5′-ACCGGAATTCTGCAAGGAGATGGCGCCCAAC-3′;Pkan02:5′-AATTGAGCTCAAGTGAGGGAGCCACGGTTG-3′。畫線部分分別為EcoRⅠ和SacⅠ的酶切位點(diǎn)。以經(jīng)EcoRⅠ線性化的pPIC9K載體為模板,進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃40s,69℃1min20s,72℃2min10s,重復(fù)30個循環(huán)后72℃15min使產(chǎn)物延伸完全。(3)saci基因回復(fù)突變株的構(gòu)建根據(jù)GenBank公布的釀酒酵母的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)序列,設(shè)計(jì)引物:PgshI01:5′-ACCGAGCTCGATAAGTTATGCCACCAGTGC-3′;PgshI02:5′-ACCGAGCTCAAATGGCCAATATTCTACGTG-3′。其中,畫線部分為SacI的酶切位點(diǎn)。以G03的染色體DNA為模板,進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃40s,66℃1min30s,72℃2min30s,重復(fù)30個循環(huán)后72℃15min使產(chǎn)物延伸完全。1.2.4質(zhì)粒pgj-1測序?qū)CR擴(kuò)增得到的GSH1末端加A處理后,與pMD18-TSimpleVector連接得到質(zhì)粒pGJ-1用于測序。測序采用Sanger雙脫氧末端終止法,由上海生工生物工程有限公司完成。1.2.5prk-2質(zhì)粒的構(gòu)建將18SrDNA與pMD18-TSimpleVector連接得到質(zhì)粒pRJ-5用EcoRⅠ與SacⅠ酶切,與同樣酶切的Kan片段連接,得到質(zhì)粒pRK-2。將經(jīng)過測序驗(yàn)證的pGJ-1中的GSH1用SacⅠ酶切后,插入到質(zhì)粒pRK-2的SacⅠ酶切位點(diǎn),得到質(zhì)粒pRKG。1.2.6保健體pcr檢測以構(gòu)建好的質(zhì)粒pRKG為模板,采用PrDNA01、PrDNA02一對引物進(jìn)行高保真的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃40s,52℃1min30s,72℃3min,重復(fù)35個循環(huán)后72℃15min使產(chǎn)物延伸完全。1.2.7培養(yǎng)時(shí)間及接種次數(shù)從新鮮轉(zhuǎn)化的平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接在YEPD斜面上,30℃培養(yǎng)48h。然后轉(zhuǎn)接至5mLYEPD培養(yǎng)基中,30℃、200r/min培養(yǎng),每24h轉(zhuǎn)接1次,共轉(zhuǎn)接5次。取菌液涂布YEPD平板,30℃培養(yǎng)后挑取單菌落,分別點(diǎn)種YEPD和含200μg/mLG418的YEPD平板,通過計(jì)數(shù)測定重組菌的遺傳穩(wěn)定性。1.2.8工業(yè)工廠的制造實(shí)驗(yàn)(1)麥汁培養(yǎng)基的制備將啤酒酵母接種于10mL麥汁培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)2d;吸取1mL至9mL麥汁培養(yǎng)基,22℃培養(yǎng)2d;全部接入50mL麥汁培養(yǎng)基,19℃培養(yǎng)2d;培養(yǎng)液全部接入250mL麥汁,11℃發(fā)酵6d,6℃后酵10d。(2)測定啤酒氧化性能的指標(biāo)細(xì)胞內(nèi)及啤酒中谷胱甘肽參照文獻(xiàn)測定。DPPH的測定參照文獻(xiàn),TRAP的測定參照文獻(xiàn)。其他常規(guī)指標(biāo)按照參照文獻(xiàn)進(jìn)行檢測。2結(jié)果與討論2.1srdna擴(kuò)增卡那基因(Kan)是一種來自細(xì)菌的基因,編碼一種非活性酶(氨基糖苷酸轉(zhuǎn)移酶)。該基因在酵母中表達(dá)能使酵母對遺傳霉素G418產(chǎn)生抗性,本研究中采用該抗性作為顯性選擇標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子。用EcoRⅠ與SacⅠ酶切pRJ-5,與同樣酶切的Kan片段連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后在Ampr-Kanr雙抗LB平板篩選得到轉(zhuǎn)化子,經(jīng)鑒定得到質(zhì)粒pRK-2。用SacⅠ酶切質(zhì)粒pGJ-1,得到GSH1片段,插入到質(zhì)粒pRK-2的SacⅠ酶切位點(diǎn),得到質(zhì)粒pRKG(圖1)。酶切驗(yàn)證可以看出質(zhì)粒pRKG構(gòu)建正確(圖2),18SrDNA內(nèi)部約340bp的片段被GSH1與Kan取代。GSH1與pRK-2有兩種連接方式,得到的兩個質(zhì)粒pRKG-1和pRKG-2均可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.2通過獲取目的段，可以促進(jìn)發(fā)酵菌的轉(zhuǎn)化2.2.1srdna用PrDNA01、PrDNA02一對引物PCR得到的大小約5660bp的DNA片段18SrDNA::(Kan-GSH1)。此片段兩端包含酵母18SrDNA的序列,內(nèi)部具有G418抗性片段Kan和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1。2.2.2g方的篩選純化18SrDNA::(Kan-GSH1)擴(kuò)增片段,醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母菌株G03,在含200μg/mLG418的YEPD平板篩選重組子。使該基因片段與18SrDNA發(fā)生同源重組(圖3)。2.2.3酵母染色體的構(gòu)建重組子DNA水平上的鑒定采用PCR的方法。在含G418的選擇性平板上生長出的菌落經(jīng)劃線分離獲得單菌落后,命名為SG1,SG2等。以重組子染色體DNA為模板,引物PrDNA01和PrDNA02擴(kuò)增長度約5.7kb的18SrDNA::(Kan-GSH1)基因片段(圖4),說明轉(zhuǎn)化子的18SrDNA基因內(nèi)部已經(jīng)整合有卡那基因(Kan)與γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)。從圖4中可以看到,在1.7kb處均有一條帶,說明重組酵母染色體存在多個18SrDNA拷貝,轉(zhuǎn)化片段只與其中部分發(fā)生重組。將SG1轉(zhuǎn)接至YEPD培養(yǎng)基中,30℃、200r/min培養(yǎng)48h,以新鮮培養(yǎng)基為對照,測定培養(yǎng)液的GSH含量。SG1能夠較多的生成GSH(數(shù)據(jù)未列出),故以此重組菌進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。2.3菌落生長次數(shù)統(tǒng)計(jì)將重組菌株SG1和受體菌株G03在無G418選擇壓力的條件下,連續(xù)轉(zhuǎn)接5次,統(tǒng)計(jì)生長的菌落數(shù)。結(jié)果表明在含200μg/mLG418的YEPD平板上受體菌G03不能生長,工程菌SG1全部可以生長,表明重組菌具有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。2.4啤酒菌漿糊的生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)2.4.1發(fā)酵液中g(shù)sh含量的變化按照1.2.8(1)中的方法進(jìn)行小試實(shí)驗(yàn)。主酵期間每天取樣,測定酵母細(xì)胞內(nèi)和發(fā)酵液中GSH的含量。圖5顯示,隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行,胞內(nèi)GSH含量逐步增加,但發(fā)酵液中GSH含量的卻是逐漸減少。這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵過程的進(jìn)行,GSH延緩了自由基反應(yīng)而自身消耗掉一部分。因此雖然GSH1基因的拷貝數(shù)增加使得工程菌胞內(nèi)GSH的合成量提高,但反映到發(fā)酵液中GSH的凈含量卻是逐漸降低。第6天主酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中GSH含量,啤酒酵母工程菌SG1比受體菌G03高16.6%,酵母細(xì)胞內(nèi)GSH含量SG1則比G03高60.3%。工程菌相比受體菌胞外GSH的含量的增加幅度不如胞內(nèi)大,可見通過提高啤酒酵母GSH的分泌能力來提高啤酒的抗老化能力還是具有廣闊的研究前景。2.4.2結(jié)構(gòu)細(xì)菌的發(fā)酵性能對發(fā)酵10d后的成品啤酒進(jìn)行分析。工程菌SG1發(fā)酵后啤酒的理化指標(biāo)如真正發(fā)酵度、雙乙酰、酒精度等與受體菌G03基本相同(表1),說明基因工程菌的發(fā)酵性能并未發(fā)生明顯的變化。而老化相關(guān)指標(biāo),如表征老化物質(zhì)(羰基化合物)含量的TBA降低了13.8%,表征啤酒抗老化能力(自由基清除能力)的DPPH清除量、TRAP值則分別升高了17.6%和15.6%,與感官品評相關(guān)性良好的SI則增加了36.5%,可見啤酒的抗老化能力增強(qiáng)顯著,而風(fēng)味穩(wěn)定性也得到了明顯的提高。3u3000酸乳的制備方法應(yīng)用基因工程手段可以在不改變其他發(fā)酵性能的基礎(chǔ)上對啤酒生產(chǎn)菌株進(jìn)行改良,具有較好的實(shí)際應(yīng)用前景。啤酒酵母工業(yè)菌株一般為原養(yǎng)型多倍體菌株,需要有適合的酵母顯性選擇標(biāo)記來篩選目的轉(zhuǎn)化子,而使用同源重組的方法可以提高基因表達(dá)的穩(wěn)定性。目前已有通過在α-乙酰乳酸合成酶內(nèi)部插入GSH1來構(gòu)建抗老化啤酒酵母工程菌的研究。與利用低拷貝整合載體相比,本研究以酵母基因組中核糖體DNA為整合位點(diǎn),利用rDNA具有一定重復(fù)單元這一特點(diǎn)使GSH1拷貝數(shù)增加,GSH的表達(dá)量增加更為顯著,較受體菌提高60.3%。這也為建立一套適合工業(yè)啤酒酵母的基因操作策略打下基礎(chǔ)。目的基因GSH1也來自受體菌株自身,使得工程菌的安全性得到一定程度的保證。而Kan則對啤酒酵母是一個外源基因,因此工程菌還需要對其進(jìn)行敲除才可以應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。GSH結(jié)構(gòu)上帶有一個活性巰基,可以清除體內(nèi)的自由基;但正常情況下其不會大量產(chǎn)生,只有通過相應(yīng)方法如紫外誘變解除GSH對GSHⅠ的反饋抑制,或者提高GSH1的拷貝數(shù)才可以實(shí)現(xiàn)。啤酒中含有的800多種有機(jī)和無機(jī)化合物中許多物質(zhì)具有抗氧化功能,可以作為啤酒中潛在的內(nèi)源抗氧化劑,它們很大一部分由麥芽和酒花帶入,另一部分來自發(fā)酵階段酵母的代謝。提高啤酒內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)含量可以克服外加抗氧化劑引起的對啤酒風(fēng)味協(xié)調(diào)性的破壞。谷胱甘肽是酵母自身在代謝過程中產(chǎn)生的小分子短肽,其不會影響啤酒原有的風(fēng)味和口感。隨著對啤酒酵母細(xì)胞中谷胱甘肽代謝途徑研