超氧化物歧化酶在啤酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

超氧化物歧化酶在啤酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

超氧化物誘導(dǎo)酶（ec.1.1.1，super-sod）廣泛存在于生物中。這是目前科學(xué)研究中一套具有金屬元素的活性酶。1938年,Mann和Keilin首次從牛紅血球細(xì)胞中分離出SOD,1969年美國(guó)I.Fridovich教授和他的研究生McCoard再次發(fā)現(xiàn)了這種蛋白,并證實(shí)了其生物催化的酶活性,弄清了它催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì),并正式命名為超氧化物歧化酶。O2稱為超氧陰離子自由基,是生物體多種生理反應(yīng)的中間產(chǎn)物。它是活性氧的一種,氧化能力極強(qiáng),是生物氧毒害的重要因素之一。SOD具有特殊的生理活性,能清除生物體內(nèi)自由基。在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的有Cu、Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD和Ni-SOD,它們都可將O-2歧化為H2O2和O2,具有清除氧自由基的能力。SOD在啤酒生產(chǎn)中的研究及應(yīng)用在國(guó)外很早就有報(bào)道,國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道卻不多。大量研究證明,SOD對(duì)啤酒生產(chǎn)的全過(guò)程及成品啤酒的抗氧化都具有重要的作用。1糖酸氧合物和氧化劑的整合超氧化物歧化酶在啤酒生產(chǎn)中的研究開(kāi)始于對(duì)啤酒風(fēng)味老化問(wèn)題的處理。啤酒風(fēng)味的老化是氧自由基及其引起的一系列氧化還原反應(yīng)所造成的。早在上個(gè)世紀(jì)中葉,國(guó)外的釀酒師們就已經(jīng)認(rèn)識(shí)到啤酒的變質(zhì)是由于空氣的作用使啤酒發(fā)生了氧化。廖惟等關(guān)于氧原子的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中,在瓶裝啤酒的瓶頸空氣中引入18O2,經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的貯藏后,發(fā)現(xiàn)65%的18O原子被整合進(jìn)入多酚分子中,5%被整合進(jìn)入異α-酸的衍生物中,30%被整合進(jìn)入揮發(fā)性羰基化合物。這不僅證明了羰基化合物是成品啤酒與其風(fēng)味老化相關(guān)的最重要的一類物質(zhì),更證明了成品啤酒瓶中的溶解氧和瓶頸處的空氣促使了啤酒的氧化。后來(lái)人們?cè)谡麄€(gè)工藝流程上嚴(yán)格除氧:發(fā)酵罐和清酒罐及一切與酒液接觸的輔助罐的備壓用CO2或N2,硅藻土調(diào)漿用脫氧水,調(diào)漿罐內(nèi)覆蓋惰性氣體,酒頭要控制,酒液輸送要緩和,灌酒機(jī)酒缸的背壓用CO2,并經(jīng)數(shù)次抽真空,減少了瓶?jī)?nèi)氧氣等措施,使包裝酒的總氧含量在0.1mg/L以下。美國(guó)加州一家公司將能結(jié)合氧分子的類似血紅蛋白的物質(zhì)放入啤酒瓶蓋中,制出了防止啤酒氧化失鮮的瓶蓋。盡管工藝上采取了這些措施,啤酒的氧化仍然不可避免。人們開(kāi)始設(shè)想酒的氧化作用可能發(fā)生在制麥和糖化工序之前,形成的氧化風(fēng)味敗壞物質(zhì)(醛類)與其他酒的成分(二氧化硫等)形成了加合物而暫時(shí)被掩蓋起來(lái),并在發(fā)酵時(shí)避免了酵母的還原。包裝之后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),與醛類結(jié)合的SO2逐漸消失,醛類再度被游離出來(lái),使啤酒出現(xiàn)劣味。所以對(duì)啤酒風(fēng)味老化問(wèn)題的處理追溯到了啤酒生產(chǎn)的過(guò)程中。2啤酒中的氧自由基啤酒老化的關(guān)鍵因素是氧化,而氧化的根本則是氧。氧在啤酒生產(chǎn)工藝流程中一直處于一個(gè)尷尬的地位,它既有好的一面,又存在有害的一面。在啤酒生產(chǎn)的前期,氧對(duì)大麥的發(fā)芽是必需的;在啤酒發(fā)酵階段,氧又參與酵母的合成和細(xì)胞膜的維持,需要在麥汁中添加酵母時(shí)人為的充入氧。此外,氧還參與了多酚化合物的氧化和聚合,從而形成沉淀,有利于成品啤酒的澄清。另一方面,氧分子得到啤酒中某些物質(zhì)提供的一個(gè)電子之后形成超氧陰離子自由基(O-2),超氧陰離子自由基(O-2)再得到一個(gè)電子后形成過(guò)氧化物(O2?222-),O2?222-的pK值非常高,所以O(shè)2?222-形成后迅速形成過(guò)氧化氫(H2O2)。H2O2形成之后,在啤酒中Fe2+或Cu2+的催化下形成反應(yīng)活性最強(qiáng)的羥基自由基(·OH),這三種自由基是已知啤酒中最重要的氧自由基。超氧陰離子自由基(O-2)在啤酒釀造過(guò)程中的自氧化和酶的催化氧化反應(yīng)中也有生成,它具有比較強(qiáng)的生物毒性,少量的O-2便引起生物系統(tǒng)的破壞,還能導(dǎo)致酶的失活、酵母活性的下降、啤酒風(fēng)味成分(脂肪酸、氨基酸、多酚和異α-酸等)的敗壞、啤酒膠體穩(wěn)定性的下降等,更重要的是能產(chǎn)生羥基自由基(·OH),羥基自由基(·OH)更具有反應(yīng)活性和破壞力,更易與麥汁和啤酒中的氨基酸、酚類物質(zhì)、不飽和脂肪酸、高級(jí)醇和異律草酮等發(fā)生氧化反應(yīng),使其氧化和降解,產(chǎn)生羰基化合物和揮發(fā)性醛類化合物。大量的實(shí)驗(yàn)證明,羰基類化合物是影響啤酒風(fēng)味的最主要的物質(zhì),這些化合物也是造成啤酒老化的主要來(lái)源。既然無(wú)法避免氧的存在,那么可以從提高麥芽汁和啤酒的“內(nèi)源性”抗氧化能力方面下手,從根本上消除或阻斷氧自由基的形成,抑制或消除老化前體物質(zhì)。于是既能清除O-2又能消除其它更具有破壞性的羥基自由基(·OH)根源的超氧化物歧化酶(SOD),便成為了啤酒生產(chǎn)過(guò)程中的研究重點(diǎn)。3在麥芽和母體內(nèi)研究sod啤酒生產(chǎn)中SOD的主要來(lái)源兩個(gè)方面,一是制麥時(shí)麥芽產(chǎn)生的;二是啤酒酵母自身攜帶的。3.1麥芽中sod的變化Bamforth報(bào)道了啤酒生產(chǎn)中相關(guān)SOD的研究,報(bào)道指出大麥中有三種SOD的同功酶,起主要作用的是Cu、Zn-SOD,分子量為31,000～33,000Da。在浸麥和發(fā)芽過(guò)程中,SOD的活性增加,發(fā)芽結(jié)束時(shí)綠麥芽中SOD的酶活是原來(lái)大麥的5倍左右。同時(shí),Zielinski報(bào)道了油菜籽在發(fā)芽過(guò)程中SOD比活力呈上升趨勢(shì),發(fā)芽后的第六天達(dá)到最高水平,比未發(fā)芽的油菜籽的SOD比活力增加3倍左右,并且SOD比活力的變化與油菜籽中Cu、Mn的變化呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性,進(jìn)一步間接的表明SOD是一種金屬酶。在制麥過(guò)程中能顯著增加的SOD,大量的殘存與成品麥芽中,即使在焙焦結(jié)束時(shí),麥芽中仍有50%左右的SOD酶活殘存。大麥和麥芽中的SOD可以保護(hù)制麥階段和糖化開(kāi)始階段由氧自由基引起的破壞,這有利于保留麥汁的還原力,提高麥汁的內(nèi)源抗氧化力,從而提高啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性。3.2酵母合成sod的能力啤酒發(fā)酵時(shí)酵母的活細(xì)胞能利用胞內(nèi)的SOD保護(hù)自身免受O-2的毒害,增加了細(xì)胞活性。發(fā)酵過(guò)程中酵母細(xì)胞內(nèi)SOD的合成量呈先升高后降低的趨勢(shì),這與菌體的濃度和發(fā)酵液中氧的含量有很大的關(guān)系,發(fā)酵前期為好氧發(fā)酵,發(fā)酵液中的氧含量比較高,酵母的增殖速度較快,酵母合成SOD的能力亦隨之上升;發(fā)酵后期為厭氧發(fā)酵,此時(shí)的氧分壓極低,極大的限制了氧對(duì)酵母合成SOD的誘導(dǎo),從而使SOD的合成量逐漸降低。Clarkson也指出,氧是酵母合成SOD的重要影響因素。4sed在啤酒生產(chǎn)中的研究和應(yīng)用4.1浸漬時(shí)間對(duì)玉米萌發(fā)過(guò)程的影響在制麥階段,添加赤霉素可有效的提高麥芽中SOD酶活的增長(zhǎng)速度,但麥芽中SOD的合成總量影響并不大。于是,優(yōu)化制麥工藝條件便成了提高麥芽中SOD活性的重點(diǎn)。對(duì)此,孟德敬通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn),從浸麥溫度、浸麥時(shí)間、發(fā)芽溫度、浸麥水中、發(fā)芽時(shí)間、凋萎溫度、干燥溫度、焙焦溫度8個(gè)變量中分析出3個(gè)顯著因子:浸麥時(shí)間、發(fā)芽溫度、焙焦溫度。Eneje等人做了浸漬時(shí)間對(duì)玉米發(fā)芽特性的相關(guān)研究,指出合適的浸漬時(shí)間不僅有利于提高玉米的浸出率,而且更有利于發(fā)芽過(guò)程中酶系的形成。由此可見(jiàn),要想使發(fā)芽的谷粒中獲得較高的酶活,控制合適的浸麥時(shí)間顯得尤為重要。另一方面,發(fā)芽溫度和焙焦溫度有明顯的交互作用,當(dāng)發(fā)芽溫度和焙焦溫度的編碼在一定范圍時(shí),麥芽中SOD的活性大于2100U/g。因此,在工業(yè)上對(duì)麥芽中的SOD來(lái)說(shuō),控制合適的發(fā)芽溫度和焙焦溫度顯的特別重要。同時(shí)從麥芽的庫(kù)值、α-氨基氮、糖化力和β-葡聚糖含量看,普通制麥工藝下的麥芽與優(yōu)化制麥工藝下的麥芽相比無(wú)明顯的區(qū)別,說(shuō)明優(yōu)化后的制麥工藝對(duì)蛋白分解酶、淀粉分解酶和β-葡聚糖酶的活性沒(méi)有明顯的副作用。制麥結(jié)束后,由于焙焦過(guò)程使麥芽中SOD的酶活損失一半,但在成品麥芽的貯藏期間,SOD酶活卻有明顯的恢復(fù),并且較高的貯藏溫度有利于恢復(fù)的程度和速度,但是過(guò)高的貯藏溫度會(huì)造成水解酶系的過(guò)度增長(zhǎng)及蟲(chóng)害的發(fā)生,所以最適的溫度為25℃。此外,在貯藏期間SOD能抑制脂肪酸的氧化,從而阻止了腐臭味異味的產(chǎn)生。Michelson和Monod已成功地發(fā)明了一項(xiàng)SOD延遲蘋果汁、土豆和蘑菇腐敗變質(zhì)方面的專利。Bamforth報(bào)道了大豆中富有SOD,具有改善啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性、延長(zhǎng)啤酒保鮮期的潛力。4.2糖化過(guò)程中抗氧化能力的變化在糖化階段,麥芽自身的SOD,作為活性氧自由基(O-2)的清除劑,理論上可有效地降低氧自由基的危害和減少糖化過(guò)程中內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的氧化。不同的麥芽制得的協(xié)定麥汁的還原力相差較大,這種變化可能原因是糖化過(guò)程中多酚類、類黑精以及硫醇類物質(zhì)的復(fù)雜變化所引起,麥芽中SOD活性的差異可造成糖化過(guò)程(尤其是糖化初始階段)保護(hù)這些還原性物質(zhì)的程度不同,從而造成它們的氧化損失差異,最終體現(xiàn)在麥汁還原力的差別上。在糖化初始階段有效保護(hù)麥汁中還原性物質(zhì),可以獲得還原力較高的麥汁。而麥汁的還原力可作為一項(xiàng)重要的反映抗氧化能力強(qiáng)弱的指標(biāo),強(qiáng)的還原力一方面反映出麥汁具有較大的抗氧化能力;另一方面,還原力強(qiáng)的麥汁可以較好地減少煮沸時(shí)脂肪酸的氧化,減少反-2-壬烯醛的產(chǎn)生。另外研究表明,還原力高的麥汁啤酒的還原力較高,最終使得啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性好。在糖化過(guò)程中,SOD隨著時(shí)間的延長(zhǎng),酶活力漸漸減弱,對(duì)麥汁的保護(hù)作用逐漸下降。當(dāng)添加外源性SOD時(shí),明顯的抑制羰基化合物的生成,SOD可以有效地提高麥汁的內(nèi)源性抗氧化力。隨著糖化的進(jìn)行,糖化溫度不斷升高,在65℃糖化15min后大部分SOD失活,30min后SOD幾乎完全失活,此階段又是氧自由基氧化風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生風(fēng)味老化物質(zhì)的重要時(shí)期。因此,欲保護(hù)整個(gè)糖化的順利進(jìn)行,需在糖化時(shí)添加耐高溫的SOD。Bamforth報(bào)道了大豆中的SOD,在72℃保溫1h后有20%的SOD活性保留,91℃保溫1h后仍有少量的SOD活性,可以在糖化全程保持麥汁的還原力、減少自由基對(duì)麥汁和啤酒質(zhì)量的影響。4.3酵母細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)在發(fā)酵階段,向發(fā)酵液中添加外源性SOD有助于酵母細(xì)胞內(nèi)SOD的合成。研究表明,發(fā)酵后期氧分壓的降低會(huì)導(dǎo)致O-2的生成,O-2會(huì)對(duì)酵母菌產(chǎn)生危害,不僅引起酵母活力下降,而且還導(dǎo)致胞內(nèi)氧化還原酶的合成能力下降。而添加外源性SOD可有效清除O-2,若同時(shí)添加過(guò)氧化氫酶(EC1.11.1.6,Catalase,CAT),SOD和CAT的協(xié)同作用不僅可清除O-2,而且還能阻斷更具有破壞性和反應(yīng)性的羥基自由基的形成,從而減少了活性氧對(duì)酵母的危害、保護(hù)酵母細(xì)胞的SOD合成能力。此外,向酵母液中添加外源性SOD也可以提高酵母細(xì)胞的增長(zhǎng)速度以及酵母細(xì)胞自身的活力。由于外源性SOD的存在增加了酵母細(xì)胞的活力,使其增殖速度加快,降糖速度加快,對(duì)糖的利用率提高,所以外源性SOD可以提高發(fā)酵度。同時(shí),由于SOD和CAT的協(xié)同作用有效地清除了發(fā)酵液中強(qiáng)氧化性的氧自由基,降低了發(fā)酵液中還原性成分(酚類物質(zhì)、不飽和脂肪酸等)受氧自由基的破壞,從而更有效地保留了還原性物質(zhì),增加發(fā)酵液的還原力。在成品啤酒中,外源性SOD的加入明顯減少了成品啤酒中的羰基化合物的含量,同時(shí)增加了成品啤酒的內(nèi)源性抗氧化能力,可以顯著地提高成品啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性。5現(xiàn)代化育種技術(shù)的應(yīng)用目前已知,不管是內(nèi)源性SOD還是外源性SOD,在啤酒生產(chǎn)的全程都具有重要的作用,同時(shí),相應(yīng)的問(wèn)題也存在:首先,商品化的SOD成本較高,尤其是較高純度的SOD更是昂貴,這使得外源性SOD在工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用受到很大的限制,因此,尋找更為經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的SOD來(lái)源從而更好地實(shí)現(xiàn)其工業(yè)價(jià)值;其次,提高外源性SOD的酶活性及其特異性(例如耐熱性),以便于使其在